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      EasyDisc法與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法檢測水中菌落總數(shù)的比較

      2022-03-10 08:21:44
      凈水技術(shù) 2022年3期
      關(guān)鍵詞:平皿計(jì)數(shù)法真值

      孫 杰

      (上海城市水資源開發(fā)利用國家工程中心有限公司,上海 200082)

      水中菌落總數(shù)作為常規(guī)微生物檢測項(xiàng)目之一,可以及時(shí)反映水體受微生物污染的程度。目前,國內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)大多以傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法作為水中菌落總數(shù)的主要檢測方法。但隨著細(xì)菌種類的不斷更新,傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法并不適用于檢測厭氧菌、非嗜中溫及對(duì)繁殖所需營養(yǎng)有特殊要求的細(xì)菌[1];在試驗(yàn)過程中因操作步驟復(fù)雜易引入污染;試驗(yàn)結(jié)果判定困難易造成較大的人為誤差,對(duì)試驗(yàn)技術(shù)人員和檢測環(huán)境要求極高,部分實(shí)驗(yàn)室難以達(dá)到。因此,不能滿足實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急樣品及大批量樣品的檢測需求。與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法相比,EasyDisc法具有操作簡便、外來污染及人為誤差小、無菌環(huán)境要求低等優(yōu)點(diǎn),且大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)EasyDisc法與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法在檢測水中菌落總數(shù)結(jié)果上無明顯差異。因此,該方法可以廣泛應(yīng)用于水中菌落總數(shù)的檢測。相較于2002年美國環(huán)保署(EPA)批準(zhǔn)使用酶底物法(SimPlate法)檢測飲用水以及地表水中的菌落總數(shù),傳統(tǒng)的平皿計(jì)數(shù)法已30余年未更新。2013年廣東省中山市供水有限公司最早將SimPlate法寫入廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)(DB44/T 1163—2013)[2]。2019年張穎[3]等采用定量盤法(HPC for quanti-tray)檢測水中菌落總數(shù),該方法在原理上與SimPlate法類似,與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法的檢測結(jié)果相比也沒有顯著差異,但其檢測時(shí)需要100 mL樣品,且要使用封口機(jī)和紫外燈等輔助設(shè)備,操作相對(duì)繁瑣。

      EasyDisc法于2021年研發(fā)成功,是一種新型的水中菌落總數(shù)檢測方法,目前在國內(nèi)外還處于試用階段。其基本原理是在EasyDisc平皿底部添加有顯色底物的脫水PCA培養(yǎng)基,微生物在該培養(yǎng)基上生長代謝時(shí)所產(chǎn)生的酶會(huì)促進(jìn)相應(yīng)顯色底物反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì),便于計(jì)數(shù),降低了結(jié)果判定的人為誤差。與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法相比,該方法無需配制培養(yǎng)基,檢測過程簡便,每個(gè)樣品前處理耗時(shí)不足1 min,顯著降低了外來污染和人為誤差,提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性,適用于應(yīng)急樣品及大批量樣品的檢測需求。

      本文采用傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法和新型檢測技術(shù)EasyDisc法兩種檢測方法對(duì)NSI定量質(zhì)控樣品和上海地區(qū)實(shí)際水樣進(jìn)行檢測,并比較分析兩種方法的檢測結(jié)果[4-5]。

      1 試驗(yàn)部分

      1.1 試驗(yàn)試劑及設(shè)備

      EasyDisc平皿、HPC定量質(zhì)控樣品(NSI 200317)、無菌PBS緩沖液、無菌取樣瓶等耗材由IDEXX公司提供。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;試驗(yàn)使用國產(chǎn)隔水式恒溫培養(yǎng)箱,溫控精度為±0.5 ℃,經(jīng)計(jì)量部門校準(zhǔn)合格。

      1.2 試驗(yàn)步驟

      1.2.1 水樣采集

      管網(wǎng)水水樣取自上海某地區(qū)的管網(wǎng)監(jiān)測點(diǎn),二次供水水樣為上海居民的龍頭水。參照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集與保存》(GB/T 5750.2—2006),選取一次性無菌采樣瓶(含硫代硫酸鈉)作為采樣容器,并在4 h內(nèi)對(duì)采集水樣進(jìn)行檢測[6-8]。

      1.2.2 質(zhì)控樣品制備

      將NSI定量質(zhì)控樣品從-10 ℃冰箱取出,在室溫下平衡10~15 min后,轉(zhuǎn)移至100 mL無菌PBS緩沖液中,水平振蕩搖勻,待NSI定量質(zhì)控樣品完全溶解后,30 min內(nèi)進(jìn)行檢測。

      1.2.3 質(zhì)控稀釋樣品制備

      將質(zhì)控樣品充分混勻后,取10 mL質(zhì)控樣品轉(zhuǎn)移至100 mL無菌取樣瓶中,用無菌水稀釋至刻度線,配制成稀釋10倍的質(zhì)控稀釋樣品溶液。

