蝴蝶蘭PhalPI基因的克隆及在花器官突變體中的表達(dá)分析

袁秀云 許申平 王瑩博 崔 波*

(1.鄭州師范學(xué)院生物工程研究所，鄭州 450044； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002)

蝴蝶蘭PhalPI基因的克隆及在花器官突變體中的表達(dá)分析

袁秀云1許申平1王瑩博2崔 波1*

(1.鄭州師范學(xué)院生物工程研究所，鄭州 450044；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002)

為深入研究蘭科植物花器官發(fā)育的調(diào)控機理，從蝴蝶蘭花瓣中克隆了一個B類MADS-box轉(zhuǎn)錄因子PhalPI(GenBank登錄號為KY020416)。序列分析表明，該基因的cDNA全長為944 bp，含完整的開放閱讀框，可編碼210個氨基酸，屬于BGLO/PI蛋白家族，與蝴蝶蘭屬的PhPI10和PeMADS6基因關(guān)系最近；表達(dá)模式分析表明，PhalPI基因在生殖器官中表達(dá)，在營養(yǎng)器官中不表達(dá)，在授粉后的子房中，該基因的表達(dá)水平降低。在5種花器官突變體中，PhalPI基因在萼片唇瓣化突變體的萼片和蕊柱中表達(dá)水平明顯升高；在雄蕊花瓣化突變體的萼片和側(cè)瓣中表達(dá)水平降低，在其唇瓣和蕊柱中顯著升高；在側(cè)瓣合柱化突變體的蕊柱中，PhalPI基因的表達(dá)也發(fā)生了顯著升高；PhalPI基因表達(dá)的改變與花器官形態(tài)的突變相關(guān)；而在側(cè)瓣唇瓣化和側(cè)瓣花藥化突變體中，PhalPI基因的表達(dá)水平?jīng)]有變化。推測該基因在決定蝴蝶蘭側(cè)瓣和唇瓣的發(fā)育中起重要的調(diào)控作用。

蝴蝶蘭；GLO/PI；MADS-box；花器官突變體

花器官的發(fā)育是高等植物發(fā)育過程中特別重要的過程，也是人們一直研究的熱點。根據(jù)對雙子葉模式植物如擬南芥、矮牽牛和金魚草的研究，花器官發(fā)育的分子調(diào)控從最初的“ABC模型”理論逐步發(fā)展到了“ABCDE模型”理論[1～2]。由于調(diào)控花器官發(fā)育的同源基因隨著植物的系統(tǒng)演化，其結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了一系列復(fù)雜的亞功能和新功能，進而影響了花器官的發(fā)育，賦予花器官形態(tài)的多樣性[3～4]，因此花器官發(fā)育的調(diào)控理論既有普遍性又有特殊性。單子葉植物花的發(fā)育不同于雙子葉植物，一些單子葉植物花的發(fā)育并不能用“ABCDE模型”解釋[5]。廣泛開展對單子葉植物花器官性狀發(fā)育的分子調(diào)控機制研究,對于揭示高等植物花器官多樣性的演化及植物的系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義。

蘭科植物作為單子葉植物中較為進化的類群，其花器官有獨有的特征，既有典型的花被輪狀排列，花萼和花瓣呈2輪，又有獨特的形態(tài)和結(jié)構(gòu)：其中萼片的大小和顏色與花瓣相似；1枚花瓣特化為唇瓣，具有多樣的形狀；子房下位，呈明顯的180°的扭轉(zhuǎn)；雌蕊和雄蕊合生為合蕊柱；花藥團塊狀等，這些性狀被認(rèn)為是植物演化過程中進化的表現(xiàn)。通過對蘭花MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的研究，蘭科植物也具有A、B、C、D和E類基因[6]，這些基因在蝴蝶蘭花器官中具有特殊的表達(dá)模式[7]，其中B類基因在其花器官發(fā)育中起著重要作用[8～9]。B類基因有DEFICIENS(DEF)/APETALA3(AP3)-like家族和GLOBOSA(GLO)/PISTILLATA(PI)-like 2個家族，這些基因只在生殖器官中表達(dá)，在營養(yǎng)器官中不表達(dá)[6,10]；蘭科植物的DEF/AP3-like有4個分支的同源基因，GLO/PI-like有2個分支的同源基因，這些分支基因的不同組合及差異表達(dá)決定了多樣的花被形態(tài)[12]，如PI和AP3B分支決定花萼的發(fā)育，PI、AP3A1和AP3B分支決定花瓣側(cè)瓣的發(fā)育，PI和AP3A分支決定唇瓣的發(fā)育[11]。因此，蘭花花器官發(fā)育的分子調(diào)控有“蘭花密碼”(Orchid Code)模型及修正的“Orchid Code”模型[12～13]，這些理論的提出表明，蘭科植物花器官發(fā)育的調(diào)控具有更加復(fù)雜的機制，而這些發(fā)現(xiàn)無疑是對傳統(tǒng)的“ABC模型”的有益補充和完善。

