李 瑾，王 露，丁茂鵬，彭圓濤

陜西中醫(yī)藥大學(xué) (咸陽(yáng) 712046)

大孔樹(shù)脂聯(lián)合聚酰胺法純化牛蒡根總黃酮工藝的研究*

李 瑾，王 露，丁茂鵬，彭圓濤

陜西中醫(yī)藥大學(xué) (咸陽(yáng) 712046)

目的：使用大孔樹(shù)脂聯(lián)合聚酰胺法進(jìn)行牛蒡根總黃酮的純化工藝研究。方法：將牛蒡根總黃酮的粗提物用大孔樹(shù)脂和聚酰胺先后進(jìn)行純化。結(jié)果：用大孔樹(shù)脂純化黃酮時(shí)：用內(nèi)徑30 mm的層析柱以徑長(zhǎng)比1∶7裝柱。將400 ml的上樣液(濃度為10 mg/ml)，以0.5 BV/h的流速上樣,用30%的乙醇以1.5 BV/h的流速進(jìn)行洗脫(此時(shí)洗脫效果最佳)。聚酰胺純化時(shí)用內(nèi)徑15 mm的層析柱以徑長(zhǎng)比1∶8裝柱。用20 ml的上樣液(濃度為1.5 mg/ml,PH為2)，以流速為0.5 BV/h上樣,用70%乙醇以4 BV/h的流速進(jìn)行洗脫(此時(shí)洗脫效果最佳)。結(jié)論：牛蒡根粗品總黃酮含量為7%，在最佳工藝條件下，經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后，其總黃酮含量達(dá)到55.86%，再經(jīng)過(guò)聚酰胺進(jìn)一步純化后，其總黃酮含量達(dá)到80.75%。

牛蒡根為桔梗目、菊科、牛蒡?qū)僦参锱］?Arctium lappa L.)干燥的根,有祛風(fēng)熱，消腫毒之功。牛蒡根中不僅富含蛋白質(zhì)，糖類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)成分[1]，還富含大量藥效成分如有機(jī)酸類(lèi)，多酚類(lèi)，黃酮類(lèi)等[2]。黃酮類(lèi)是大多數(shù)中藥都含有的成分，具有多種治療功效，其具體的功效也因藥物的不同而不同[3]。為了研究牛蒡根中黃酮的作用功效，需對(duì)牛蒡根的提取物進(jìn)行分離純化。目前研究牛蒡根有效成分提取工藝的較多，但研究有效成分純化工藝的相對(duì)較少。有人[4]通過(guò)大孔樹(shù)脂對(duì)不同條件下甘草總黃酮的靜態(tài)與動(dòng)態(tài)吸附與解析情況的研究，確定了大孔樹(shù)脂純化槲寄生總黃酮的最佳純化工藝。有人[5]通過(guò)聚酰胺在不同條件下對(duì)枳實(shí)總黃酮的動(dòng)態(tài)與靜態(tài)吸附與解析情況的考察，確定了聚酰胺純化枳實(shí)總黃酮的最佳工藝條件。

大孔樹(shù)脂理化性質(zhì)穩(wěn)定是一種極性吸附劑，所以在分離純化領(lǐng)域被廣泛的應(yīng)用。聚酰胺近年來(lái)也被廣泛用于中藥成分的分離純化，尤其對(duì)于酚類(lèi)，黃酮類(lèi)的純化效果極為顯著[6-8]。聚酰胺分離純化黃酮類(lèi)成分，主要是利用黃酮類(lèi)成分中的羥基易于與聚酰胺樹(shù)脂結(jié)合成氫鍵，從而能有效地吸附黃酮類(lèi)成分的特點(diǎn)將其分離純化。目前，對(duì)與大孔樹(shù)脂聯(lián)合聚酰胺法純化中藥成分的方法鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用將大孔樹(shù)脂與聚酰胺樹(shù)脂聯(lián)合的方法對(duì)牛蒡根總黃酮進(jìn)行了純化，得到了相當(dāng)不錯(cuò)的收率。該實(shí)驗(yàn)方法對(duì)于采用樹(shù)脂純化總黃酮類(lèi)成分的研究具有重要意義，既提高了純化過(guò)程中總黃酮的含量，又保證了純化過(guò)程的經(jīng)濟(jì)效益，為牛蒡根總黃酮的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)原料 牛蒡根:由陜西康盛堂中藥飲片廠提供。

