楊艷俊，王亞紅，吉惠杰

（吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022）

水蜈蚣總多酚的純化工藝及抗氧化性研究

楊艷俊，王亞紅，吉惠杰

（吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022）

研究利用大孔吸附樹脂對水蜈蚣總多酚進行純化的最佳工藝及其體外抗氧化性能。采用靜態(tài)和動態(tài)吸附與解吸的方法對水蜈蚣提取液中的總多酚進行純化，以吸附率和解吸率為指標，利用紫外分光光度計測量總多酚的含量。最佳樹脂為DM-301型，最佳動態(tài)工藝條件：上樣液體積25 mL，總多酚質量濃度為0.834 mg/mL，吸附流速2 BV/h，樣品液pH值為2.0，解吸液乙醇體積分數(shù)為75%，洗脫液用量為30 mL，洗脫流速3 BV/h。純化后浸膏中的總多酚純度可達39.4%。該工藝操作簡單，重復性好，適合水蜈蚣總多酚的純化?？疾焯崛∫簩PPH、ABTS、超氧陰離子自由基的清除能力，并用Vc作為對比，結果表明，水蜈蚣總多酚的抗氧化能力與Vc的抗氧化能力接近。

水蜈蚣；總多酚；純化工藝；抗氧化

0 引言

水蜈蚣又名三莢草、金鈕子、金鈕草、水金釵等，為莎草科植物的全草[1]，生于水邊、水田及曠野濕地等處，分布于江蘇、安徽、浙江、福建、江西、湖南、湖北、廣西、廣東、四川、云南、東北等地區(qū)。水蜈蚣為多年生草本植物，全株光滑無毛，鮮時有菖蒲的香氣，主治感冒風寒、寒熱頭痛、筋骨疼痛、咳嗽、瘧疾、黃疸、痢疾、瘡瘍腫毒、跌打刀傷等[2]。其在臨床方面也有應用，如治療瘧疾、乳糜尿[3-4]、菌痢、慢性氣管炎等疾病[5]。研究結果表明，水蜈蚣全草中含有牡荊素等黃酮類[1]、揮發(fā)油[6-7]、酚酸性成分等[8-9]。生活在閩南、江浙地區(qū)的人經常把該種植物搗碎后敷在傷口上，因為它有消腫、消炎止痛的作用，對惡性膿瘡治療效果尤其明顯[10]。黃酮類化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗氧化、抗衰老等作用[11-12]。有人對水蜈蚣總黃酮的制劑進行研究提高其溶出度，提高了生物利用率[13-14]。目前，對于水蜈蚣中總多酚的相關報道較少。植物多酚是一類廣泛存在于植物體內的多元酚化合物，在維管植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素，多酚類物質具有很強的抗氧化作用，已經引起國內外學者的關注[15]。試驗對水蜈蚣中總多酚最佳純化工藝及體外抗氧化性能進行研究，為水蜈蚣的進一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水蜈蚣：市售；沒食子酸標準品（≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；AB-8、DM-130、D-101、HPD-100、DM-301型大孔吸附樹脂：天津市海光化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷（≥98.8%）、DPPH（分析試劑）、ABTS（≥97%）：上海伊卡生物技術有限公司。水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T9新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FA2004N電子分析天平：上海精密科學股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總多酚含量的測定[16]

精確稱取沒食子酸5 mg，用無水乙醇定容至250 mL，配制成質量濃度為20 μg/mL的沒食子酸溶液。準確量取1 mL沒食子酸，置于25 mL容量瓶中，依次加入無水乙醇4 mL、0.3%十二烷基硫酸鈉 2 mL 及 0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）6]（1∶0.9）的混合液1 mL，混勻。在暗處放置5 min，加入0.1 mol/L HCl至刻度，搖勻顯色，在暗處放置20 min后，測得沒食子酸在748 nm處有最大吸收峰。精確量取 20 μg/mL 沒食子酸標準溶液 0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分別置于25 mL容量瓶中，在最大吸收波長處測吸光度，求得標準回歸曲線方程為y=0.683x+0.004，R2=0.999，符合要求，沒食子酸質量濃度在0.24～2.00 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

1.3.2 靜態(tài)吸附及解吸試驗

在錐形瓶中各加入樹脂5 g，加入40 mL水蜈蚣提取液，在2 h內每隔10 min振搖一次，每次30 s，放置48 h后過濾，測經樹脂吸附后藥液的吸光度，計算總多酚的吸附率。將樹脂抽干，加入60 mL 70%乙醇解吸，在2 h內每隔10 min振搖一次，每次30 s，放置48 h后過濾，測樹脂解吸后藥液的吸光度，計算總多酚的解吸率。

