長(zhǎng)三角地區(qū)兼用型鴨全基因組遺傳多樣性分析

章雙杰+王靖+楊建生+李慧芳+宋衛(wèi)濤+許金根+華國(guó)浩+葉彩芳+林雨鑫+劉怡

摘要：為了全面了解長(zhǎng)三角地區(qū)兼用型鴨的遺傳多樣性，對(duì)該地區(qū)婁門(mén)鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨的血液進(jìn)行全基因組重測(cè)序分析。4個(gè)樣本平均的測(cè)序深度和覆蓋率分別為11.91×、97.19%；通過(guò)與北京鴨的基因組進(jìn)行比對(duì)，婁門(mén)鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨分別檢測(cè)到7 733 429、8 161 310、7 324 728、7 986 534個(gè)SNP，1 145 846、1 239 348、958 379、1 121 697個(gè)Indel以及1 777、1 949、1 556、1 088個(gè)CNV，這些變異大部分坐落在基因間或基因內(nèi)的內(nèi)含子區(qū)；通過(guò)群體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析和CNV交集分析發(fā)現(xiàn)婁門(mén)鴨和昆山麻鴨為一類，巢湖鴨和高郵鴨為一類。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)三角地區(qū)；鴨；全基因組；重測(cè)序；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；拷貝數(shù)變異

中圖分類號(hào)： S834.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0032-03

通信作者：楊建生，碩士，高級(jí)畜牧師，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。E-mail：ksxmsyz@aliyun.com。畜禽遺傳資源及其多樣性是畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的種質(zhì)基礎(chǔ)，也是滿足未來(lái)市場(chǎng)需求的重要基因庫(kù)。當(dāng)前，全球畜禽遺傳資源的多樣性正日益減少，而我國(guó)地方種資源的保種狀況也不容樂(lè)觀[1]。我國(guó)地方鴨在世界鴨品種資源庫(kù)中占據(jù)了非常重要的位置，由于我國(guó)特有的地理?xiàng)l件（多泥灘、海涂、湖泊），養(yǎng)鴨業(yè)已成為我國(guó)重要的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)[2]。地方鴨種質(zhì)資源是鴨育種和生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，開(kāi)展地方鴨品種資源評(píng)價(jià)和種質(zhì)特性研究等工作，不但保護(hù)了品種的遺傳多樣性，還可以保證鴨育種工作能對(duì)環(huán)境、疾病和市場(chǎng)需求的變化作出及時(shí)有效的反應(yīng)[3]。要成功有效地保護(hù)我國(guó)地方鴨品種遺傳資源，為我國(guó)地方鴨品種的育種提供有價(jià)值的遺傳素材，必須要了解這些資源的遺傳特性，并以此為依據(jù)采取相應(yīng)的保護(hù)措施。

