張寧，鄭群，傅曉艷，郭方明，張志琴，湯碧娥，唐風(fēng)君，陳浩浩*

（1金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，金華321007；2金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，金華321000； 3金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院不孕癥研究所，金華321007）

人工光照對青春期前雌性大鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響

張寧1,3，鄭群2，傅曉艷3，郭方明1，張志琴1，湯碧娥1，唐風(fēng)君1，陳浩浩3*

（1金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，金華321007；2金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，金華321000；3金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院不孕癥研究所，金華321007）

目的研究人工光照時(shí)長對青春期前雌性大鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響。方法選取40只離乳后（日齡為21天）的SPF級雌性大鼠，隨機(jī)分成對照組、16h光照組、20h光照組、24h持續(xù)光照組，每組10只。各組均正常飲食，持續(xù)28天。陰道涂片法檢測動(dòng)情周期，計(jì)算卵巢和子宮臟器系數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中褪黑素（MT）、卵泡刺激素（FSH）雌二醇（E2）水平，HE染色顯微鏡下觀察卵巢和子宮組織形態(tài)學(xué)的改變。結(jié)果與對照組相比，24h持續(xù)光照組動(dòng)情期延長，卵巢和子宮臟器系數(shù)升高，MT下降，E2水平增高，可見成熟卵泡和排卵后黃體；除20h光照組偶見少量成熟卵泡外，16h光照組和20h光照組卵巢和子宮臟器系數(shù)和血清激素水平未見明顯改變。結(jié)論一定范圍內(nèi)延長光照對雌性大鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育無顯著影響，但24h持續(xù)人工光照可以導(dǎo)致青春期前雌性大鼠性發(fā)育提前，這可能與體內(nèi)MT水平抑制有關(guān)。

光照；青春期前；雌性大鼠；褪黑素；性發(fā)育

性早熟是指女孩在8歲、男孩在9歲以前呈現(xiàn)第二性征[1]，是小兒臨床最常見的內(nèi)分泌疾病之一。女性卵巢的發(fā)育受下丘腦-腺垂體的調(diào)節(jié)，在青春期前，下丘腦促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）神經(jīng)元尚未發(fā)育成熟，GnRH的分泌很少，卵巢激素處于低水平狀態(tài)。隨著青春期的到來，下丘腦GnRH神經(jīng)元逐漸發(fā)育，GnRH的分泌增加，下丘腦-腺垂體-性腺軸（hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPGA）啟動(dòng)，卵巢功能開始出現(xiàn)周期性的變化。褪黑素（melatonin,MT）是松果體分泌的主要激素之一，分泌呈現(xiàn)明顯的日周期變化，白天分泌減少，夜晚分泌增多，而且與年齡負(fù)相關(guān)，隨著年齡增長，MT分泌量逐漸減少[2]。人在出生后數(shù)月即可有MT分泌，3～6歲達(dá)最高峰，7～10歲起松果體開始逐漸退化，褪黑激素分泌減少，松果體退化的年齡剛好和青春發(fā)育期開始的年齡相吻合。有文獻(xiàn)報(bào)道[3,4]，光照信號依靠褪黑素介導(dǎo)傳遞到HPGA來調(diào)節(jié)性成熟及生殖活動(dòng)，光照過強(qiáng)及過長，可能導(dǎo)致性早熟。隨著社會(huì)發(fā)展，女童性早熟發(fā)病率逐年增高，這可能與女童兒童期暴露光照增多，導(dǎo)致松果體分泌褪黑素減少，對下丘腦-腺垂體-性腺軸的抑制作用減弱，導(dǎo)致青春期性發(fā)育提前有關(guān)[5,6]。本研究探討過度光照對青春期前雌性大鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響，為今后對性早熟的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級21日齡健康雌性SD大鼠40只，體重50±1.62g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號為SCXK（浙）2014-0001。自制光照控制箱（箱體長、寬、高均為1.5m，箱頂安裝普通居民用市售日光燈4只，功率為60w），ELISA試劑盒購自武漢華美生物生物工程有限公司，其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

