趙益菲，布冠好，陳復(fù)生

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

熱處理對β-伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)及免疫活性的影響

趙益菲，布冠好*，陳復(fù)生

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

以脫脂豆粉為原料，利用堿溶酸沉法分離提取β-伴大豆球蛋白，采用間接競爭ELISA法測定不同溫度、加熱時(shí)間、反應(yīng)濃度下β-伴大豆球蛋白的抗原性變化，并對熱處理后產(chǎn)物的溶解度、免疫原性及結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：熱處理能顯著影響β-伴大豆球蛋白的抗原性。熱處理后，樣品蛋白的溶解度隨溫度升高呈先上升后下降的趨勢。免疫印跡結(jié)果顯示：熱處理后β-伴大豆球蛋白的免疫原性有一定程度的降低，但不能完全消除。傅里葉紅外光譜結(jié)果表明：熱處理之后樣品蛋白中的α-螺旋和β-折疊的含量減少，β-轉(zhuǎn)角含量和無規(guī)則卷曲含量增加。

β-伴大豆球蛋白；熱處理；抗原性；結(jié)構(gòu)

0 前言

大豆是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源之一，其營養(yǎng)成分豐富，含有人體難以合成的8種必需氨基酸。大豆蛋白消化率與動(dòng)物蛋白相近，價(jià)格卻明顯低于動(dòng)物蛋白，所以其需求量以每年10%～15%的速度遞增[1-2]。在西方國家，以大豆為原料的食品因其營養(yǎng)豐富且健康已經(jīng)得到普及[3]。然而，大豆是八大過敏食物原之一，約有0.5%的普通人群對大豆制品過敏[4]。目前已經(jīng)有34種IgE介導(dǎo)的致敏性蛋白被發(fā)現(xiàn)[5]，其中兩種儲(chǔ)藏蛋白（β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白）被認(rèn)為是主要的致敏性蛋白[6-7]。β-伴大豆球蛋白是分子質(zhì)量為180 kDa的糖蛋白，含糖量在 5%左右[8]，由 α'（76 kDa）、α（72 kDa）和 β（53 kDa）3 種亞基構(gòu)成，等電點(diǎn)分別為 4.9、5.18、5.66～6.00[9-10]。對大豆易過敏的消費(fèi)者必須避免攝入大豆和其衍生產(chǎn)品，但是由于其用途廣泛，避免攝入大豆及豆制品難度較大。因此，如何降低或消除大豆蛋白過敏原具有重要的實(shí)際意義。

熱處理是一種常見的食品加工方式，在加熱過程中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開、交聯(lián)或聚合，其中的二硫鍵斷裂，從而在一定程度上使構(gòu)象發(fā)生改變；另外，加熱還會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的共價(jià)或非共價(jià)相互作用。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)導(dǎo)致其抗原表位的暴露或掩蓋，從而使蛋白質(zhì)的抗原性及過敏原性發(fā)生改變。Kasera等[11]探討了熱處理對花生蛋白致敏性的影響，經(jīng)煮沸，花生可溶性蛋白的特異性IgE結(jié)合降低了62%，不溶性蛋白組分的IgE結(jié)合降低了4%，從而得出熱處理能夠降低花生過敏蛋白的致敏性。史曉霞等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，加熱處理（70～100 ℃，20～120 min）使卵類黏蛋白的過敏原性降低，且隨加熱溫度升高和加熱時(shí)間的延長，其過敏原性不斷下降。此外，該研究通過光譜分析表明卵類黏蛋白的構(gòu)象改變導(dǎo)致其過敏原性變化。