遺傳特性的研究涉及到多門(mén)學(xué)科，特別是近年來(lái)生物組學(xué)對(duì)其產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，其中，基因組學(xué)帶來(lái)的顛覆性技術(shù)之一是基因型鑒定（又稱基因分型）技術(shù)，其手段就是利用分子標(biāo)記。目前，隨著高通量檢測(cè)和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，除簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）和單核苷酸多態(tài)（SNP）標(biāo)記在廣泛使用外，其他類型的標(biāo)記已用得越來(lái)越少。而SNP 標(biāo)記具有覆蓋全基因組、高通量、位點(diǎn)特異、共顯性遺傳、誤檢率低、開(kāi)發(fā)和檢測(cè)成本急劇降低等優(yōu)點(diǎn)，將成為未來(lái)基因型鑒定的主要標(biāo)記類型[4]。與此同時(shí)，拷貝數(shù)變異（CNV）的研究也逐漸成為了動(dòng)植物基因組研究的熱點(diǎn)，CNV 普遍存在于動(dòng)植物基因組中，在家養(yǎng)動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了大量的 CNV，且CNV片段長(zhǎng)度大，覆蓋了更大范圍的基因組序列，并已在豬[5]、牛[6]、羊[7]、雞[8]上鑒定出一些與重要性狀相關(guān)的變異，因此，CNV也可以作為一種強(qiáng)有力的分子標(biāo)記應(yīng)用于畜禽遺傳特性研究中。然而，目前關(guān)于中國(guó)地方鴨基因組的研究較為匱乏，目前國(guó)內(nèi)僅對(duì)北京鴨進(jìn)行了全基因組測(cè)序[9]。長(zhǎng)三角地區(qū)是我國(guó)水禽生產(chǎn)最發(fā)達(dá)的地區(qū)，由于各地生態(tài)條件和社會(huì)經(jīng)濟(jì)條件差異，逐漸形成了不同的地方種群或生態(tài)種群[10]。鑒于以上幾點(diǎn)，本研究通過(guò)第二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)長(zhǎng)三角地區(qū)的婁門(mén)鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨這4種兼用型鴨的全基因組進(jìn)行了重測(cè)序，旨在為建立我國(guó)地方鴨品種或資源群的基因組檔案，并從分子水平上揭示了鴨品種遺傳變異的現(xiàn)狀，為地方鴨品種的保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用提供可靠的基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用的4個(gè)鴨品種分別為婁門(mén)鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨、高郵鴨。婁門(mén)鴨和昆山麻鴨來(lái)自昆山麻鴨原種場(chǎng)（婁門(mén)鴨和昆山麻鴨保種場(chǎng)），巢湖鴨來(lái)自安徽省廬江縣種鴨場(chǎng)（巢湖鴨保種場(chǎng)），高郵鴨來(lái)自江蘇省高郵市高郵鴨良種繁育中心（高郵鴨保種場(chǎng)）。試驗(yàn)儀器和試劑見(jiàn)表1、表2。

表1試驗(yàn)儀器

儀器生產(chǎn)商型號(hào)Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866Magnetic Stand-96Life TechnologiesAM10027GeneAmp PCR System 9700Life Technologies4314878MicroCentrifugeEppendorf5418Agilent 2100 BioanalyzerAgilent G2939AAThermalStat PlusEppendorf5352 000.088cBot Clonal Amplification SystemIlluminaSY-301-2002HiSeq 2500 Sequencing SystemIlluminaSY-401-2501

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1血樣收集每種試驗(yàn)鴨隨機(jī)選取3羽母鴨進(jìn)行翅下靜脈采血，采集血量約2 mL并置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的離心管中，混勻后放入-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)基因組的提取。

1.2.2DNA的抽提與純化試驗(yàn)采用DNeasy Blood & Tissue Kit， 根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣本的 DNA 抽提及純化。純化后的DNA 經(jīng)Qubit 20 Fluorometer和

表2試驗(yàn)試劑

試劑生產(chǎn)商型號(hào)NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit

for Illumina NEB

E7370S/L

Agencourt AMPure XP BeadsBeckmanA63881DNeasy Blood & Tissue KitQiagen69506QubitTM dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32854Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626HiSeq PE Cluster Kit v4 IlluminaPE-401-4001HiSeq SBS Kit v4IlluminaFC-401-4003

08%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格的DNA可進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序試驗(yàn)。

1.2.3文庫(kù)構(gòu)建將每個(gè)品種鴨的3個(gè)基因組DNA混合，按照試驗(yàn)說(shuō)明書(shū)（NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumin）對(duì)基因組DNA進(jìn)行片段化、末端修復(fù)、3′末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測(cè)序樣本文庫(kù)構(gòu)建。所建文庫(kù)使用Qubit 2.0 Fluorometer檢測(cè)其濃度，使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)文庫(kù)的大小。