本研究以蝴蝶蘭花瓣為材料，采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了一個B類基因PhalPI，利用實時熒光定量PCR方法分析了該基因在在“萼片唇瓣化”、“側(cè)瓣唇化”、“雄蕊瓣化”、“側(cè)瓣合柱化”、“側(cè)瓣花藥化”5類變異花器官和正?；ㄆ鞴僦械谋磉_(dá)，旨在詳細(xì)分析B類基因在花器官決定中的調(diào)控作用，為豐富和完善高等植物的開花調(diào)控理論提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以蝴蝶蘭品種‘內(nèi)山姑娘’及其雄蕊瓣化變異株、‘婚宴’及其側(cè)瓣合柱化變異株、‘S1024’及其萼片唇瓣化變異株、‘火鳥’及其側(cè)瓣唇瓣化變異株、‘富樂夕陽’及其側(cè)瓣花藥化變異株均來自鄭州師范學(xué)院蘭花工程中心智能溫室，突變株由大量無性繁殖的種苗中獲得(圖1)。分別取正常株和變異株花器官的萼片、側(cè)瓣、唇瓣、蕊柱，另取‘富樂夕陽’植株營養(yǎng)期、抽葶期、開花期和授粉后(10 d)等不同發(fā)育時期的葉片、根和花葶，每個樣品取3個重復(fù)，取樣后迅速用液氮速凍，于-80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

組織總RNA用RNAprep Pure Plant Kit(天根)提取，具體方法參照說明書進行。提取的RNA分別通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀判斷其完整性、濃度和純度。

1.2.2 蝴蝶蘭PhalPI基因全長的克隆及序列分析

以蝴蝶蘭品種‘富樂夕陽’花瓣的總RNA為模板，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)NCBI登錄的B類MADS-box基因序列設(shè)計簡并引物PI-F和PI-R(表1)，用于擴增B類MADS基因的中間保守片段，PCR擴增體系為20 μL，含10×buffer 2 μL，4種dNTP各150 μmol·L-1，每條引物0.5 μmol·L-1，cDNA模板1 000～2 000 ng，TaqDNA聚合酶1 U。PCR擴增程序為：95℃變性3 min；95℃ 35 s，58℃ 35 s，72℃ 35 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min?；厥漳康钠危B接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，進行克隆和測序。根據(jù)得到的中間片段序列，設(shè)計1對3′端特異引物GSP3-1和GSP3-2，1對5′端特異引物GPS5-1和GPS5-2(表1)，利用SMARTTM RACE Amplification kit(Clontech)進行擴增，回收擴增產(chǎn)物，克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，鑒定后進行測序。將5′和3′RACE得到的序列與中間片段進行拼接，并根據(jù)拼接的序列設(shè)計1對引物PI-ORFF和PI-ORRR，進行開放閱讀框(ORF)的擴增和測序驗證。引物合成和測序由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成?；蛐蛄械耐葱苑治鲈贜CBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)上進行，蛋白結(jié)構(gòu)域在NCBI的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)中搜索，使用MEGA軟件NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 蝴蝶蘭PhalPI基因的表達(dá)分析

組織材料總RNA用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因的全長設(shè)計1對特異引物qPI-F和qPI-R，產(chǎn)物長度211 bp，以Actin(JN185655)為內(nèi)參基因，引物為Act-F和Act-R(表1)。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ kit(TaKaRa)進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：95℃ 1 min，接著95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 15 s(40個循環(huán))。反應(yīng)在熒光定量PCR儀(Eppendorf)上進行，3次重復(fù)。引物特異性分別通過溶解曲線分析并測序驗證，相對表達(dá)量按照2-ΔΔct法計算，PhalPI基因在突變中的表達(dá)差異通過SPSS 17.0軟件進行分析。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 PhalPI基因全長的克隆