目前，關(guān)于熱處理對β-伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)及免疫活性的影響研究較少。因此，作者以脫脂豆粉為原料，利用堿溶酸沉法提取β-伴大豆球蛋白。采用不同的溫度和時(shí)間組合，對β-伴大豆球蛋白進(jìn)行熱處理，利用酶聯(lián)免疫學(xué)方法及免疫印跡法對β-伴大豆球蛋白的免疫活性進(jìn)行定性和定量分析，研究熱處理對β-伴大豆球蛋白溶解度及結(jié)構(gòu)特性的影響，以期為食品加工過程中選擇合適的熱處理?xiàng)l件來降低大豆蛋白致敏性提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂大豆粉（蛋白含量52.36%）：河南省鯤華生物技術(shù)有限公司；牛血清蛋白（BSA）、TMB單組分顯色液：北京索萊寶科技有限公司；β-伴大豆球蛋白標(biāo)準(zhǔn)抗原（β-conglycinin，G3171）、酶標(biāo)二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG，A6154）：Sigma公司；凝膠配制試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；其他試劑均為市售分析純。

LGJ-18高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；pH計(jì)：意大利HANNA；ZW-A微量振蕩器、HH-S6油浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DYY-6D型電泳儀：北京市六一儀器廠；Multiskan FC酶標(biāo)儀：賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 β-伴大豆球蛋白的提取

參考傳統(tǒng)Thanh法[13]提取β-伴大豆球蛋白，再根據(jù)Liu等[14]和宋佳[15]的方法對其進(jìn)行優(yōu)化。室溫下，脫脂大豆粉用pH 8.5的0.03 mol/L的Tris-HCl溶液浸提， 料液比為 1∶15，45℃下攪拌 1 h后，高速冷凍離心機(jī)控溫4℃，10 000 r/min離心20 min，取上清液。然后上清液中加入0.01 mol/L NaHSO3，5 mmol/L CaCl2，調(diào)節(jié) pH 至 6.4，4 ℃冷沉過夜。10 000 r/min離心20 min，將沉淀物和上清液分離。將上清液調(diào)到pH 5.5，攪拌1 h，10 000 r/min離心20 min，取上清液，兩倍體積冰水稀釋上清液，攪拌1 h，調(diào)pH 至4.8，10 000 r/min離心20 min，收集沉淀并溶于0.03 mol/L的Tris-HCl緩沖液中，調(diào)pH到7.0，得到β-伴大豆球蛋白，4℃透析2 d，每3 h換1次水，冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 β-伴大豆球蛋白的熱處理

將提取的β-伴大豆球蛋白用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)稀釋至設(shè)定的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，裝入密封的安瓿瓶中。溫度設(shè)置為40～140℃，其中40～80℃是在水浴鍋中加熱，100～140℃是在油浴鍋中加熱。熱處理之后，分析β-伴大豆球蛋白的溶解度、免疫活性及結(jié)構(gòu)。

1.2.3 β-伴大豆球蛋白溶解度的測定

參考Kato等[16]的方法并做一定改動(dòng)。稱取一定量熱處理后的β-伴大豆球蛋白樣品溶于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，質(zhì)量濃度為5 mg/mL，對其進(jìn)行熱處理之后，取蛋白溶液5 mL，4℃下10 000 r/min離心20 min，取上清液，測其蛋白濃度，蛋白濃度以280 nm處的吸光度值表示。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白濃度占相應(yīng)的總蛋白濃度的百分比。

1.2.4 間接競爭ELISA測定蛋白的抗原性

具體方法參考文獻(xiàn)[17]。

1.2.5 β-伴大豆球蛋白的免疫原性的檢測

采用Western-Blot分析大豆主要抗原蛋白的免疫原性。將熱處理后的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳之后，用硝酸纖維素膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后37℃下封閉1 h；漂洗干凈后，4℃一抗孵育硝酸纖維素膜18 h，二抗室溫孵育膜1 h，最后進(jìn)行膜顯色。觀察顯色情況，收集圖像進(jìn)行免疫原性的分析。