2 動(dòng)物分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2天后，按照標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)化原則，分為對照組、16h光照組、20h光照組和24h光照組，每組10只。除對照組外，其他各組均飼養(yǎng)在光照控制箱內(nèi)。①對照組：12h光照，12h黑暗。②16h光照組：暴露周期（h）為光∶暗=16∶8。③20h光照組：暴露周期（h）為光∶暗=20∶4。④24h持續(xù)光照組：暴露周期（h）為光∶暗=24∶0。各組均正常飲食，持續(xù)4周。

3 動(dòng)情周期觀察

大鼠陰門開啟后，每天上午8∶00進(jìn)行陰道涂片，用沾有生理鹽水的細(xì)棉簽在大鼠的陰道內(nèi)輕旋 2圈，然后均勻涂在干凈的載玻片上， 在顯微鏡下觀察陰道脫落細(xì)胞的形態(tài)，判斷各組大鼠的動(dòng)情周期。雌性大鼠動(dòng)情周期可以分為4期：①動(dòng)情前期，有核上皮細(xì)胞占絕大多數(shù)，偶有少量角化細(xì)胞和白細(xì)胞；②動(dòng)情期，無核角化細(xì)胞占絕大多數(shù)，偶有少量有核上皮細(xì)胞；③動(dòng)情后期，有核上皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、白細(xì)胞均有，且所占比例基本均等；④動(dòng)情間期，可見大量白細(xì)胞，少量有核退化的上皮細(xì)胞和些許粘液。

4 血中性激素水平檢測

各組大鼠眼球取血2～3ml室溫下靜置，3000r/min離心20min，分離血清，置于-20℃冰箱冷凍保存。采用ELISA法檢測血清中MT、FSH、E2水平，具體步驟參照試劑盒說明書。

5 器官系數(shù)測定

采血后脫頸處死大鼠，打開腹腔，摘取其子宮和卵巢，剝?nèi)テ渲車闹竞徒Y(jié)締組織后稱重，然后立即置于4%多聚甲醛中固定，計(jì)算子宮和卵巢的臟器系數(shù)(器官濕重/體重)。

6 卵巢和子宮組織形態(tài)學(xué)觀察

每組隨機(jī)選取5個(gè)卵巢和子宮進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示，對數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布和方差齊性的兩組間數(shù)據(jù)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組間數(shù)據(jù)分析采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析。 P＜0.05表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異。

結(jié) 果

1 4周24h持續(xù)光照使大鼠動(dòng)情周期延長

動(dòng)情周期各時(shí)期陰道脫落細(xì)胞典型涂片顯示（圖1）： ①動(dòng)情前期，有核上皮細(xì)胞占絕大多數(shù)，偶有少量角化細(xì)胞和白細(xì)胞；②動(dòng)情期，無核角化細(xì)胞占絕大多數(shù)，偶有少量有核上皮細(xì)胞；③動(dòng)情后期，有核上皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、白細(xì)胞均有，且所占比例基本均等；④動(dòng)情間期，可見大量白細(xì)胞，少量有核退化的上皮細(xì)胞和些許粘液。對照組和16h光照組大鼠陰道涂片未見動(dòng)情期；20h光照組偶見動(dòng)情期但無規(guī)律的動(dòng)情周期；24h持續(xù)光照組動(dòng)情期延長，持續(xù)時(shí)間長短不一，動(dòng)情周期明顯延長約6～8d。各組未見細(xì)胞形態(tài)的明顯變化。

2 4周24h持續(xù)光照使血清褪黑素降低雌二醇升高

24h持續(xù)光照4周大鼠血清中褪黑素（MT）較對照組顯著降低，血清中雌二醇（E2）較對照組顯著升高，其他組與對照組相比無顯著差異。各組血清卵泡刺激素（FSH）比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