1.2.4上機(jī)測(cè)序按照cBot User Guide （https：//support.illumina.com/downloads/cbot_user_guide_15006165.html） 所示相應(yīng)流程，在Illummina HiSeq 2500 測(cè)序儀配套的 cBot 上完成簇生成和第一向測(cè)序引物雜交。按照HiSeq 2500 User Guide （https：//support.illumina.com/downloads/hiseq_2500_user_guide_15035786.html）準(zhǔn)備測(cè)序試劑，將攜有簇的含有大量Cluster的芯片上機(jī)（儀器型號(hào)：HiSeq 2500 Sequencing System，Illumina）。選用paired-end 程序，進(jìn)行2×125 nt 雙端測(cè)序。測(cè)序過(guò)程由 Illumina 提供的數(shù)據(jù)收集軟件進(jìn)行控制，并進(jìn)行實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用測(cè)序質(zhì)量Q值進(jìn)行評(píng)估，Q值與測(cè)序錯(cuò)誤E值之間關(guān)系為Q=-10lgE。

1.2.5數(shù)據(jù)分析對(duì)4個(gè)樣本的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)基因組分析，包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、基因組序列比對(duì)、SNP檢測(cè)及注釋、插入缺失標(biāo)記（Indel）檢測(cè)及注釋、CNV檢測(cè)及注釋、SNV檢測(cè)及注釋、群體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。其中序列比對(duì)是與北京鴨的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，采用的基因組版本為BGI_duck_1.0.81，參考基因組下載鏈接為ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release81/fasta/anas_platyrhynchos/dna/Anas_platyrhynchos.BGI_duck_ 1.0.dna.toplevel.fa.gz。

2結(jié)果與分析

2.1測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

選擇4個(gè)品種的母鴨（每個(gè)品種3個(gè)個(gè)體）作為試驗(yàn)材料，首先提取其基因組進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)，所有樣本的濃度D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm均滿足全基因組重測(cè)序的建庫(kù)要求。將每個(gè)品種母鴨的基因組DNA樣本進(jìn)行混合，并對(duì)這4個(gè)混合基因組DNA樣本測(cè)序。測(cè)序完成后，首先對(duì)所得的測(cè)序片段（reads）進(jìn)行質(zhì)量控制。由表3可知，經(jīng)質(zhì)量控制后，4個(gè)樣本reads數(shù)量的平均值為102.8 M（95.9～111.6 M），且錯(cuò)誤率小于1%的測(cè)序數(shù)據(jù)（Q20）均高于95%。在進(jìn)行序列比對(duì)和去除PCR重復(fù)之后，每個(gè)個(gè)體比對(duì)到基因組上的reads數(shù)平均值為100.6 M（94.8～110.1 M）。4個(gè)樣本平均的測(cè)序深度（指測(cè)序得到的總堿基數(shù)與待測(cè)基因組大小的比值）和覆蓋率分別為11.91×、9719%。因此，以上質(zhì)量評(píng)估結(jié)果表明該數(shù)據(jù)能夠滿足后期分析的需要。表34個(gè)樣本的序列質(zhì)量

品種Q20（%）reads的數(shù)量比對(duì)后reads數(shù)量比對(duì)率（%）覆蓋率（%）測(cè)序深度婁門(mén)鴨95.4195 913 24494 771 60198.8196.9111.73×昆山麻鴨95.77111 617 432110 094 46198.6497.1612.49×巢湖鴨95.2898 304 39095 063 50396.7097.2911.17×高郵鴨95.80105 406 198102 684 84997.4297.4012.24×

2.2SNP和Indel檢測(cè)

為了使比對(duì)的SNP和Indel的結(jié)果更加準(zhǔn)確，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行3步處理，第一步通過(guò)生物信息分析軟件Picard的Markdulicates工具標(biāo)記重復(fù)PCR的reads，這樣可以去除因?yàn)镻CR錯(cuò)誤而導(dǎo)入的假陽(yáng)性突變；第二步通過(guò)基因組分析軟件 Genome Analysis Toolkit（GATK）的IndelRealigner 工具對(duì)測(cè)序結(jié)果中存在的Indel位點(diǎn)或已知的Indel位點(diǎn)附近進(jìn)行局部的多序列比對(duì)，減少因?yàn)椴迦肴笔?dǎo)致reads邊緣的假SNP位點(diǎn)；第三步是通過(guò) GATK的BaseRecalibrator工具根據(jù)已知的突變信息對(duì)reads的堿基質(zhì)量進(jìn)行校正，使堿基質(zhì)量符合實(shí)際，進(jìn)一步減少假陽(yáng)性。通過(guò)運(yùn)用GATK UnifiedGenotyper軟件對(duì)這4個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果與北京鴨的基因組進(jìn)行比對(duì)，得到了婁門(mén)鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨的SNP和Indel結(jié)果的vcf文件，婁門(mén)鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨分別檢測(cè)到 7 733 429、8 161 310、7 324 728、7 986 534個(gè)SNP，1 145 846、1 239 348、958 379、1 121 697個(gè)Indel。由表4、表5可知，這4個(gè)樣品的變異大部分坐落在基因間或基因內(nèi)的內(nèi)含子區(qū)。

