高寒草地牧草內生細菌262AG6拮抗功能測定及鑒定

郭 海，楊成德，姚玉玲，崔月貞，牛小麗，薛 莉

(甘肅農業(yè)大學 植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070)

高寒草地牧草內生細菌262AG6拮抗功能測定及鑒定

郭 海，楊成德，姚玉玲，崔月貞，牛小麗，薛 莉

(甘肅農業(yè)大學 植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070)

為明確高寒草地牧草矮生嵩草(Kobresiahumilis)內生細菌262AG6的生防潛力，采用平皿對峙法測定其抑菌功能，并綜合形態(tài)學特征和16S rDNA序列分析對其進行鑒定。結果表明，262AG6對馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)的抑制效果達到81.33%，對其他多種病原真菌也具有良好抑制能力，且抑菌能力穩(wěn)定；在含100 mg·L-1色氨酸和不含色氨酸的King培養(yǎng)液中分泌IAA的量分別為8.04 mg·L-1和7.98 mg·L-1；具有溶解無機磷和固氮的能力；262AG6革蘭氏染色呈陽性，桿狀，菌體大小為(1.63～ 3.65) μm×(0.38～0.95) μm，綜合形態(tài)特性、16S rDNA和gyrB DNA序列分析將菌株262AG6鑒定為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

內生細菌；解淀粉芽胞桿菌；抑菌能力；鑒定

植物病害生物防治是利用生物或生物代謝產物控制植物病害的方法，由于其對環(huán)境友好和符合農業(yè)可持續(xù)發(fā)展觀的特點受到廣大植保工作者的青睞。目前，真菌、細菌、放線菌等微生物在生物防治方面都有較多研究，并取得明顯進展。生防細菌因其種類繁多，總量龐大且易于培養(yǎng)和作用方式多樣等特點成為近年來植物病害生物防治研究與應用的熱點。植物內生細菌指能夠在健康植株上定殖并與其創(chuàng)立共生聯(lián)系的一個微生物群類。近年來的研究表明，植物內生細菌與宿主植物建立復雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其通過固氮、溶磷、抑菌等生物功能促進植物生長和提高抗逆能力。當前，植物內生細菌已經(jīng)成為農業(yè)上防控植物病害的重要手段，如高小寧等[1]報道，植物內生細菌Em7(Bacillussubtilis)對油菜菌核病的防治效果達50%～70%，與化學農藥戊唑醇(Tebuconazole)和多菌靈(Carbendazim)相當；也有研究顯示，從桔梗[2]、向日葵[3]、茄子[4]、山茶[5]、甜菜[6]、水稻[7]、針茅[8]、紅樹[9]和珠芽蓼[10]等植物體內分離獲得的內生菌對其寄主病害的防控擁有優(yōu)越的效果；植物內生細菌這一微生物群類在植物病害防治領域具有重要地位。

本研究以從東祁連山高寒草地矮生嵩草中分離的內生細菌262AG6為試驗材料，對其固氮、溶磷等功能進行測定，并綜合其形態(tài)特性和16S rDNA序列分析進行鑒定，以期豐富植物病害防治資源，為高寒草地牧草內生細菌資源的利用與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)用于病原真菌的培養(yǎng)和對峙試驗；肉汁胨培養(yǎng)基(NA)用于內生細菌的活化、保存等；金氏(King)培養(yǎng)基用于產IAA試驗；Pikovaskaia培養(yǎng)基和門金娜培養(yǎng)基分別用于有機磷和無機磷溶解試驗；Ashby培養(yǎng)基用于菌株固氮能力測定[11]。

1.1.2 供試菌株 供試拮抗細菌：東祁連山高寒草地矮生嵩草內生細菌262AG6；供試病原真菌：馬鈴薯壞疽病菌(Phomafoveata)、馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)、馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、馬鈴薯立枯絲核病菌(Rhizoctoniasolani)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、孜然根腐病菌(Fusariumsolani)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)。以上菌株均由甘肅農業(yè)大學植物保護學院提供。