2 實(shí)驗(yàn)試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(分析純，上海永葉生物科技有限公司);大孔樹(shù)脂(LS-46D，臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠);聚酰胺樹(shù)脂(分析純，臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠);無(wú)水乙醇(分析純，上海瀚思化工有限公司)。

3 實(shí)驗(yàn)儀器 RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);UV2550型紫外可見(jiàn)分光光度儀(深圳市凱銘杰儀器設(shè)備有限公司)；FA2104N型電子分析天平(濟(jì)南普納儀器設(shè)備有限公司)。

4 牛蒡根粗品的制備[9-10]取經(jīng)粉碎過(guò)篩后的牛蒡根粗粉20 g，加入60%乙醇160 ml，浸泡30 min后在85℃下回流提取40 min，重復(fù)3次，合并濾液，抽濾，將濾液濃縮至15 ml，石油醚脫脂，干燥。

5 牛蒡根總黃酮含量的測(cè)定[11]

5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取超聲溶于60%乙醇中的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，定容至25 ml。液體配液按下表進(jìn)行。移入標(biāo)準(zhǔn)品后再分別移入60%乙醇至5 ml。分別移入NaNO20.3 ml，反應(yīng)6 min后分別移入Al(NO3)30.3 ml,反應(yīng)6 min后移入氫氧化鈉反應(yīng)15 min，最后移入60%乙醇0.4 ml，用手搖均勻，然后在波長(zhǎng)為510 nm測(cè)物質(zhì)吸光度并繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

求得線性回歸方程Y=6.1342X-0.00607，R2=0.99979，線性關(guān)系良好。

5.2 總黃酮含量的測(cè)定:把純化后的牛蒡根黃酮樣品精密稱(chēng)取5.0 mg，超聲溶解，然后在25 ml容量瓶中定容,按以上配液方法配液，測(cè)出吸光度，用線性回歸曲線求得樣品濃度來(lái)計(jì)算牛蒡根總黃酮的含量。

6 大孔樹(shù)脂的初步純化

6.1 大孔樹(shù)脂的選擇[12]：分別稱(chēng)取大孔樹(shù)脂NKA-9、AB-8、D101、LS-46D 各4 g于四個(gè)燒杯中，分別加入牛蒡根總黃酮粗品溶液(濃度為10 mg/ml，體積為400 ml)，于溫度恒定的情況下振蕩4 h，每間隔1 h取一樣品并分別測(cè)其吸光度值，并算得吸附量。待上述吸附完成后，過(guò)濾除去殘留液，加入30%乙醇50 ml，溫度恒定的情況下振蕩4 h，測(cè)總黃酮的含量，算得解析率，并在相同的條件下測(cè)其在60%，90%乙醇中的解析率。

6.2 純化工藝的優(yōu)化[13]

6.2.1 徑長(zhǎng)比對(duì)純化效果的影響:把經(jīng)過(guò)處理過(guò)的大孔樹(shù)脂濕法裝柱在內(nèi)徑為3 cm的層析柱中，使其徑長(zhǎng)比分別為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，制得6份牛蒡根粗品溶液，體積為400 ml,濃度為10 mg/ml，上樣的流速為0.5 BV/h，洗脫的流速為1.5 BV/h。

在一定范圍內(nèi)徑長(zhǎng)比越大，黃酮含量越高，超過(guò)一定范圍黃酮含量下降，實(shí)驗(yàn)表明在徑長(zhǎng)比為1∶8時(shí)黃酮含量最大，因此裝柱徑長(zhǎng)比為1∶8較合適。

表1 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附(mg/g)

表2 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)解析率

由表1中數(shù)據(jù)可知LS-46D靜態(tài)吸附率最高可達(dá)315.37 mg/g，表2數(shù)據(jù)顯示其靜態(tài)解析率最高可達(dá)86.87%，在這四種樹(shù)脂中均為最高，因此LS-46D為優(yōu)選樹(shù)脂。