圖1 大鼠動(dòng)情周期各時(shí)期陰道脫落細(xì)胞形態(tài)。A，動(dòng)情前期；B，動(dòng)情期；C，動(dòng)情后期；D，動(dòng)情間期；標(biāo)尺，100μmFig. 1 Morphology of the vaginal exfoliated cells from rats during estrous cycle. A, proestrus phase; B, estrus phase; C, metestrus phase; D, anestrus phase; scale bar, 100μm

表1 光照大鼠血清性激素水平Tab. 1 Serum concentrations of sex hormones in the experimental rats

3 長時(shí)間光照升高子宮和卵巢系數(shù)

16h光照組大鼠子宮系數(shù)和卵巢系數(shù)均無變化；20h光照組大鼠的子宮系數(shù)與對照組相比明顯升高，卵巢系數(shù)無明顯變化；24h持續(xù)光照組大鼠的子宮和卵巢系數(shù)與對照組相比均明顯升高（表2）。

表2 光照大鼠子宮系數(shù)和卵巢系數(shù)Tab. 2 The ovary and uterus indexes of the experimental rats

4 長時(shí)間光照使子宮和卵巢發(fā)育提前

HE染色結(jié)果顯示（圖2）：對照組和16h光照組大鼠子宮宮腔小，肌層薄，少見腺體；與對照組相比，20小時(shí)光照組子宮宮腔增大，肌層增厚；24h持續(xù)光照組大鼠子宮肌層增厚和宮腔增大更明顯，腺體增多，腺腔更大。對照組可見大量的初級卵泡，未見次級卵泡和成熟卵泡。16h光照組大鼠卵巢內(nèi)可見大小不等的生長卵泡，初級卵泡和次級卵泡，未見成熟卵泡；20h光照組偶見少量成熟卵泡；24h持續(xù)光照組大鼠卵巢內(nèi)可見成熟卵泡，卵丘和黃體形態(tài)正常，細(xì)胞形態(tài)完整、 排列整齊、層次分明。

圖2 光照大鼠子宮和卵巢組織學(xué)變化的HE染色觀察。A-D，子宮；E-H，卵巢； A和E，對照組； B和F，16h光照組；C和G，20h光照組；D和H，24h光照組；比例尺，100μmFig. 2 HE staining examination on histological changes of the uterus and ovary of the rats. A-D, Uterus; E-H, Ovary; A and E, Control group; B and F,16-hour light exposure group; C and G, 20-hour light exposure group; D and H, 24-hour light exposure group; scale bar, 100μm

討 論

青春發(fā)育的啟動(dòng)過程受下丘腦-腺垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)該軸的環(huán)節(jié)發(fā)生異常，即可引起青春發(fā)育的異常。性早熟的發(fā)生與下丘腦-腺垂體-性腺軸提前啟動(dòng)有關(guān)。青春發(fā)育的啟動(dòng)與褪黑素的關(guān)系已經(jīng)得到許多專家和學(xué)者研究，并形成一定共識。臨床研究表明[7-9]，中樞性性早熟兒童夜間血清MT和性發(fā)育水平相關(guān)，在性早熟兒童中，血清MT水平明顯低于年齡相當(dāng)?shù)膶φ战M，且與正常青春期組無差異，這與在青春期前褪黑素抑制下丘腦釋放GnRH、當(dāng)褪黑素分泌不足時(shí)下丘腦GnRH分泌量增加所引起真性性早熟的報(bào)道一致。