1.3.3 動態(tài)吸附及解吸試驗

取5 g經靜態(tài)法優(yōu)選的樹脂5份，濕法裝柱，加入水蜈蚣提取原液，以及稀釋了1、2、3、4倍的樣品溶液各25 mL，以1～5 BV/h的流速進行吸附后，分別收集過柱液，計算樹脂對總多酚的吸附率；再以10%～95%乙醇各30 mL以2 BV/h的流速進行解吸，分別收集洗脫液，考察洗脫液的質量濃度、用量及洗脫流速，經吸光度測試后計算溶液質量濃度的變化。

1.3.4 抗氧化試驗

1.3.4.1 DPPH法[17]

精確稱取19.716 mg DPPH，用無水乙醇溶解定容至250 mL容量瓶中，得C=0.2 mmol/L的DPPH溶液。 量取水蜈蚣提取液 0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL，用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，質量濃度分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL。將不同質量濃度的供試品溶液量取2 mL分別放置在10 mL比色管中，加入2 mL DPPH溶液（C=0.2 mmol/L），在暗處放置30 min，在517 nm處測定吸光度A1。對照組加入2 mL無水乙醇，測定吸光度為A2。用2 mL蒸餾水代替供試品溶液，加入2 mL DPPH溶液，混合均勻后，在暗處放置30 min后，測定吸光度記為A3。

用 Vc作為對照，將 Vc 配成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL溶液，按照供試品溶液的方法進行試驗，測定Vc對DPPH自由基的清除能力。

DPPH 清除率（%）=（A3-A1+A2）/A1×100。

1.3.4.2 ABTS法[18]

ABTS自由基陽離子的配制：精確稱取96.075 mg ABTS置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，配制成濃度為7 mmol/L的ABTS溶液，稱取0.13 g過硫酸鉀置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，制備2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液。按照1∶1比例各取溶液10 mL配制混合溶液，并置于23℃的避光處放置18～20 h，制備ABTS儲備液。稀釋后在波長734 nm處測得吸光度為0.700±0.005，得ABTS自由基陽離子基液，吸光度值為A空白。取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的供試品溶液 0.1 mL，置于10 mL比色管中，分別加入3.9 mL工作基液混合搖勻，23℃的避光放置6 min，用純水作為空白對照，測其吸光度值A。用Vc作為對照，將Vc配成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 按照上述方法進行試驗，測得Vc對ABTS自由基陽離子的清除率。

ABTS陽離子自由基清除率=（A空白-A）/A空白×100%。

1.3.4.3 超氧陰離子自由基的清除能力測定

取3 mL Tris-HCl緩沖溶液，分別加入0.5 mL不同質量濃度的供試品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、6.0 mg/mL和2 mL鄰苯三酚溶液，加入10 mmol/L HCl溶液1 mL，于320 nm波長處測其吸光度A1。取3 mL Tris-HCl緩沖溶液分別置于25℃水浴中預熱20 min，分別加入0.5 mL不同質量濃度的供試品溶液和2 mL蒸餾水，混勻后于25℃水浴中反應 8 min，加入 10 mmol/L HCl溶液 1 mL，測其吸光度A2。取3 mL Tris-HCL緩沖溶液分別置于25℃水浴中預熱20 min，分別加入0.5 mL不同質量濃度的供試品溶液和2 mL鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應8 min，加入0.05 mmol/L HCl溶液1 mL，測其吸光度A3。Vc作對照配成質量濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 溶液，按照上述供試品的方法進行使用，測定Vc對超氧陰離子自由基的清除率。

超氧陰離子自由基清除率（%）=（A3－A1＋A2）/A3×100。

2 結果與分析

2.1 樹脂類型的選擇

5種型號的樹脂經靜態(tài)吸附及解吸后得到的溶液的質量濃度如表1所示，DM-301樹脂的吸附率及解吸率都較高，選擇DM-301為最優(yōu)樹脂進行動態(tài)吸附及解吸研究。

2.2 DM-301型大孔吸附樹脂吸附工藝優(yōu)化研究

2.2.1 上柱液質量濃度的考察

取5 g已處理好DM-301型吸附樹脂，加入水蜈蚣提取原液，以及稀釋了1、2、3、4倍的樣品溶液各25 mL，先以2 BV/h的流速進行吸附后，收集過柱液，再對樹脂進行解吸，計算吸附率及解吸率，如表2所示。

表1 靜態(tài)吸附率及解吸率Table 1 Static adsorption rate and desorption rate

表2 上柱液質量濃度的考察結果Table 2 Results of different extract mass concentration

上柱液質量濃度過高時，浪費情況嚴重，吸附率過低；質量濃度過低時，藥液中總多酚量過少，可導致吸附量計算不準確，影響試驗結果。在其他純化條件相同時，隨著上柱藥液質量濃度的減小，解吸率先增大后又減小，最佳水蜈蚣總多酚純化的質量濃度為0.834 mg/mL。