6.2.2 上樣量對(duì)泄露率的影響:取牛蒡根黃酮粗品放入燒杯中，配成10 mg/ml的上樣液，進(jìn)行上樣，上樣流速為以0.5 BV/h。每上100 ml上樣液取一次樣測(cè)其黃酮含量，并計(jì)算泄漏率。

當(dāng)上樣量越大，泄漏率呈不同程度增長(zhǎng)，當(dāng)超過(guò)400 ml時(shí)，泄漏率超過(guò)10%，并且增長(zhǎng)速度加快，因此確定最佳上樣量為400 ml。

6.2.3 上樣流速對(duì)泄漏率的影響:配制牛蒡根總黃酮粗品溶液5份，濃度為10 mg/ml，分別控制上樣流速為0.25 BV/h、0.5 BV/h、0.75 BV/h、1.0 BV/h，以0.5 BV/h流速洗脫。

上樣流速和泄露率呈線性關(guān)系，當(dāng)上樣流速超過(guò)0.5 BV/h時(shí)，泄漏率超過(guò)10%。因此以0.5 BV/h流速上樣效果最佳。

6.2.4 洗脫劑濃度和純化效果的影響關(guān)系: 用不同濃度的乙醇(15%、30%、45%、60%、75%)洗脫牛蒡根總黃酮粗品溶液(10 mg/ml)5份，以，結(jié)果如圖1所示。 由圖可見(jiàn)，洗脫效果最佳點(diǎn)在用30%乙醇洗脫時(shí)，此時(shí)總黃酮含量最高。

6.2.5 洗脫流速對(duì)純化效果的影響:取5份已經(jīng)配好的牛蒡根總黃酮粗品溶液，流速都控制在0.5 BV/h，上樣，以不同的流速0.5 BV/h、1.0 BV/h、1.5 BV/h、2.0 BV/h、2.5 BV/h洗脫，測(cè)其吸光度，算得解析率結(jié)果如下圖2所示。

由圖可知，流速控制在1.5 BV/h時(shí)比較合適，因?yàn)樵?.5 BV/h流速洗脫解析率最高。

7 聚酰胺樹(shù)脂的二次純化

7.1 聚酰胺的活化及再生：聚酰胺的活化步驟為，取新聚酰胺樹(shù)脂用無(wú)水乙醇處置后，用水洗到?jīng)]有醇味，抽干備用。

聚酰胺的再生：先用5%NaOH將用過(guò)的聚酰胺樹(shù)脂洗至無(wú)色，然后再用5%NaOH浸泡3 d，水洗至PH為7。

7.2 上樣液的配制：取經(jīng)純化過(guò)的，濃度為55.86%的牛蒡根黃酮30 mg,配成20 ml 1.5 mg/ml的溶液，并調(diào)節(jié)PH為2。

7.3 聚酰胺樹(shù)脂精選工藝的優(yōu)化

7.3.1 泄漏曲線的繪制:取純化過(guò)的牛蒡根黃酮適量，配成濃度為1.5 mg/ml的溶液，調(diào)節(jié)pH=2，以1.5 BV/h流速上樣，從10 ml開(kāi)始，每5 ml收集一次，測(cè)牛蒡根總黃酮的含量，繪制泄露曲線。

當(dāng)上樣量大于20 ml時(shí)，泄漏率超過(guò)10%，此時(shí)吸附的經(jīng)初步純化過(guò)的黃酮的量為30 mg。相當(dāng)于每毫升聚酰胺樹(shù)脂吸附1.42 mg。

7.3.2 上樣液pH的優(yōu)化:取經(jīng)大孔樹(shù)脂純化過(guò)的牛蒡根黃酮，配成20 ml 1.5 mg/ml的上樣液5份，調(diào)節(jié)pH使分別為1、2、3、4、5，以1.5 BV/h流速上樣，用70%乙醇以4 BV/h的流速洗脫。洗脫結(jié)果如圖3所示。由圖可知，pH最好控制在2，因?yàn)楫?dāng)pH=2時(shí)洗脫效果最好。

7.3.3 上樣濃度的優(yōu)化:取純化過(guò)的牛蒡根黃酮，配制20 ml成濃度分別為1.0 mg/ml、1.25 mg/ml、1.5 mg/ml、1.75 mg/ml、2.0 mg/ml的上樣液5份，使pH=2，以1.5 BV/h的流速上樣。上樣濃度最好控制為1.5 mg/ml較好，否則會(huì)出現(xiàn)堵塞情況。