不同組織材料總RNA提取通過凝膠電泳如圖28S和18S區(qū)分明顯，28S亮度大約是18S的2倍(圖2)。核酸蛋白分析儀測定顯示，這些RNA的OD260/OD280的值在1.87～2.06，濃度在180 ng·μL-1以上，說明所提RNA比較完整，濃度及純度可以滿足后續(xù)的實驗和分析。

圖2 部分材料的總RNA提取Fig.2 Total RNA extraction of several materials

以蝴蝶蘭花瓣的cDNA為模板，以簡并引物PI-F和PI-R進行保守片段的PCR擴增，得到1個398 bp保守片段(圖3A)，此片段經(jīng)Blastn分析，該片段為MADS-box蛋白基因。根據(jù)該片段序列，采用RACE技術(shù)，利用GSP3-1和GSP3-2引物擴增獲得3′端目的片段為339 bp(圖3B)，利用GSP5-1和GSP5-2引物擴增獲得5′端目的片段為425 bp(圖3C)。將保守片段、3′和5′端序列拼接，在開放閱讀框區(qū)域設(shè)計引物，進行擴增驗證，得到了預(yù)期633 bp的片段(圖3D)，最終拼接得到944 bp的基因cDNA全長。該具有完整的開放閱讀框。其中包含95 bp的5′-UTR、633 bp開放閱讀框和215 bp的3′-UTR，編碼210個氨基酸。將其命名為PhalPI，提交GenBank，登錄號為KY020416。

圖3 PhalPI基因的克隆 A.保守片段擴增；B. 3′RACE；C. 5′RACE；D. ORF片段擴增 1.保守片段；2. 3′端片段；3. 5′端片段；4. ORF片段；M. DL2000 markerFig.3 The cloning of PhalPI A.Amplification of conservative fragment; B. 3′RACE; C. 5′RACE; D. ORF fragment 1.Conservative fragment; 2. 3′RACE; 3. 5′RACE; 4. ORF fragment; M. DL2000 marker

2.2PhalPI基因編碼氨基酸序列的比對及其進化樹分析

PhalPI基因編碼的氨基酸序列通過Blastp分析，發(fā)現(xiàn)與其它植物的PI-like蛋白具有75%以上的一致性，其中與小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)的PeMADS6(AAV83997)和蝴蝶蘭雜交種(Phalaenopsishybrida)的PhPI10(AAV28490)有98%的一致性。該蛋白包含一個MADS結(jié)構(gòu)域，一個K-box區(qū)和一個PI基序(圖4)，說明該基因是B類轉(zhuǎn)錄因子PI基因。在NCBI的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫中的搜索顯示，該蛋白具有MADS-MEF2-like和K-box結(jié)構(gòu)域，在蛋白的N-端具有DNA結(jié)合位點、假定的磷酸化位點和二聚化結(jié)合界面等結(jié)構(gòu)，屬于MADS和K-box超家族成員(圖5)。

圖4 PhalPI基因的氨基酸序列與同源序列的比對 方框區(qū)域分別代表MADS區(qū)、K區(qū)和PI結(jié)構(gòu)基序。Fig.4 Aligment of PhalPI amino sequence with other Homologous proteins The boxes are MADS domain,K region and PI motif respectively

圖5 PhalPI基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域Fig.5 Domain of the PhalPI protein

為更好地了解蝴蝶蘭該PhalPI蛋白與其它MADS-box基因之間的進化關(guān)系，選取與PhalPI蛋白一致性高的PI-like蛋白和有代表性的MADS-box蛋白構(gòu)建進化樹。從圖6可以看出，所分析的MADS-box蛋白中，有2個大的分支，B類為一個分支，A、C、D和E類為另一個分支，B類中又有GLO/PI和DEF/AP3 2個分支，其中擬南芥(Arabidopsisthaliana)的AP3、金魚草(Antirrhinummajus)的DEFA、小蘭嶼蝴蝶蘭的PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4和PeMADS5為DEF/AP3類，而紅門蘭(Orchisitalica)的OrcPI2、球莖石槲(Dendrobiumthyrsiflorum)的DthyrPI、文心蘭(Oncidiumhybrida)的OncPI、小蘭嶼蝴蝶蘭的PeMADS6、蝴蝶蘭品種的PhPI10、PhalPI、番紅花(Crocussativus)的CsatPIC1、水稻(Oryzasativa)的MADS4、金魚草的GLO和擬南芥的PISTILLATA(PI)為GLO/PI類?？梢钥闯鲈诿總€分支中單子葉植物和雙子葉植物的B類MADS-box蛋白區(qū)分明顯；本研究中的PhalPI蛋白屬于GLO/PI類，與蘭科植物的GLO/PI類蛋白在一個分支上，并且與蝴蝶蘭品種的PhPI10和小蘭嶼蝴蝶蘭的PeMADS6關(guān)系最近(圖6)。