1.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

將熱處理后的蛋白質(zhì)配制成2 mg/mL溶液，然后與上樣緩沖液按1∶1的比例混合均勻。將樣品液置于沸水浴中煮沸4 min，使蛋白變性。取標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白10 μL，用微量進(jìn)樣器進(jìn)樣，樣品進(jìn)樣量為10 μL。在電泳外槽中加入電極緩沖液，接通電源，進(jìn)行電泳。

1.2.7 傅里葉紅外光譜分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

稱取2 mg熱處理樣品，按照1∶100的比例加入溴化鉀，研磨成均勻粉末，壓成透明薄片。設(shè)定傅里葉紅外光譜測定儀的測定波長范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為 4 cm-1,掃描次數(shù)為 32次[18]。最后利用peak fit 4.12軟件分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS16.0處理數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，取平均值并進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用OriginPro8.0繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-伴大豆球蛋白的提取

經(jīng)Tris-HCl浸提和堿溶酸沉法提取的β-伴大豆球蛋白電泳結(jié)果如圖1所示，其中β-伴大豆球蛋白的蛋白含量為92.7%。從圖1可以看出，β-伴大豆球蛋白各特征條帶與SPI中的7S球蛋白部分相吻合，且α'、α、β條帶清晰，提取純度較高，經(jīng)Gel-pro analyzer凝膠定量分析軟件測定其蛋白純度為72.68%。

2.2 加熱條件對β-伴大豆球蛋白溶解度的影響

以溶解度為指標(biāo)，不同熱處理溫度、時(shí)間以及質(zhì)量濃度對β-伴大豆球蛋白溶解度的影響分別如圖2—圖4所示。由圖2可知，80℃以上時(shí)β-伴大豆球蛋白的溶解度隨溫度的升高顯著降低，說明高溫導(dǎo)致了7S不溶性聚集體的產(chǎn)生，使其分散液變得渾濁甚至有沉淀產(chǎn)生。Iwabuchi等[19-20]對7S熱變性研究發(fā)現(xiàn)，在加熱過程中，隨著溫度的提高，7S各亞基不同程度地去折疊，形成了不同的結(jié)構(gòu)；同時(shí)7S三聚體的結(jié)構(gòu)發(fā)生解離，若再繼續(xù)增加溫度，以單體形式存在的亞基將會(huì)重新相互聚集，形成新的聚集體。由圖3和圖4可以看出，溶解度雖然呈現(xiàn)下降趨勢，但仍保留在一個(gè)較高水平，表明在加熱過程中7S仍能保留部分有序的空間結(jié)構(gòu)。說明7S對熱具有相對的穩(wěn)定性[21]。

圖1 β-伴大豆球蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of β-conglycinin

2.3 加熱條件對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響規(guī)律研究

不同加熱溫度、時(shí)間以及樣品質(zhì)量濃度對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響如圖5—圖7所示。由圖5可知，β-伴大豆球蛋白的抗原性隨溫度的增加逐漸降低；當(dāng)加熱溫度為140℃時(shí)，β-伴大豆球蛋白的抗原性由無加熱時(shí)的96.29%降低到60.78%，下降了35.51個(gè)百分點(diǎn)。由圖6可知，當(dāng)加熱溫度為90℃，處理時(shí)間為60 min時(shí)，抗原性下降了23.53個(gè)百分點(diǎn)?？乖缘南陆悼赡苁菬崽幚韺?dǎo)致β-伴大豆球蛋白發(fā)生聚集與交聯(lián)，使存在于分子表面的構(gòu)象表位被破壞或者掩蓋，使其抗原性下降[22]。由圖7可知，隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加，β-伴大豆球蛋白的抗原性呈現(xiàn)先增加又降低的趨勢，且濃度的變化對抗原性的影響并不大，只降低了5.96個(gè)百分點(diǎn)?？傮w來看，熱處理對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響較為顯著，可以控制相應(yīng)的溫度和時(shí)間的組合來降低大豆蛋白抗原性。

2.4 加熱條件對β-伴大豆球蛋白分子量及免疫原性的影響規(guī)律研究

圖2 不同溫度對β-伴大豆球蛋白溶解度的影響Fig.2 Effect of temperature on the solubility of βconglycinin