1.2 方 法

1.2.1 抑菌能力測定 采用平皿對峙法[12-13]鑒定抑菌功能。將活化病原真菌制成直徑0.6 cm的菌餅置于PDA平皿中央，在距菌餅25 mm處用十字交織法點接菌4次，對照組點接無菌水，每處理3次重復，25 ℃恒溫培養(yǎng)(馬鈴薯壞疽病病菌處理置于20 ℃恒溫培養(yǎng))，待對照組鋪滿培養(yǎng)皿后，測量處理組菌落和對照菌落直徑，并計算抑菌率(%)。抑菌率=[(對照組真菌直徑-試驗組真菌直徑)/(對照組真菌直徑-原菌餅直徑)]×100%。

1.2.2 抑菌穩(wěn)定性測定 將262AG6在NA平皿上持續(xù)接菌10次(每隔2 d轉接1次)，然后以馬鈴薯炭疽病菌為指示菌并用平皿對峙法測定其抑菌能力。

1.2.3 對病原菌菌絲生長的干擾作用 挑取平皿對峙法處理中病原真菌菌絲和對照中正常菌絲于光學顯微鏡下觀察比較菌絲形態(tài)特征，描述并照相。

1.2.4 其他生物學功能測定 固氮功能測定：將262AG6低齡菌懸浮液分開接種于Ashby無氮平皿和液體培養(yǎng)基，3次重復，以無菌水為對照，生長溫度28 ℃，在第3、5、7 d 觀察其變化，繼代培養(yǎng)3代后平皿上有菌落并且培養(yǎng)液變混濁者即可認為具有固氮能力[14]。

溶磷能力測定[13-14]：(1)定性測定，將262AG6點接在 Pikovaskaia 培養(yǎng)基和門金娜培養(yǎng)基，每皿接5個點，28 ℃培養(yǎng)8 d后觀測菌株在培養(yǎng)基平皿上形成的溶磷圈，并按照溶磷圈直徑/菌落直徑(D/d值)確定溶磷能力；D/d值與其溶磷能力成正比。(2)定量測定，將菌株262AG6接種于Pikovaskaia培養(yǎng)液，以不接菌處理為對照。28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)10 d，4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min后取上清液，采取鉬銻抗比色法測定有效磷增加。

產IAA能力測定：采用Salkowski 比色法[15]測定262AG6的產IAA能力。

1.2.5 鑒定 形態(tài)觀察：將活化后的262AG6接種于NA平皿培養(yǎng)基，觀察菌落特征，拍照并描述，挑選低齡菌落進行革蘭氏染色[11]和鏡檢，觀察菌體形態(tài)和顏色，隨機測量50個菌體的長和寬，并顯微照相。

DNA提?。喊凑仗旄萍?北京)有限公司提供的試劑盒提取DNA并通過凝膠電泳查驗，特異性DNA條帶保存于-20 ℃冰箱，備用。DNA提取試劑盒為細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，版本號DP121221。

16S rDNA擴增：采用引物1(5′-GAAGT-CATCATGACCGTTCTGCATGCCGGTGGA- AAGTTCGA-3′)和引物2(5′-AGCAGGG-TACGGATGTGCGAGCCATCTACGTCAGC-GTCAGTCAT-3′)進行PCR擴增。擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性10 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；最后在72 ℃延伸 8 min，終止反應。50 μL反應體系：10×buffer(含MgCl2)5 μL，dNTP(5 mmol·L-1)1 μL，primer 1(10 μmol·L-1)1 μL，primer 2(10 μmol·L-1)1 μL，Taqpoly-merse(2 U·μL-1)0.4 μL，Target DNA(10 mg·L-1)1 μL，ddH2O 40.6 μL[12]。將擴增產物送至武漢金開瑞公司測序，將測序結果與GenBank已報道的序列進行同源性比對(http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，并采用Clustal(1.8)軟件進行多重序列比較，采用MEGA(5.0)的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學定位。

gyrB DNA擴增：采用引物UP-1S(5′-GAA- GTCATCATGACCGTTCTGCATGCCGGTGG-AAAGTTCGA-3′) 和引物UP-2Sr(5′-AGCA- GGGTACGGATGTGCGAGCCATCTACGTC- AGCGTCAGTCAT-3′)進行擴增，擴增條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保持1 h[13]。25 μL反應體系：2×PowerTaqPCR Master Mix 12.5 μL，primer UP-1S(10 μmol·L-1)1 μL，primer UP-2Sr(10 μmol·L-1)1 μL，Target DNA(10 mg·L-1)1 μL，ddH2O 9.5 μL。