7.3.4 洗脫劑濃度的優(yōu)化:取經(jīng)大孔樹(shù)脂純化過(guò)的牛蒡根黃酮30 mg，配成8份濃度為1.5 mg/ml，體積為20 ml 的上樣液,調(diào)節(jié)PH=2，以1.5 BV/h上樣，分別用不同濃度的乙醇以4 BV/h洗脫，控制乙醇濃度梯度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。用70%乙醇洗脫洗脫效果最佳，因?yàn)榇藭r(shí)總黃酮含量最高。

7.3.5 洗脫流速的優(yōu)化:取經(jīng)大孔樹(shù)脂純化過(guò)的牛蒡根黃酮30 mg配成1.5 mg/ml的上樣液4份，并調(diào)節(jié)PH為2，以1.5 BV/h流速上樣,分別以3 BV/h、4 BV/h、5 BV/h、6 BV/h流速進(jìn)行洗脫，計(jì)算解析率并測(cè)吸光度，結(jié)果如圖4所示。如圖以4 BV/h流速洗脫為宜。

討 論

本實(shí)驗(yàn)先采用大孔樹(shù)脂將牛蒡根總黃酮進(jìn)行了純化，當(dāng)以最優(yōu)工藝純化總黃酮含量7%的牛蒡根粗品時(shí)可使總黃酮濃度達(dá)到55.86%。用大孔樹(shù)脂LS-46D以1∶8的徑長(zhǎng)比裝住，以0.5 BV/h的流速上樣,用30%乙醇以1.5 BV/h的流速洗脫時(shí)純化工藝最優(yōu)。接下來(lái)用聚酰胺對(duì)牛蒡根黃酮進(jìn)行了二次純化。當(dāng)用最佳工藝條件純化牛蒡根黃酮可使總黃酮純度達(dá)到88.75%，純化效果明顯。當(dāng)以體積，濃度，流速分別為20 ml，1.5 mg/ml,1.5 BV/h上樣，用70%乙醇以4 BV/h流速洗脫時(shí)的工藝為最優(yōu)工藝。

在中藥制藥工業(yè)中，大孔吸附樹(shù)脂和聚酰胺樹(shù)脂聯(lián)合純化是有發(fā)展前景的實(shí)用新技術(shù)之一，純化工藝主要采用靜態(tài)純化和動(dòng)態(tài)純化結(jié)合聚酰胺樹(shù)脂純化，相較于單純使用聚酰胺樹(shù)脂，具有富集效率高、成本低、實(shí)用性強(qiáng)、易操作等特點(diǎn)。

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Purificationoftotalflavonoidsfromburdockrootsbymacroporousresincombinedwiththemethodofpolyamide

Wang Lu,Li Jin,Ding Maopeng,et al.

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Objective:To study the process of the Purification of total flavonoids from burdock roots.Methods: The crude extracts of the total flavonoids of burdock roots were purified by macroporous resin and polyamide.Results: The purification of flavonoids by macroporous resin: the folding layer column having an inner diameter of 30 mm was repleted with a diameter ratio of 1∶7. The effect of elution was optimum when the sample liquid of 400 ml, at the concentration of 10 mg/ml was loaded with flow rate of 0.5 BV/h and elute with a flow rate of 1.5 BV/h with 30% ethanol. The purification of polyamide: the folding layer column of 15mm having an inner diameter was repleted with a diameter ratio of 1∶ 8. The effect of elution was optimum when the 20 ml of the sample liquid, at the concentration of 1.5 mg / ml, PH 2, was loaded at the flow rate of 0.5BV / h and elute with 70% ethanol at the flow rate of 4 BV / h.Conclusion: The content of total flavonoids in burdock roots is 7%. Under the optimum conditions, the content of total flavonoids is 55.86% after purification through macroporous resin, and the total flavonoid content reaches 80.75% after further purification of polyamide.

Arctium lappa Flavones Pharmaceutical technology (TCD)

*陜西省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(15JK1208)

牛蒡 黃酮 中藥制藥工藝

R284

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.11.055

(收稿：2017-07-13)