      1.2.4 平皿計(jì)數(shù)法測定水中菌落總數(shù)方法

      平皿計(jì)數(shù)法測定水中菌落總數(shù)參照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》(GB/T 5750.12—2006)[8]。

      1.2.5 EasyDisc法測定水中菌落總數(shù)方法

      量取1 mL待測樣品加入EasyDisc平皿,充分搖勻,使樣品均勻分布于整個(gè)平皿,在室溫下靜置20 min后正置放入(36±1) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(48±3) h后統(tǒng)計(jì)分析菌落總數(shù)結(jié)果。

      2 結(jié)果分析

      2.1 質(zhì)控樣品檢測結(jié)果分析

      分別以平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法平行檢測同一定量質(zhì)控樣品15次,其檢測結(jié)果表明兩種方法的檢測結(jié)果均在質(zhì)控樣品結(jié)果可接受范圍內(nèi)。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)兩種方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,計(jì)算檢測結(jié)果與真值的相對(duì)誤差,如表1、圖1所示。EasyDisc法檢測結(jié)果與真值的相對(duì)誤差更小,更接近于真值,準(zhǔn)確度更高;計(jì)算兩種方法相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差可得SD(平皿計(jì)數(shù)法)=5.84%,SD(EasyDisc法)=3.66%。綜上,EasyDisc法檢測結(jié)果與真值相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差更小,表明其與真值的相對(duì)誤差離散程度較小,性能更加穩(wěn)定。

      2.2 質(zhì)控稀釋樣品檢測結(jié)果分析

      為驗(yàn)證兩種方法在低濃度樣品檢測中的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,分別以平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法平行檢測同一稀釋10倍的定量質(zhì)控樣品15次,其檢測結(jié)果如表2、圖2所示。結(jié)果表明:平皿計(jì)數(shù)法合格率為80%,EasyDisc法合格率為100%;EasyDisc法檢測結(jié)果與真值的相對(duì)誤差更小,更接近于真值,準(zhǔn)確度更高;兩種方法檢測結(jié)果與真值相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差為SD(平皿計(jì)數(shù)法)=14.31%,SD(EasyDisc法)=9.28%。綜上,EasyDisc法檢測低濃度樣品的準(zhǔn)確性更高,性能更穩(wěn)定。

      表1 兩種方法檢測質(zhì)控樣品的結(jié)果Tab.1 Detection Results of QC Samples by Both Methods

      圖1 兩種方法檢測結(jié)果真值的相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.1 Standard Deviation of Relative Error between Test Samples and True Values by Both Methods

      2.3 實(shí)際樣品檢測結(jié)果分析

      選取上海地區(qū)30組管網(wǎng)水樣品及50組二次供水樣品,分別以平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法檢測選取的80組實(shí)際樣品,其檢測結(jié)果如表3所示。為探究兩種方法在實(shí)際樣品檢測中的相關(guān)性,根據(jù)檢測數(shù)據(jù)繪制折線圖,如圖3所示。結(jié)果表明:兩種方法的檢測結(jié)果趨勢基本相同,具有很強(qiáng)的相關(guān)性。

      表2 兩種方法檢測質(zhì)控稀釋樣品的結(jié)果Tab.2 Detection Results of QC Dilution Samples by Both Methods

      圖2 兩種方法檢測結(jié)果真值的相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig.2 Standard Deviation of Relative Error between Test Samples and True Values by Both Method

      為進(jìn)一步探究兩種方法在檢測實(shí)際樣品時(shí)是否存在差異性,以及使檢測結(jié)果呈正態(tài)分布,將運(yùn)用SPSS Statistics軟件對(duì)平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法的檢測結(jié)果,作對(duì)數(shù)處理后進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,結(jié)果如表4所示。平皿計(jì)數(shù)法與EasyDisc法的泊松相關(guān)系數(shù)為0.894,屬極強(qiáng)相關(guān)性;t檢驗(yàn)P=0.325(>0.05),說明兩種檢測方法的檢測結(jié)果無顯著差異,具有高度一致性??烧J(rèn)為平皿計(jì)數(shù)法、EasyDisc法均可有效檢測水中菌落總數(shù)。

      表3 兩種方法檢測實(shí)際樣品的結(jié)果Tab.3 Detection Results of Practical Samples by Both Methods

      圖3 兩種方法檢測實(shí)際樣品的結(jié)果Fig.3 Detection Results of Practical Samples by Both Methods

      3 討論

      3.1 質(zhì)控樣品檢測

      平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法對(duì)HPC定量質(zhì)控樣品檢測結(jié)果的真值相對(duì)誤差絕對(duì)值的平均值分別為6.27%和3.02%。EasyDisc法檢測HPC定量質(zhì)控結(jié)果的真值相對(duì)誤差相較于平皿計(jì)數(shù)法的真值相對(duì)誤差更小,表明EasyDisc法的檢測結(jié)果更接近真值,準(zhǔn)確度更高。與真值相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算結(jié)果表明,EasyDisc法與真值相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差更小,其檢測結(jié)果與真值的相對(duì)誤差離散程度較小,性能更加穩(wěn)定。