將16S rDNA擴增和gyrB DNA擴增產物送至武漢金開瑞公司測序，將測序結果與GenBank已報道的序列進行同源性比對(http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，并采用Clustal(1.8)軟件進行多重序列比較，采用MEGA(5.0)的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確該菌株的系統(tǒng)發(fā)育學定位。

2 結果與分析

2.1 262AG6生防潛力評估

由表1和圖1可知，菌株262AG6對馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯立枯絲核病菌、番茄早疫病菌、小麥根腐病菌、孜然根腐病菌、黃瓜枯萎病菌的抑制率分別為81.33%、68.72%、67.50%、64.67%、56.79%、71.78%、66.24%和58.19%，說明，菌株262AG6對馬鈴薯等多種作物的多種病原真菌具有抑菌作用，抗菌譜廣，可以一菌多防。

表1 262AG6對病原真菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of 262AG6 against phytopathogenic fungi

注：數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標準誤”。下同。

Note:Data in the table indicate “Mean±Standard error”.The same below.

A.壞疽病菌處理 Treatment ofP.foveata；B.壞疽病菌對照 Non-treatment control ofP.foveata；C.炭疽病菌處理 Treatment ofC.coccodes；D.炭疽病菌對照 Non-treatment control ofC.coccodes；E.枯萎病菌處理 Treatment ofF.avenaceum；F.枯萎病菌對照 Non-treatment control ofF.avenaceum

圖1262AG6對馬鈴薯3種病原真菌的抑制效果
Fig.1Inhibitoryeffectof262AG6on3speciesofpathogenicfungiinpotato

將262AG6繼代培養(yǎng)10代后與馬鈴薯炭疽病菌十字交織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)拮抗菌262AG6的抑菌效果在其繼代培養(yǎng)之后差異不顯著(P<0.05)，說明該拮抗菌株抑菌能力穩(wěn)定(表2)。將馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯壞疽病菌與262AG6進行對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)病原菌菌落生長受到顯著影響，顯微觀察發(fā)現(xiàn)菌絲正常生長也受到較為明顯的影響，表現(xiàn)為畸形，原生質外泄，菌絲產生泡囊、變形、扭曲(圖2)。

表2 繼代培養(yǎng)的262AG6對馬鈴薯炭疽病菌(C.coccodes)抑制效果Table 2 Inhibitory rate of subculture 262AG6 against C.coccodes

注：數(shù)值后小寫字母相同表示在 0.05 水平差異不顯著。

Note:Data followed by the same lowercase letters indicate no significant difference at 0.05 level.

A.壞疽病菌處理 Inhibit hyphoae ofP.foveata； B.壞疽病菌對照 Normal hyphoae ofP.foveata；C.炭疽病菌處理 Inhibit hyphoae ofC.coccodes； D.炭疽病菌對照 Normal hyphoae ofC.coccodes；E.枯萎病菌處理 Inhibit hyphoae ofF.avenaceum；F.枯萎病菌對照 Normal hyphoae ofF.avenaceum

圖2262AG6對病原真菌菌絲生長的干擾作用
Fig.2Effectof262AG6ongrowthofpathogenicfungusmycelium

2.2 262AG6生物學功能測定

溶磷能力測定結果顯示， 262AG6在Pikovaskaia平皿上培養(yǎng)8 d后產生明顯的溶磷圈，D/d的值為1.19，門金娜培養(yǎng)基上未形成溶磷圈；定量測定發(fā)現(xiàn)，菌株262AG6在Pikovaskaia培養(yǎng)液中有效磷增加量為1.01 mg·L-1，說明，該內生菌株對無機磷具有消溶能力，不能消溶有機磷。