2.3群體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)SNPhylo軟件對(duì)測(cè)序后的變異文件（vcf文件）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。該軟件工作流程為分析vcf文件，去除低質(zhì)量位點(diǎn)，形成GDS 文件，根據(jù)連鎖不平衡選擇代表位點(diǎn)，根據(jù)所選位點(diǎn)構(gòu)建比對(duì)序列，采用MUSCLE軟件進(jìn)行比對(duì)，最后采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。本試驗(yàn)只篩選長(zhǎng)度大于3 Mbp 的37個(gè)片段變異位點(diǎn)的vcf文件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。其中測(cè)序深度控制值為5；最小等位基因頻率（maf）為 0.05；連鎖不平衡（LD）為 0.1。由圖1可知，婁門(mén)鴨和昆山麻鴨聚為表44種鴨全基因組SNP的分布情況個(gè)

品種外顯子基因上游基因下游基因間區(qū)內(nèi)含子非翻譯區(qū)剪接區(qū)域其他婁門(mén)鴨65 749328 152298 9543 573 7552 425 9014 89632 5661 003 456昆山麻鴨68 470344 108312 6323 773 1632 564 3095 22134 3601 059 047巢湖鴨74 560391 167341 3893 360 3492 148 1064 58636 354968 217高郵鴨71 662353 911321 3723 700 2842 542 3595 06835 848956 030

表54種鴨全基因組Indel的分布情況個(gè)

品種外顯子基因上游基因下游基因間區(qū)內(nèi)含子非翻譯區(qū)剪接區(qū)域其他婁門(mén)鴨3 76946 59346 573529 877362 2438623 151152 778昆山麻鴨4 00149 63849 857575 123390 9669303 268165 565巢湖鴨4 97754 77051 409433 254283 3367163 709126 208高郵鴨4 17049 32848 362515 746362 9838253 456136 827

一類，巢湖鴨和高郵鴨聚為一類。

2.4CNV檢測(cè)

通過(guò)與北京鴨的基因組進(jìn)行比對(duì)，由表6可知，婁門(mén)鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨分別檢測(cè)到1 777、1 949、1 556、1 088 個(gè)CNV，拷貝數(shù)變異大部分坐落在基因間區(qū)。針對(duì)這些CNV，進(jìn)一步做了這4種鴨的韋恩圖，由圖2可知，婁門(mén)鴨和昆山麻鴨共有的CNV達(dá)到了1 059個(gè)， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他鴨所共有的CNV。因此，僅從CNV的檢測(cè)結(jié)果也能推斷出婁門(mén)鴨和昆山麻鴨具有較近的血緣關(guān)系。表64種鴨全基因組CNV的分布個(gè)

品種外顯子基因上游基因下游基因間區(qū)內(nèi)含子非翻譯區(qū)剪接區(qū)域其他婁門(mén)鴨16516011681520891303昆山麻鴨19218311090222291330巢湖鴨20516612087235570101高郵鴨134946446812271198