2.2.2 吸附速率的考察（表3）

表3 吸附速率考察結果Table 3 Results of different adsorption rate

樹脂柱中加入水蜈蚣提取液（質量濃度為0.845 mg/mL），分別以1～5 BV/h的流速進行吸附，收集過柱液，再對樹脂進行解吸。對吸附后液體及解吸液分別取樣進行含量測定，得出總多酚濃度，計算吸附率及解吸率。

隨著吸附速率的加快，樹脂對水蜈蚣總多酚的吸附率先增大后減小，解吸率先增大后減小又增大，依據(jù)試驗結果確定最佳水蜈蚣總多酚吸附速率為2 BV/h。

2.2.3 解吸液體積分數(shù)的考察（表4）

表4 解吸液體積分數(shù)考察結果Table 4 Results of different eluent volume fraction

方法同2.3.1，洗脫液分別為10%、30%、50%、75%、95%乙醇各60 mL以2 BV/h的流速進行解吸，收集洗脫液。對吸附后液體及解吸液分別取樣進行含量測定，得出各液體總多酚濃度，計算吸附率及解吸率，以解吸率為指標進行條件擇優(yōu)。

解吸液體積分數(shù)對水蜈蚣總多酚純化有較大的影響，隨解吸液體積分數(shù)的增加，解吸率先是大幅度增加，之后緩慢下降，由表4得出，解吸液為75%乙醇時解吸率最高，所以確定解吸液最佳體積分數(shù)為75%。

2.2.4 解吸速率的考察（表5）

表5 解吸速率考察結果Table 5 Results of different eluent flow rate

方法同 2.3.2，以 1、2、3、4、5 BV/h 的流速進行洗脫，收集洗脫液。對吸附后液體及解吸液分別取樣進行含量測定，得出各液體總多酚質量，計算吸附率及解吸率，以解吸率為指標進行條件擇優(yōu)。

洗脫速率過快，洗脫不完全，浪費溶劑，洗脫速率過慢，洗脫時間延長，生產效率降低。由表5可以看出，在其他純化條件相同時，解吸率在洗脫速率為3～4 BV/h時較高，依據(jù)試驗結果確定最佳水蜈蚣總多酚解吸速率為3 BV/h。

2.2.5 洗脫終點考察（表6）

表6 洗脫終點考察Table 6 Results of eluent end point

方法同2.3.1，加入水蜈蚣上柱液50 mL，以2 BV/h的流速進行吸附，收集過柱液。以75%乙醇3 BV/h的流速進行解吸，每5 mL收集洗脫液，測定含量，確定洗脫終點。

當解吸液用量為6 BV時已基本將水蜈蚣總多酚解吸完畢。解吸液體積過小，不能夠將水蜈蚣總多酚解吸完全，若解吸液體積過大，則會造成不必要的浪費。因此，選擇適當?shù)慕馕后w積，可以既滿足試驗要求又不會造成試劑浪費。綜上，在試驗條件不變的情況下，使用30 mL解吸液已接近洗脫終點，所以體積選用30 mL。

2.2.6 上柱液pH的考察（表7）

表7 上柱液pH值考察Table 7 Results of different pH values

方法同2.3.1，使用稀HCl溶液和稀NaOH溶液分別調節(jié)提取液 pH 為 1、2、3、4、5，吸附后再用75%乙醇各30 mL以3 BV/h的流速進行解吸，收集解吸液，以吸附率為指標進行條件擇優(yōu)。

在其他純化條件相同時，隨著上柱藥液pH值變化，吸附率先增大后減小，最佳上柱藥液pH值為2。

2.3 DM-301型大孔吸附樹脂純化水蜈蚣總多酚工藝驗證

取pH值為2的水蜈蚣上柱液25 mL，以2 BV/h流速進行吸附，待充分吸附后，測吸光度，計算吸附率，然后用30 mL體積分數(shù)為75%的乙醇進行解吸，待解吸后測解吸液吸光度。量取解吸液25 mL制作浸膏，試驗結果見表8、表9。

表8 DM-301型大孔吸附樹脂純化水蜈蚣總多酚驗證試驗結果（一）Table 8 Verification results of DM-301 resin purifying total polyphenols（I）

表9 DM-301型大孔吸附樹脂純化水蜈蚣總多酚驗證試驗結果（二）Table 9 Verification results of DM-301 resin purifying total polyphenols(II)

由表8可知，吸附率平均值90.71%，解吸率平均值87.62%。

2.4 抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基的清除能力（圖1）

水蜈蚣提取液對DPPH自由基清除率分別為59.8%、69.32%、75.81%、83.01%、90.67%、97.15%，Vc對DPPH自由基清除率分別為57.60%、63.07%、72.71%、77.08%、89.32%、96.47%。