定性測定產IAA能力，發(fā)現(xiàn)接入262AG6的處理組和對照組的King培養(yǎng)液的顏色都變?yōu)榧t色，說明262AG6能夠產IAA。PC曲線：y=0.042x-0.051(R2=0.914)；S2曲線 ：y=0.009x+0.719 (R2=0.989)；x代表IAA濃度，y代表OD530。定量研究表明，遵照PC曲線和S2曲線基準方程，菌株在2種培養(yǎng)液中培育12 d后，在King培養(yǎng)液不含色氨酸的情況下262AG6產生IAA的量為7.98 mg·L-1,在King培養(yǎng)液含100 mg·L-1色氨酸的情況下產生IAA的量為8.04 mg·L-1，色氨酸對262AG6生產IAA的量影響不顯著，說明，262AG6不依賴外源色氨酸即可合成IAA。

固氮能力測定結果顯示，262AG6可以在Ashby培養(yǎng)基上生長，連續(xù)培養(yǎng)3代后，262AG6也能在無氮培養(yǎng)基上生長并能使培養(yǎng)液變混濁，證明262AG6具有固氮能力。

2.3 262AG6的鑒定

2.3.1 形態(tài)特性 262AG6革蘭氏染色為陽性(圖3)，菌體桿狀，菌體為(1.63～3.65) μm×(0.38～0.95) μm。在28 ℃NA培養(yǎng)基上培育3 d 后，菌落類似圓形，直徑為6～8 mm，邊沿不規(guī)整，中間凸起，表形輪廓不平整，不透明，呈微乳黃色(圖4)。

圖3 262AG6革蘭氏染色Fig.3 262AG6 gram staining

圖4 262AG6在NA培養(yǎng)基上的菌落特征Fig.4 Colony morphology of 262AG6 on NA medium

2.3.2 DNA序列分析 提取262AG6的DNA，經(jīng)16S rDNA 和gyrB PCR擴增后產物經(jīng)凝膠電泳檢測，分別在1 500 bp和1 000 bp處有清晰PCR特異性條帶，將產物測序所得該菌株的16S rDNA序列堿基長為1 460 bp，gyrB序列堿基長為1 075 bp。

經(jīng)Blast相似性分析表明，菌株262AG6(Genbank登陸號：KF836523)與Genbank數(shù)據(jù)庫下載的Bacillusmethylotrophicus(KC79 0303)、Bacillusamyloliquefacienssub sp.Plantarum(JN700159)、Bacillustequilensis(HQ857764)、Bacillussubtilis(JQ900635)、Bacillustequilensisisolate NIO-Zn4(KJ847721.1)的相似度都在99%以上，運用 MEGA 5.0的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5，圖6)，發(fā)現(xiàn)其與Bacillusmethylotrophicus(KC790303)、Bacillusamyloliquefacienssub sp.Plantarum(JN700159)、Bacillustequilensis(HQ857764)、Bacillussubtilis(JQ900635) 等菌株的遺傳距離均小于0.000 5，確認262AG6(KF836523)為芽胞桿菌屬，但無法確認其屬內種的地位。

經(jīng)Blast相似性分析表明，262AG6與已報道的Bacillusamyloliquefaciens(JX014631.1)、Bacillusmethylotrophicus(CP003838.1)、Bacillusvelezensis(CP017747.1)、Bacillussubtilis(CP009749.1)種的同源相似性都在99%以上，結合形態(tài)特性和16S rDNA分析最終將其鑒定為解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens) 。

圖5 262AG6的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 16S rDNA phylogenetic tree of 262AG6

圖6 262AG6的gyrB系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 gyrB phylogenetic tree of 262AG6