圖6 PhalPI蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree of PhalPI protein with known B class MADS-box protein

圖7 PhalPI基因在蝴蝶蘭發(fā)育過程中不同組織中的表達(dá) VS.營養(yǎng)期；SE.抽葶期；FF.盛花期；AP.授粉后；Se.萼片；Pe.側(cè)瓣；Lp.唇瓣；Co.蕊柱；Ov.子房；AP-Ov.授粉后子房Fig.7 The expression of PhalPI in different tissues during development VS. Vegetative stage; SE. Spike emergence; FF. Full flowering; AP. After pollination; Se. Sepal; Pe. Petal; Lp. Lip; Co. Column; Ov. Ovary; AP-Ov. Ovary of after pollination

圖8 PhPI-like基因在蝴蝶蘭花器官突變體中的表達(dá)A.‘S1024’;B.‘內(nèi)山姑娘’;C.‘火鳥’;D.‘婚宴’;E.‘富樂夕陽’ *表示差異顯著Fig.8 The expression of PhPI-like in floral organ mutants of PhalaenopsisA. ‘S1024’; B. ‘Nei Shan Gu Niang’; C.‘Huo Niao’; D.‘Hun Yan’; E.‘Fu Le Xi Yang’ * indicate significant difference

2.3 PhalPI基因的表達(dá)分析

為了研究PhalPI基因在蝴蝶蘭器官建成中的功能，分析了其在發(fā)育過程中不同組織及5種變異花器官中的表達(dá)特性。結(jié)果表明，PhalPI基因主要生殖器官中表達(dá)，在營養(yǎng)器官幾乎不表達(dá)；在花瓣、唇瓣和蕊柱中表達(dá)較高，而在花萼和子房中表達(dá)較低；授粉后子房中的表達(dá)量降低；在花葶中有微量表達(dá)(圖7)。

5種變異花器官包括：‘S1024’下面兩側(cè)的萼片明顯變異為唇瓣；‘內(nèi)山姑娘’雄蕊瓣化的變異，其與正?；ㄖ饕膮^(qū)別是蕊柱兩側(cè)的雄蕊變異為花瓣狀；‘火鳥’的側(cè)瓣完全變異為唇瓣；‘婚宴’花器官的變異除了花明顯變小、萼片和花瓣較小外，主要是側(cè)瓣退化并與蕊柱合生；‘富樂夕陽’的花除了兩側(cè)萼片顏色有變化，主要的變異為側(cè)瓣變得狹窄，頂端具有花藥(圖1)。PhalPI基因在5種花器官突變體中的表達(dá)分析表明，在萼片唇瓣化突變體中，PhalPI基因在側(cè)瓣和唇瓣中的表達(dá)水平與正常花相比無明顯改變，而在側(cè)萼和蕊柱的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)(圖8A)；在雄蕊瓣化的突變體中，PhalPI基因在萼片和側(cè)瓣中的表達(dá)水平明顯下降，而在唇瓣和蕊柱中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)(圖8B)；在側(cè)瓣唇瓣化和側(cè)瓣花藥化突變體中，PhalPI基因在各輪花器官中的表達(dá)量沒有顯著改變(圖8C,E)；在側(cè)瓣合柱化突變體中，PhalPI基因在萼片、側(cè)瓣和唇瓣中的表達(dá)水平與正?；ㄏ啾葲]有顯著差異，而在蕊柱中顯著升高(P<0.01)(圖8D)。這些結(jié)果表明，在側(cè)萼唇瓣化、雄蕊花瓣化和側(cè)瓣合柱化突變體中，PhalPI基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，推測PhalPI基因在決定側(cè)瓣和唇瓣的發(fā)育中起重要作用。