圖3 不同處理時(shí)間對β-伴大豆球蛋白溶解度的影響Fig.3 Effect of time on the solubility of βconglycinin

圖4 樣品質(zhì)量濃度對β-伴大豆球蛋白溶解度的影響Fig.4 Effect of concentration on the solubility of β-conglycinin

采用電泳及免疫印跡法對熱處理后β-伴大豆球蛋白的分子量和免疫原性進(jìn)行分析，以未經(jīng)熱處理的β-伴大豆球蛋白作為對照，結(jié)果如圖8和圖9所示。由圖8可知，40℃加熱的電泳條帶與未加熱的條帶相比顏色深淺沒有變化，而隨著加熱溫度的增加，β-伴大豆球蛋白的各個(gè)亞基條帶的密度逐漸加大，說明β-伴大豆球蛋白加熱后發(fā)生了熱聚集。圖9是相應(yīng)的免疫印跡圖，可以看出，未經(jīng)過熱處理的β-伴大豆球蛋白在其亞基位置處的免疫條帶較強(qiáng)，呈現(xiàn)較強(qiáng)的陽性反應(yīng)，經(jīng)過熱處理的β-伴大豆球蛋白在其亞基處也均有免疫條帶，40℃與60℃的免疫條帶與未經(jīng)過熱處理的β-伴大豆球蛋白相比顏色深淺變化較小，80℃及以上溫度處理后其條帶的顏色均明顯淺于未經(jīng)熱處理組，但條帶并沒有完全消失，說明熱處理后β-伴大豆球蛋白免疫原性有一定程度的降低，但并不能完全消除。這與前面的間接競爭ELISA法測定結(jié)果相一致。

圖5 不同溫度對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響Fig.5 Effect of temperature on the antigenicity of βconglycinin

圖7 樣品質(zhì)量濃度對β-伴大豆球蛋白抗原性的影響Fig.7 Effect of concentration on the antigenicity of β-conglycinin

圖8 不同溫度處理后樣品的SDS-PAGE圖譜Fig.8 SDS-PAGE patterns of β-conglycinin treated at different temperatures

圖9 不同溫度處理后樣品的免疫印跡圖Fig.9 Western blot patterns of β-conglycinin treated at different temperatures

2.5 傅里葉紅外光譜分析β-伴大豆球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

蛋白質(zhì)的紅外圖譜一般有3組特征吸收帶，分別是酰胺 I（1 600～1 700 cm-1）、酰胺 II（1 530～1 550 cm-1）和酰胺 III（1 260～1 330 cm-1）[23]。圖 10 為熱處理后β-伴大豆球蛋白的紅外光譜圖，熱處理后的樣品在酰胺I、II和III帶的吸收峰強(qiáng)度增加，這說明熱處理能引起C＝O鍵、N—H和C—N鍵的伸縮振動(dòng)增加，而其中酰胺II吸收峰的變化會(huì)引起蛋白質(zhì)分子間或分子中的氫鍵變化，進(jìn)而影響二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-結(jié)構(gòu)。紅外圖譜中位于1 600～1 700 cm-1之間的酰胺譜帶I常用于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。利用Peak fit 4.12對熱處理產(chǎn)物的酰胺I帶進(jìn)行去卷積二階導(dǎo)數(shù)擬合來計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化，樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化如表1所示，樣品中蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主，且熱處理后主要改變了β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。與未經(jīng)熱處理的β-伴大豆球蛋白相比，熱處理樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊含量減少，β-轉(zhuǎn)角和無序結(jié)構(gòu)含量有所增加，說明熱處理導(dǎo)致β-伴大豆球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。其可能的原因是熱處理使樣品原有的剛性結(jié)構(gòu)消失，肽鏈伸展，分子擴(kuò)散開來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[24]，部分α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)在熱處理后轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序結(jié)構(gòu)。通過紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)熱處理后的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低，這與Achouri等[25]的結(jié)果相一致。由圖5可知，隨著熱處理溫度的增加，β-伴大豆球蛋白的抗原性逐漸降低，其抗原性下降可能是由于二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊有序結(jié)構(gòu)減少，而無序結(jié)構(gòu)增加，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變導(dǎo)致了抗原表位的掩蓋，進(jìn)而使蛋白抗原性降低[26]。