3 討 論

植物內生細菌是大自然對植保工作者的饋贈，擁有極高的利用價值，相關的報道較多，如陳越渠等[16]從楊樹枝條上獲得的枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)對楊樹爛皮病的防控成果達85.4%和69.6%；趙龍飛等[17]從大豆根瘤菌中分離出的17株內生菌對稻瘟病菌具備抑菌功效；王涵琦等[18]發(fā)現(xiàn)ZHA10對馬鈴薯炭疽菌的平皿對峙控制率達72.62%；本研究顯示，262AG6對馬鈴薯炭疽菌的抑菌率達81.33%，并且該菌株抑菌譜較寬，對馬鈴薯、小麥、番茄等寄主植物的8病原菌的抑制率均高于50%，10代以內其繼代穩(wěn)定性良好，具有開發(fā)為生物農藥的潛質。

內生菌的產IAA、固氮和溶磷功能可能對植物有促生作用，暢濤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，珠芽蓼內生菌ZA1具有固氮和分泌生長素IAA功能，對馬鈴薯具有促生和增產的效果；262AG6在King培養(yǎng)液不含色氨酸的情況下產生IAA的量為7.98 mg·L-1，在含100 mg·L-1色氨酸的King培養(yǎng)基中分泌IAA的量為8.04 mg·L-1，且具有固氮和和溶解無機磷的能力，生物功能多樣化，有巨大的開發(fā)為微生物肥料的潛力，但其抑菌防控機制以及田間的實際防病促生成效還有待更深入的測驗。林玲等[20]研究認為，植物內生細菌對植物有防病促生的功能，這與本研究結果一致，說明，262AG6具備開拓成為防治馬鈴薯真菌病害的生物農藥和微生物菌肥的潛能。

4 結 論

高海拔地區(qū)牧草矮生嵩草的內生細菌262AG6對馬鈴薯多種病原真菌有明顯的抑制效果，而且該菌株的抑菌譜較廣，可以產IAA，溶解無機磷，有固氮能力，為G+，菌體大小為1.63～3.65 μm×0.38～0.95 μm。綜合形態(tài)特性、16S rDNA分析和gyrB DNA序列分析，將其鑒定為解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)。

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IdentificationandDeterminationofAntagonisticFunctionofEndophyticBacteria262AG6fromKobresiahumilisinAlpineGrassland

GUO Hai, YANG Chengde, YAO Yuling, CUI Yuezhen,NIU Xiaoli and XUE Li

(College of Plant Protection, Gansu Agricultural University, Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province,Lanzhou 730070, China)

In order to evaluate the biological control potential of endophytic bacteria 262AG6 isolated fromKobresiahumilisat alpine grassland, the inhibitory effects were studied by dual culture againstColletotrichumcoccodes, and the 262AG6 was identified by morphological characteristics and 16S rDNA sequence analysis.The results showed that the inhibition ratio of 262AG6 strain againstColletotrichumcoccodeswas as high as 81.33%, and also presented a higher stability and inhibitory effects on other species of pathogens.The secreted contents of IAA were 8.04 mg·L-1with 100 mg· L-1tryptophan on the King media and 7.98 mg·L-1without ryptophan, and the strain also had ability to dissolve inorganic phosphorus and to fix nitrogen.The thalli was rod-shaped, gram-positive and (1.63-3.65) μm×(0.38-0.95) μm in size.The 262AG6 was identified asBacillusamyloliquefaciensbased on 16S rDNA and gyrB DNA sequence analysis and the morphological characteristics.

Endophytic bacteria;Bacillusamyloliquefaciens; Inhibitory effects; Identification

2016-12-18

2017-03-15

The National Natural Science Foundation of China (No.31660148).

GUO Hai, male, master student.Research area:plant pathology.E-mail:guoh456@163.com

S43

A

1004-1389(2017)10-1529-08

日期：2017-10-18

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.032.html

2016-12-18

2017-03-15

國家自然科學基金(31660148)。

郭 海，男，在讀碩士，研究方向為植物病理學。E-mail:guoh456@163.com

楊成德，男，教授，碩士生導師，研究方向為植物病理學。E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

CorrespondingauthorYANG Chengde,male,professor,master supervisor.Research area:plant pathology. E-mail:yangcd@gsau.edu.cn

(責任編輯：郭柏壽Responsibleeditor:GUOBaishou)