鄭恬恬 王小琴

慢性間歇性低氧條件下大鼠齦溝液中牙齦卟啉單胞菌的變化

鄭恬恬 王小琴

目的探討間歇性低氧條件下大鼠齦溝液中牙齦卟啉單胞菌的變化。方法將32 只6 周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分成4 組(n=8):常氧對(duì)照組(A組)、常氧牙周炎組(B組)、間歇性低氧組(C組)、間歇性低氧合并牙周炎組(D組)。用正畸結(jié)扎絲結(jié)扎雙側(cè)上頜第二磨牙頸部和高糖飲食方法建立牙周炎模型，常氧和低氧組分別在常氧和模擬阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征條件下飼養(yǎng)8 周，采集大鼠實(shí)驗(yàn)牙齦溝液標(biāo)本，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌的變化。結(jié)果所有的大鼠均檢出牙齦卟啉單胞菌。D組牙齦卟啉單胞菌的量明顯高于其他3 組(P<0.05)； B組牙齦卟啉單胞菌的量高于A組(P<0.05)。結(jié)論慢性間歇性低氧可加重牙周炎病程，與齦溝液中牙齦卟啉單胞菌的增加有關(guān)。

慢性間歇性低氧; 牙周炎; 牙齦卟啉單胞菌; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)指睡覺(jué)期間上呼吸道周期性地部分或全部塌陷，導(dǎo)致呼吸暫停、低通氣、睡覺(jué)中斷等[1]。慢性牙周炎(CP)主要由革蘭氏陰性桿菌引起的牙周支持組織的慢性炎癥[2]。研究表明OSAHS和CP有著共同的危險(xiǎn)因素：如年齡、性別、肥胖、吸煙、喝酒、糖尿病和口呼吸等[3-4]。越來(lái)越多研究表明OSAHS是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，包括高血壓、充血性心力衰竭、心肌梗塞、心律失常和腦中風(fēng)[1]。同樣，已有學(xué)者證明牙周致病菌能夠進(jìn)入血液循環(huán)，從而導(dǎo)致全身系統(tǒng)性疾病，如冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等[4]。這兩種疾病可能存在潛在的共同發(fā)病機(jī)制，已有證據(jù)表明OSAHS患者CP的發(fā)病率明顯增高[5-7]，但兩者潛在的發(fā)病機(jī)制尚不明確。牙齦卟啉單胞菌(Pg)是目前公認(rèn)的牙周炎主要致病菌之一，有關(guān)Pg在兩者關(guān)系中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立模擬OSAHS的間歇低氧條件下的大鼠牙周炎模型[8-9]，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Pg的變化，從微生物角度來(lái)探討OSAHS和CP之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器

清潔級(jí)6 周齡健康雄性SD大鼠32 只(山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供);間歇性低氧艙(太原市有機(jī)玻璃廠);15號(hào)吸潮紙尖(北京達(dá)雅鼎醫(yī)療器械公司)；微量樣品基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；2×Taq PCR Master Mix (中科瑞泰生物科技有限公司)；PCR儀(杭州搏日科技有限公司);DNA凝膠回收試劑盒、小劑量快速質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Omega公司,美國(guó))；pEASY-T5 Zero Cloning Kit(含DH5α感受態(tài)細(xì)胞)(北京全式金試劑有限公司)；2× SYBR Green qPCR Master Mix(biotool.com)熒光定量PCR儀(7500型,ABI公司,美國(guó))。

1.2 動(dòng)物分組及建模

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 32 只雄性大鼠，體重約200 g，隨機(jī)分成4組，常氧對(duì)照組(A組)、常氧牙周炎組(B組)、間歇性低氧組(C組)、間歇性低氧合并牙周炎組(D組)，每組8 只。

1.2.2 各組動(dòng)物模型建立 A組：正常氧環(huán)境，常規(guī)飼料喂養(yǎng); B組：10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，用0.2 mm正畸結(jié)扎絲結(jié)扎于雙側(cè)上頜第二磨牙牙頸部，高糖飲食(100 g飼料中含56 g蔗糖，28 g全脂奶粉， 6 g全麥粉, 4 g酵母粉， 1 g肝粉， 2 g食鹽，3 g新鮮蔬菜)，正常氧環(huán)境; C組：動(dòng)物放入低氧艙內(nèi)(用氧濃度監(jiān)測(cè)儀在低氧艙里進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，保持低氧艙內(nèi)氧濃度為9%～21%。低氧艙設(shè)置：通氮?dú)?0 s，缺氧25 s， 通氧氣25 s， 2 min為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù))模擬OSAHS患者缺氧環(huán)境，每日間歇缺氧8 h。常規(guī)飼料喂養(yǎng); D組：牙周處理同B組，缺氧條件同C組。