3 討論

B類基因是種子植物中一個古老的MADS-box家族基因[14]，在擬南芥、金魚草等模式植物中，AP3和PI基因具有典型的決定花瓣和雄蕊的發(fā)育的功能[15]，是典型的“ABC模型”調(diào)控模式，其同源基因的表達(dá)在基部被子植物中擴展到花被、雄蕊和心皮[16]，一些單子葉植物如百合和郁金香的B類基因也在花器官的外面3輪表達(dá)，這些表達(dá)模式支持“修正的ABC模型”[5]，然而隨著植物的進化，發(fā)生了許多基因復(fù)制事件，再經(jīng)過基因的選擇和純化使其典型的功能得以演化[17～19]。因此，B基因?qū)ㄆ鞴侔l(fā)育的調(diào)控功能發(fā)生了微妙的變化。既是在同一種植物的不同花器官中表達(dá)特性也不相同。例如，番木瓜(Caricapapaya)的CpPI基因在營養(yǎng)器官中不表達(dá)，在花器官中表達(dá)，這是該類基因的原有的表達(dá)特點，但在兩性花和雌花的花萼和花瓣中表達(dá)，雄蕊和心皮中不表達(dá)，在雄花的花瓣和花藥中表達(dá)，萼片和心皮中不表達(dá)，這是該類基因功能演化的結(jié)果[20]。在單子葉植物中，B類基因的表達(dá)更為復(fù)雜，有的B類基因在花器官第1輪不表達(dá)，而有的B類基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控拓展到第4輪[5]。

在蘭科植物，其花型、花色多樣，體現(xiàn)了花器官的高度進化，B類基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄差異作為一種積極的演化策略在花器官發(fā)育調(diào)控中扮演著重要角色[21～23]，B類基因不同的表達(dá)模式，在蘭花的形態(tài)決定中發(fā)揮獨特的調(diào)控作用[24～25]。蝴蝶蘭B類基因(PeMADS2-PeMADS6)及與其它轉(zhuǎn)錄因子如AP1/AGL9和AGL6等多樣的互作復(fù)合體使調(diào)控模式更加復(fù)雜化[26]，而E類基因(PeSEPs)也與B、C和D類基因構(gòu)成更為復(fù)雜的蛋白復(fù)合體參與花器官的建成[27]，因此提出了“同源性蘭花花被”(Homeotic Orchid Tepal)模型，這個模型認(rèn)為，所有B類MADS-box基因成員在蘭花花被早期花組織原基階段出現(xiàn)，而與其它MADS-box基因組成復(fù)合體在晚期的花原基和花芽中具有不同的表達(dá)特性，決定了花器官各輪組織的發(fā)生[11]。

研究表明蝴蝶蘭的PeMADS6是一個GLO/PI基因，在生殖器官中表達(dá)，與蘭花的超長花期和子房發(fā)育有關(guān)[28]。蝴蝶蘭的PhPI15只在花器官中表達(dá)，在營養(yǎng)器官中不表達(dá)[29]，PhPI10的表達(dá)僅限于唇瓣[15]。紅門蘭中有2個PI基因OrcPI和OrcPI2，在花器官中OrcPI2的表達(dá)水平明顯高于OrcPI1，二者在未成熟花和成熟花中表達(dá)模式不同，但具有相似的表達(dá)趨勢，即在未成熟花中，二者都在花萼、側(cè)瓣和唇瓣中表達(dá)，側(cè)瓣中的表達(dá)量最高，在蕊柱中有微量表達(dá)；而在成熟花中只在唇瓣中的表達(dá)量最高，在萼片和側(cè)瓣中表達(dá)水平較低，在蕊柱中幾乎不表達(dá)；在子房發(fā)育過程中，未成熟花的子房中OrcPI和OrcPI2的表達(dá)均較低，成熟花未授粉的子房中表達(dá)水平較高，而在授粉后的子房中表達(dá)水平明顯降低，在子房中的表達(dá)模式與PeMADS6相似[30]。文心蘭一個PI基因OMADS8在營養(yǎng)器官和花器官中都表達(dá)[24]，OMADS8可與一個AP3基因OMADS3構(gòu)成異源二聚體參與文心蘭萼片、側(cè)瓣和唇瓣的發(fā)育[32]。對木石斛的花器官決定基因的研究發(fā)現(xiàn)，木石斛和擬南芥的B和C類基因有一定的保守型，其PI基因DcOPI與AP3類基因構(gòu)成二聚體，導(dǎo)致蘭花器官的個體發(fā)生[32]。