有研究發(fā)現(xiàn)[10]，過度的光照可以抑制松果體功能，形成了松果體的光切除狀態(tài)，使得MT分泌受到抑制，導(dǎo)致MT的對HPGA的抑制作用減弱，性發(fā)育提前。MT作為青春發(fā)育的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在下丘腦-腺垂體-性腺軸(HPGA)各個(gè)水平發(fā)揮抑制作用，推測其可能機(jī)制為下丘腦、垂體、卵巢存在MT受體，MT可以與下丘腦、垂體MT受體結(jié)合，阻斷GnRH神經(jīng)元的分泌釋放GnRH，抑制垂體分泌FSH、LH和PRL[11-13]。同時(shí)MT能促進(jìn)下丘腦促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH）的釋放，GnIH與血清中LH水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，對性腺具有抑制作用[14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)[3]，MT對下丘腦-腺垂體的作用僅出現(xiàn)在未成熟大鼠，而對性成熟大鼠無此作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常組和16h光照組動(dòng)情周期、臟器系數(shù)和血清激素水平無明顯改變；20h光照組動(dòng)情周期中可見動(dòng)情期，但無規(guī)律的動(dòng)情周期，子宮系數(shù)升高，其他無明顯改變；而24h持續(xù)光照組大鼠動(dòng)情周期中的動(dòng)情期延長，血清MT水平明顯下降，E2水平明顯增高，子宮和卵巢發(fā)育與空白對照組相比明顯提前。該結(jié)果提示適量延長人工光照可能對性發(fā)育影響不大，但持續(xù)過量的人工光照能抑制松果體分泌MT，導(dǎo)致青春期前雌性大鼠下丘腦-腺垂體-性腺軸提前啟動(dòng)，性發(fā)育提前。隨著城市化建設(shè)加快，女童接觸人工光源增多，生活方式上被動(dòng)接受過量人工光照，我們認(rèn)為，女童增加適量人工光照對性發(fā)育無影響，但持續(xù)人工光照會(huì)導(dǎo)致性發(fā)育提前，甚至性早熟。

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Effects of artificial lighting on the development of reproductive system in preadolescent female rats

Zhang Ning1,3, Zhengqun2, Fu Xiaoyan3, Guo Fangming1, Zhang Zhiqin1, Tang Bi-E1, Tang Fengjun1, Chen Haohao3*
(1Department of physiology, School of Medicine, Jinhua Polytechnic Institute;2Center of Reproductive Medicine, Affiliated Hospital of Jinhua Polytechnic Institute;3Institute of Infertility, School of Medicine, Jinhua Polytechnic Institute, Jinhua 321001, China)

ObjectiveTo investigate the effects of artificial lighting on the development of reproductive system in preadolescent female rats.MethodsForty healthy 21-day-old female rats in SPF grade were randomly divided into 4 groups (10 rats each)∶ control group and groups that were continuously exposed to light for 16, 20 or 24 hours on a daily basis. All rats were given normal diet. After 28 days, the pattern of vaginal cell exfoliation during the estrous cycle period was studied, and the organ indexes of ovary and uterus were calculated. The serum concentrations of melatonin (MT), estradiol (E2), follicle-stimulating hormone (FSH) were quantified by ELISA, and the histopathological lesion of uterus and ovary were observed with HE staining.ResultsCompared to control, rats in 24-hour light exposure group had a prolonged estrous cycle and increased organ indexes of ovary and uterus. Their serum concentrations of MT decreased while E2 increased. Mature follicles and corpus luteum after ovulation were visible. In contrast, 16-hour and 20-hour light exposure groups had no obvious changes on their reproductive activities.ConclusionThe moderately increased exposure to artificial lighting had no obvious effect on the development of reproductive system in preadolescent female rats, but 24 hour continuous exposure induced a premature development, which may be associated with the reduction of melatonin level.

Lighting; preadolescent; female rats; melatonin; sexual development

R363

A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 004

2017-06-21

2017-10-08

金華市科技局計(jì)劃項(xiàng)目（2016-4-012）；浙江省2016年度高校訪問工程師“校企合作項(xiàng)目”（FG2016033）

張寧，女（1980年），漢族，講師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：jhchh@aliyun.com