圖1 水蜈蚣提取液與Vc溶液對DPPH自由基清除能力對比Fig.1 Comparison of DPPH radical scavenging ability of extracts and Vc solution

由圖1可知，水蜈蚣提取液對DPPH自由基清除能力隨著質量濃度的增大而增大，對DPPH自由基的清除能力略低于Vc。但仍具有極強的清除能力，當質量濃度為0.6 mg/mL時清除率能達到96.47%。

2.4.2 ABTS自由基的清除能力（圖2）

圖2 水蜈蚣提取液與Vc溶液對ABTS自由基清除能力對比Fig.2 Comparison of ABTS radical scavenging ability of extracts and Vc solution

水蜈蚣提取液對ABTS自由基清除率分別為39.92%、48.16%、55.83%、63.92%、84.8%、86.93%，Vc對ABTS自由基清除率分別為53.85%、59.81%、65.01%、76.51%、84.33%、91.2%。

由圖2可知，水蜈蚣提取液對ABTS自由基清除率隨著提取液質量濃度的增大而增大，在質量濃度為0.6 mg/mL時，對ABTS的清除率達到86.93%。

2.4.3 對超氧陰離子自由基的清除能力（圖3）

圖3 水蜈蚣提取液與Vc溶液對超氧陰離子自由基清除能力對比Fig.3 Comparison of superoxide anion radical scavenging ability of extracts and Vc solution

水蜈蚣提取液對超氧陰離子自由基清除率分別為 60.62%、74.89%、77.68%、83.96%、88.18%、95.09%，Vc對超氧陰離子自由基清除率分別為44.54%、56.30%、62.13%、72.55%、80.84%、93.84%。

由圖3可知，水蜈蚣提取液對超氧陰離子自由基清除能力隨著水蜈蚣提取液的質量濃度增大而增大，當提取液質量濃度為0.6 mg/mL時，清除率可達到95.09%。

3 結論

DM-301型大孔吸附樹脂純化水蜈蚣總多酚的最佳工藝條件為：上柱液總多酚質量濃度為0.834 mg/mL、pH值為 2、吸附速率為 2 BV/h，解吸液為75%乙醇溶液，解吸液體積為30 mL，解吸速率為3 BV/h，純化后總多酚純度由原來的11.4%提高到39.4%，樹脂富集倍數(shù)約為3.5倍，表明DM-301型大孔樹脂對水蜈蚣總多酚具有一定的純化性能。紫外可見分光光度計分析法穩(wěn)定、精密，采用該方法符合試驗要求，適用于水蜈蚣總多酚純化研究試驗。水蜈蚣總多酚提取液對DPPH自由基、ABTS自由基、超氧陰離子自由基清除能力的試驗表明，水蜈蚣提取液與Vc溶液具有相近的體外抗氧化活性。

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PURIFICATION PROCESS OF TOTAL PHENOLIC ACIDS FROM KYLLINGABREVIFOLIAROTTB AND ITS ANTIOXIDANT ACTIVITY

YANG Yanjun，WANG Yahong，JI Huijie
(School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin132022，China)

The optimum purificaiton process and the antioxidant activity of the total polyphenols fromKyllinga brevifoliaRottb by use of macroporous resin were studied. The total polyphenols inKyllinga brevifoliaRottb extract were purified by static and dynamic adsorption and desorption to calculate adsorption rate and desorption rate，and the content of the total polyphenols were determined by ultraviolet spectrophotometer. Results showed that the resin DM-301 was most suitable for purification; the optimum dynamic conditions were as follows:loading amount 25 mL，the mass concentration of total polyphenols 0.824 mg/mL，absorption flow rate 2 BV/h，sample pH 2.0，desorption solution （ethanol）volume fraction 75%，eluent amount 30 mL，and eluent flow rate 3 BV/h. The purity of the total polyphenols in the purified extract reached 39.4%. The process is simple in operation，repeatable，and suitable for purification of total polyphenols fromKyllinga brevifoliaRottb. The scavenging ability of total polyphenols to DPPH，ABTS and superoxide anion free radicals were studied by selecting Vc as contrast，and results showed that the antioxidant activity of the total polyphenols fromKyllinga brevifoliaRottb was similar to that of Vc.

Kyllinga brevifoliaRottb；total polyphenol；purification；oxidation resistance

TS 201.2 文獻標志碼：B

1673-2383(2017)05-0076-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171030.0936.028.html

網(wǎng)絡出版時間：2017-10-30 9:36:39

2017-02-12

吉林化工學院項目（吉化院合字[2015]第44號）

楊艷?。?974—），女，吉林吉林人，碩士，講師，研究方向為天然產物的提取及精制。