本研究獲得的蝴蝶蘭PhalPI基因與PhPI10和PeMADS6關(guān)系最近，其在蝴蝶蘭發(fā)育過程中不同組織中的表達(dá)模式與PeMADS6相似[28]，即PhalPI主要在生殖器官中表達(dá)，在營養(yǎng)器官中幾乎不表達(dá)；在授粉后的子房中表達(dá)量降低，但是又與PhPI10在唇瓣中表達(dá)不同[10]。在花器官突變體中的表達(dá)分析表明，當(dāng)萼片演化為唇瓣時，該基因在萼片中和蕊柱中的表達(dá)升高，萼片中PhalPI基因表達(dá)水平的升高與萼片唇瓣化直接相關(guān)，而蕊柱中PhalPI基因表達(dá)水平的升高與形態(tài)無相關(guān)性，說明該基因參與唇瓣的發(fā)育調(diào)控；當(dāng)雄蕊演化為花瓣時，唇瓣和蕊柱中的PhalPI表達(dá)水平顯著升高，說明該基因在決定側(cè)瓣和唇瓣的發(fā)育調(diào)控中起重要作用；在側(cè)瓣退化與蕊柱合生的突變體花器官中，蕊柱中的表達(dá)水平也升高，進一步說明PhalPI基因參與側(cè)瓣的發(fā)育調(diào)控，因此推測該基因主要參與花器官第2輪(側(cè)瓣和唇瓣)的發(fā)育調(diào)控；而當(dāng)側(cè)瓣演化為唇瓣和側(cè)瓣頂端長出花藥時，該基因的表達(dá)無明顯差異。說明這兩種突變與PhalPI基因的表達(dá)無關(guān)，推測可能與其它基因的參與相關(guān)。據(jù)報道，蝴蝶蘭的一個C類(PeMADS1)和D類(PeMADS7)基因在E類基因的作用下構(gòu)成同源或異源二聚體，調(diào)控了側(cè)瓣雄化變異的發(fā)育[33]。蝴蝶蘭花器官突變體的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，蝴蝶蘭的PhAGL6a、PhAGL6b、PhMADS1、PhMADS4、PhMADS5在唇瓣化的側(cè)瓣中表達(dá)上調(diào)，PhAGL6a、PhAGL6b和PhMADS4基因在唇瓣的發(fā)育起決定性作用[34]。這些結(jié)果表明，蘭花花器官的形態(tài)建成具有多個基因復(fù)雜的調(diào)控機制，深入發(fā)掘其調(diào)控基因及其分子機制，一方面能進一步補充和完善高等植物花器官的發(fā)育調(diào)控理論，另一方面為蘭花花器官形態(tài)多樣性的遺傳改良提供依據(jù)。

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Science and technology research projects of Henan Province(162102110073)

introduction：YUAN Xiu-Yun(1970—),female,Dr.,professor,Mainly engaged in the study of plant biotechnology.

date:2016-11-08

CloningofPhalPIGenefromPhalaenopsisandItsExpressioninFloralOrganMutants

YUAN Xiu-Yun1XU Shen-Ping1WANG Ying-Bo2CUI Bo1*

(1.Institute of Bioengineering,Zhengzhou Normal University,Zhengzhou 450044；2.College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002)

For the regulatory mechanism of floral organ development in orchid,PhalPIgene(GenBank accession number: KY020416) was cloned fromPhalaenopsispetals. By the sequence analysis, the cDNA full-length of this gene was 944 bp encoding 210 amino acid residues. The gene belongs to the GLO/PI group of the B class MADS-box transcription factor, which was highly identified with PhPI10 and PeMADS6 fromPhalaenopsis. ThePhalPIwas expressed in reproductive organs and not in vegetative organs, the expression level was reduced in ovary after pollination. In 5 floral organ mutants, the expression level of thePhalPIgene was higher significantly in sepal and column of lip-like sepal mutants than that of the normal. The expression of this gene was decreased in sepals and petals in petal-like stamens mutant, and it was increased significantly in lip and column in this mutant. In column of Lateral petals pillared mutants, the expression ofPhalPIgene was also increased significantly. The changes of expression level of thePhalPIgene in 3 floral organ mutants were associated with morphological mutations of floral organ. However, the expression levels ofPhalPIgene were not changed in lip-like Lateral petals and anther-like Lateral petals mutants. Therefore, thePhalPIgene plays a crucial role in regulating Lateral petal and lip development inPhalaenopsis.

Phalaenopsis;GLO/PI;MADS-box;floral organ mutants

河南省科技攻關(guān)項目(162102110073)

袁秀云(1970—)，女，博士，教授，主要從事植物生物技術(shù)方面的研究。

* 通信作者：E-mail:laocuibo@163.com

2016-11-08

* Corresponding author：E-mail:laocuibo@163.com

S682.31

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.03.012