1.3 樣本采集

大鼠飼養(yǎng)8 周時(shí)，麻醉下固定，用無(wú)菌刮匙去除每只大鼠右上第二磨牙頰側(cè)齦上菌斑，無(wú)菌棉球隔濕，干燥，用15號(hào)滅菌吸潮紙尖直接插入牙周袋底，靜置30 s， 紙尖立即置入1.5 ml EP管中，PBS緩沖液200 μl， -20 ℃凍存待用。

1.4 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)Pg的變化

1.4.1 提取目的DNA 取A組一個(gè)樣本，按照微量樣品基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明操作,提取DNA。

1.4.2 引物的設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[8]，Pg的特異性引物，根據(jù)細(xì)菌16Sr RNA基因特異保守區(qū)域設(shè)計(jì)，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成(表 1)。

表 1 Pg引物序列及相關(guān)信息

1.4.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備Pg部分基因片段的擴(kuò)增: PCR反應(yīng)體系為：2×Master Mix: 10 μl，上游引物：0.8 μl，下游引物：0.8 μl， DNA模板：2 μl， 水：補(bǔ)足至20 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 5 min， 變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 25 s， 35 個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，延伸72 ℃ 5 min， 4 ℃保存，反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，由北京金諾銳杰基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

連接轉(zhuǎn)化: 按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明操作對(duì) PCR產(chǎn)物純化回收。純化產(chǎn)物與載體連接，在微型離心管中依次加入純化回收的目的DNA片段4 μl、 pEASY-T5 Zero Cloning Vector 1 μl，輕輕混合，室溫反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。加連接產(chǎn)物于50 μl Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴25 min， 42 ℃熱激30 s， 冰浴2 min， 加250 μl LB液體培養(yǎng)基200 r/min、 37 ℃孵育1 h，取200 μl菌液鋪板，培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單菌落白斑，放入50 ml LB液體培養(yǎng)基， 37 ℃， 200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

質(zhì)粒提取及濃度測(cè)定: 重組質(zhì)粒測(cè)序成功后，使用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，濃度為376.2 ng/μl。 利用以下公式計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)：(6.02×1023)×(ng/μl×10-9)/DNA長(zhǎng)度 ×660=拷貝數(shù)/μl，得7.876×1010拷貝數(shù)/μl。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立: 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)10 倍稀釋至103～1010拷貝/μl，作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系如下：2×Biotool SYBR Green Master Mix(LowRox)10 μl, Template 100 ng, Forward Primer 1 μl, Reverse Primer 1 μl, Distilled Water(dH2O) Addto M 20 μl。

按照如下參數(shù)設(shè)置反應(yīng)：95 ℃ 5 min一個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s， 95 ℃ 15 s，進(jìn)行1 個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光值的變化規(guī)律，系統(tǒng)自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。

1.4.4 熒光絕對(duì)定量PCR測(cè)定樣品中Pg的量 依照上述反應(yīng)體系將樣品提取的DNA與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中Pg的拷貝數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，多個(gè)樣本間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因部分片段擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的基因克隆產(chǎn)物結(jié)果如圖 1所示。 從圖中可以看出， 3 個(gè)目的基因泳道只有1 條亮帶，通過(guò)與DNAMaker 對(duì)比得知，目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期產(chǎn)物片段大小相符合，無(wú)非特異條帶產(chǎn)生，所得擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性目的片段。

Pg測(cè)序結(jié)果顯示，與NCBI公布的已知序列相似度為100%，測(cè)序結(jié)果比對(duì)圖 2。

M： DNA標(biāo)志; 1-3：Pg目的DNA片段; 4： 空白對(duì)照

圖 1PgPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

M： DNA Maker； 1-3： Target DNA； 4： Blank control

Fig 1PgPCR amplification product electrophoresis

圖 2 測(cè)序結(jié)果

2.2 目的基因絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，根據(jù)質(zhì)粒濃度梯度與Ct值之間的關(guān)系，系統(tǒng)輸出標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。溶解曲線如圖 3，表現(xiàn)為單一的峰，說(shuō)明擴(kuò)增過(guò)程中沒(méi)有非特異性產(chǎn)物。如圖 4標(biāo)準(zhǔn)曲線能反映未知樣品的拷貝數(shù)。

所有的大鼠均能檢出Pg， 檢出量如表 2。 D組Pg的量明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； B組的Pg量高于A組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖 3 溶解曲線