      表4 兩種方法對(duì)實(shí)際樣品檢測結(jié)果的t檢驗(yàn)Tab.4 T-Test of Results of Practical Sample by Both Methods

      3.2 質(zhì)控稀釋樣品檢測

      平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法對(duì)稀釋10倍的低濃度HPC定量指控樣品檢測結(jié)果的真值相對(duì)誤差絕對(duì)值的平均值分別為11.98%和8.86%;平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法的檢測合格率分別為80%和100%。EasyDisc法檢測HPC稀釋10倍的低濃度定量質(zhì)控結(jié)果的真值相對(duì)誤差相較于平皿計(jì)數(shù)法的真值相對(duì)誤差更小、合格率更高,表明在低濃度的情況下EasyDisc法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確度仍優(yōu)于平皿計(jì)數(shù)法。

      3.3 實(shí)際樣品檢測

      對(duì)管網(wǎng)水和二次供水等實(shí)際樣品,平皿計(jì)數(shù)法和EasyDisc法的檢測結(jié)果泊松相關(guān)系數(shù)為0.893,屬極強(qiáng)相關(guān)性,t檢驗(yàn)P為0.325(>0.05),表明兩種方法檢測數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上無顯著差異,均可檢測水中菌落總數(shù)。

      3.4 EasyDisc法優(yōu)勢

      EasyDisc法于2021年研發(fā)成功,是一種新型的水中菌落總數(shù)檢測方法,對(duì)傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法進(jìn)行了顯著革新,相較于傳統(tǒng)的90 mm平皿,其47 mm的平皿既能減少廢棄物處理的成本又能增加實(shí)驗(yàn)室檢測量。其PCA培養(yǎng)基已脫水固定于平皿底部,省去傳統(tǒng)方法中配置培養(yǎng)基的過程,節(jié)省大量時(shí)間的同時(shí)減少了配置培養(yǎng)基帶來的污染。EasyDisc法產(chǎn)品的1年保質(zhì)期,在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)室管理流程的同時(shí),也降低了相應(yīng)耗材的浪費(fèi)。在PCA培養(yǎng)基中添加顯色底物,與微生物生長代謝所產(chǎn)生的酶相互反應(yīng)形成藍(lán)色菌落,配合白色底部及網(wǎng)格線更加便于觀察,降低人為計(jì)數(shù)誤差。同時(shí),通過大量數(shù)據(jù)分析水中菌落總數(shù)檢測干擾菌種,添加雜菌生長抑制劑,使PCA培養(yǎng)基對(duì)檢測環(huán)境要求大幅降低。與傳統(tǒng)平皿計(jì)數(shù)法相比,EasyDisc法測定質(zhì)控樣品及質(zhì)控稀釋樣品時(shí),準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性均優(yōu)于傳統(tǒng)的平皿計(jì)數(shù)法;測定實(shí)際樣品時(shí),其檢測結(jié)果與平皿計(jì)數(shù)法無顯著差異,但因EasyDisc法無需制備培養(yǎng)基,操作更加簡便,對(duì)無菌環(huán)境及檢測人員技術(shù)無明顯要求等優(yōu)勢,更適用于大批量樣品及應(yīng)急突發(fā)樣品的檢測。

      4 結(jié)論

      (1)平皿計(jì)數(shù)法測定水中菌落總數(shù),配制培養(yǎng)基操作繁瑣,要求嚴(yán)格;使用高溫滅菌設(shè)備需相應(yīng)資格證;試驗(yàn)結(jié)果讀數(shù)人為誤差大。因此,平皿計(jì)數(shù)法不能滿足實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急樣品及大批量樣品檢測的需求。EasyDisc法無需配制培養(yǎng)基,每個(gè)樣品前處理耗時(shí)不足1 min,檢測過程簡便,顯著降低了外來污染和人為誤差,且在實(shí)際樣品檢測中可以發(fā)現(xiàn)其檢測結(jié)果與平皿計(jì)數(shù)法無明顯差異。

      (2)采用EasyDisc法測定水中菌落總數(shù),具有操作更加簡便、人為誤差少、計(jì)數(shù)便捷、對(duì)試驗(yàn)技術(shù)人員及試驗(yàn)環(huán)境要求低等優(yōu)勢,其質(zhì)控樣品與真值相對(duì)誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.66%,低于平皿計(jì)數(shù)法的5.84%,質(zhì)控稀釋樣品的合格率為100%,高于平皿計(jì)數(shù)法的80%,表明其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性均優(yōu)于傳統(tǒng)的平皿計(jì)數(shù)法,可以滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)水中菌落總數(shù)的檢測要求。同時(shí),該方法在應(yīng)急突發(fā)樣品現(xiàn)場檢測方面也有很大的應(yīng)用前景。

      (3)鑒于EasyDisc法測定水中菌落總數(shù)操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、實(shí)驗(yàn)室檢測環(huán)境要求及采購設(shè)備成本低,更適用于中小型實(shí)驗(yàn)室在大批量樣品及應(yīng)急突發(fā)樣品的檢測,在未來必將成為一種發(fā)展趨勢。

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