圖10 熱處理β-伴大豆球蛋白的紅外掃描圖譜Fig.10 FTIR spectra of β-conglycinin after heat treatment

表1 熱處理后β-伴大豆球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structures content of β-conglycinin after heat treatment

3 結(jié)論

熱處理作為一種常見的加工方式，能顯著影響β-伴大豆球蛋白的抗原性。研究結(jié)果表明：不同溫度、加熱時(shí)間、樣品質(zhì)量濃度均對β-伴大豆球蛋白的抗原性有明顯影響，可降低 β-伴大豆球蛋白的抗原性。熱處理溫度顯著影響β-伴大豆球蛋白的抗原性，140℃時(shí)其抗原性降低了35.51個(gè)百分點(diǎn)。熱處理后，β-伴大豆球蛋白的溶解度隨溫度增加呈先上升后下降的趨勢，加熱時(shí)間和樣品質(zhì)量濃度對溶解度的影響相對較小。免疫印跡結(jié)果表明：熱處理后β-伴大豆球蛋白免疫原性有一定程度的降低，但是并不能完全消除。傅里葉紅外光譜結(jié)果表明：熱處理之后樣品中α-螺旋和β-折疊的含量減少，β-轉(zhuǎn)角和無序結(jié)構(gòu)含量增加。該研究將為食品加工過程中選擇合適的熱處理?xiàng)l件來降低大豆蛋白致敏性提供重要的理論依據(jù)。關(guān)于熱處理調(diào)控β-伴大豆球蛋白抗原性的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究與探討。

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INFLUENCE OF HEAT TREATMENT ON THE IMMUNOACTIVITY AND STRUCTURES OF β-CONGLYCININ

ZHAO Yifei，BU Guanhao，CHEN Fusheng
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou450001，China）

Soybean protein is rich in nutrients，but is easy to lead allergic reactions. There are 34 kinds of IgE mediated allergenic protein have been found，of which two kinds of β-conglycinin and glycinin are considered to be the major allergenic protein. Heat treatment，as a common processing method，can significantly affect the antigenicity of β-conglycinin. β-conglycinin was isolated by alkali-soluble acid precipitation method in this study，and the anti-gencity changes of β-conglycinin under different conditions were determined by indirect competitive ELISA method. And the solubility，immunoactivity and the structural properties of the products after heat treatment were also studied. The results showed that heat treatment could effectively reduce the antigenicity of β-conglycinin. After heat treatment，the solubility of β-conglycinin increased firstly and then decreased with the increasing of temperature. The results of immunoblotting showed that the immunoreactivity of β-conglycinin decreased after heat treatment，but it was not completely removed. The results of Fourier transform infrared spectroscopy showed that the contents of α-helix and β-sheet decreased，β-corner and irregular structure contents increased after heat treatment. The increase of disordered structure and the change of space structure leaded to the epitope coverd, thereby the antigenicity of β-conglycinin was reduced. The study will provide an important theoretical basis for the selection of suitable heat treatment conditions to reduce the sensitization of soybean protein in food processing.

β-conglycinin；heat treatment；antigenicity；structure

TS 201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

1673-2383(2017)05-0050-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171030.0936.020.html

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-10-30 9:36:37

2017-04-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201293）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（14B550013）；河南工業(yè)大學(xué)省屬高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2015RCJH02）

趙益菲（1992—），女，山西陽泉人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称返鞍踪|(zhì)資源開發(fā)與利用。

*通信作者