圖 4 Pg標(biāo)準(zhǔn)曲線

Tab 2 Pg detectable quantity(copies/μl, ±s)

注： ④與①、②、③相比，P<0.05; ③與②相比，P<0.05; ①與②相比，P<0.05

3 討 論

慢性牙周炎是細(xì)菌引起的牙周組織的感染性疾病。許多證據(jù)表明OSAHS和CP是有關(guān)系的[3-7]，但是也有研究表明OSAHS和CP關(guān)系的證據(jù)不充分，OSAHS和CP之間的因果關(guān)系值得討論，有待進(jìn)一步研究[5]。而Pg是牙周病，尤其是慢性牙周炎病變區(qū)域或活動(dòng)部位最主要的優(yōu)勢(shì)菌，其存在與牙周炎治療后復(fù)發(fā)或病情加重有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)MOSAHS的間歇低氧條件下的大鼠牙周炎模型，從微生物角度來(lái)探討OSAHS和CP之間的關(guān)系。

齦下菌斑樣本采集方法是影響微生物檢測(cè)結(jié)果的重要因素之一。目前大多數(shù)學(xué)者主要采用紙尖法或刮匙法采集齦下菌斑，2 種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。紙尖法，操作容易簡(jiǎn)單，相對(duì)可以標(biāo)準(zhǔn)化，主要采集的是齦下非附著區(qū)菌斑，且對(duì)齦下微生態(tài)環(huán)境影響較小，重復(fù)性好；但難到達(dá)牙周袋底部，并且紙尖表面積較小，所采集到的菌斑量有限。刮匙法可到達(dá)牙周袋底部，并且采集菌斑量較多，但此法采集到的主要是齦下根面 附著區(qū)菌斑；且此法對(duì)齦下微生態(tài)系統(tǒng)的干擾較大。研究表明紙尖法和刮匙法均為較準(zhǔn)確的方法[10]。綜合2 種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用紙尖法。

細(xì)菌定量檢測(cè)的方法很多，如細(xì)菌培養(yǎng)、DNA探針等，但這些方法都有一定局限性。如細(xì)菌培養(yǎng)法敏感性低，計(jì)數(shù)結(jié)果不精確，而Pg屬于難培養(yǎng)的革蘭陰性厭氧菌，培養(yǎng)鑒定極為困難。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)定量分析技術(shù)，具有反應(yīng)迅速，精確性高，敏感性強(qiáng)，是應(yīng)用于牙周領(lǐng)域相關(guān)研究的重要手段[11]。

本實(shí)驗(yàn)D組Pg的量明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組Pg的量高于A組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與羅麗 等[12]學(xué)者模擬高原缺氧環(huán)境對(duì)家兔慢性牙周炎齦下菌群種類分布得出一致結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論OSAHS和CP有一定的關(guān)系，這可能與低氧狀態(tài)下Pg等致病菌的增殖有關(guān)。

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ThechangeofPorphyromonasgingivalisinratgingivalcrivicularfluidunderchronicintermittenthypoxia

ZHENGTiantian1,WANGXiaoqin2.

1. 030000Taiyuan，ShanxiMedicalUniversity,China； 2.TheFirstClinicalHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan

Objective: To study the change ofPorphyromonasgingivalis(P.gingivalis) in rat gingival crivicular fluid(GCF) under chronic intermittent hypoxia.Methods32 male SD rats were randomly divided into 4 groups(n=8): normoxia control group(A), normoxia with periodontitis group(B), intermittent hypoxia group(C), and intermittent hypoxia with periodontitis(D). Periodontitis model was established by orthodontic silk ligation at the maxillary second molar neck and high sugar diet. The rats in normoxia and hypoxia group were raised respectively under the condition of ordinary oxygen and chronic intermittent hypoxia respectively. After 8 weeks, GCF of the target teeth was collected,P.gingivaliswas quantified by real-time fluorescent quantitative PCR.ResultsP.gingivaliswas detected in all groups.P.gingivalisin group D was more than in other groups(P<0.05); meanwhile,P.gingivalisin group B was more than in group A(P<0.05).ConclusionChronic intermittent hypoxia can aggravate the severity of periodontitis, which is associated with the increase ofP.gingivalisin GCF.

Chronicintermittenthypoxia;Periodontitis;Porphyromonasgingivalis;Real-timePCR

山西省自然科學(xué)基金(編號(hào)： 2014011046-2)

030000 太原， 山西醫(yī)科大學(xué)(鄭恬恬)； 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院(王小琴)

王小琴 E-mail： wangxiaoqin2009@yeah.net

R781.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.002

(收稿： 2016-11-12 修回： 2017-03-25)