3討論

當(dāng)前種質(zhì)資源的遺傳多樣性評(píng)價(jià)主要是通過(guò)利用分子標(biāo)記限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）等來(lái)檢測(cè)生物個(gè)體的基因型，雖然克服了形態(tài)學(xué)標(biāo)記易受環(huán)境影響等缺點(diǎn)，但仍存在可供檢測(cè)的位點(diǎn)少、標(biāo)記開(kāi)發(fā)成本較高和通量小等不足[11]。雖然基因芯片的出現(xiàn)彌補(bǔ)了分子標(biāo)記通量小的不足，但檢測(cè)成本依然過(guò)高，同時(shí)芯片上標(biāo)記的數(shù)量仍受限制[12]。而本研究利用第二代測(cè)序技術(shù)，以北京鴨基因組作為對(duì)照，將 Illumina 測(cè)序產(chǎn)生的短片段與其比對(duì)，可快速獲取目標(biāo)個(gè)體單核苷酸分辨率的變異位點(diǎn)數(shù)據(jù)，這種策略不僅更加全面、精確，而且通量高、準(zhǔn)確度高。保證SNP 、Indel和CNV的準(zhǔn)確性是評(píng)價(jià)種質(zhì)資源遺傳多樣性最重要的前提，為了達(dá)到這一目標(biāo)，應(yīng)盡量提高測(cè)序的深度。測(cè)序深度（sequencing depth）是指測(cè)序得到的堿基總量與基因組大小的比值，它是評(píng)價(jià)測(cè)序量的指標(biāo)之一。測(cè)序深度與基因組覆蓋度之間呈正相關(guān)，而與測(cè)序的錯(cuò)誤率或假陽(yáng)性結(jié)果呈負(fù)相關(guān)。在采用雙末端（paired-end）方案的情況下，當(dāng)測(cè)序深度為10×至15×?xí)r，基因組覆蓋度和測(cè)序錯(cuò)誤率均能夠得到保證[13]。本試驗(yàn)中4個(gè)樣本的測(cè)序深度均大于11×，從而很大程度上降低了測(cè)序錯(cuò)誤，保證了鑒定SNP 、Indel、CNV 的準(zhǔn)確性。

為了進(jìn)一步評(píng)估這4種鴨的遺傳多樣性，采用最大似然法將鑒定后的SNP和Indel構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。進(jìn)化樹(shù)又稱為系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，是一種用來(lái)描述各種生命實(shí)體之間進(jìn)化關(guān)系的樹(shù)型結(jié)構(gòu)。目前常見(jiàn)的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建方法有距離法、最大簡(jiǎn)約法和最大似然法3種。而最大似然法是一種建立在進(jìn)化模型上的統(tǒng)計(jì)方法，具有統(tǒng)計(jì)一致性、健壯性，能夠在一個(gè)統(tǒng)計(jì)框架內(nèi)比較不同的樹(shù)以及充分利用原始數(shù)據(jù)等優(yōu)點(diǎn)[14]，且大量研究表明，最大似然法比其他方法更準(zhǔn)確[15]。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)以及CNV鑒定結(jié)果均表明婁門(mén)鴨和昆山麻鴨為一類，巢湖鴨和高郵鴨為一類。婁門(mén)鴨和昆山麻鴨原產(chǎn)地均為江蘇省蘇州市，且昆山麻鴨是由婁門(mén)鴨導(dǎo)入北京鴨血統(tǒng)培育而成的[16]。巢湖鴨原產(chǎn)地為安徽省巢湖市，高郵鴨原產(chǎn)地為江蘇省高郵市，這2個(gè)鴨群體相比，婁門(mén)鴨和昆山麻鴨的地理位置分布較近。因此，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和CNV的結(jié)果均與這4個(gè)鴨群體的生態(tài)地域分布和育成歷史相一致。目前，巢湖鴨和高郵鴨已被列入我國(guó)畜禽遺傳資源名錄，而婁門(mén)鴨和昆山麻鴨作為兼用型鴨，其產(chǎn)蛋性能和肉用性能也毫不遜色于其他鴨種[17]，且本研究發(fā)現(xiàn)這2個(gè)鴨品種與其他鴨品種的遺傳距離也較遠(yuǎn)。因此，昆山麻鴨和婁門(mén)鴨作為長(zhǎng)三角地區(qū)的優(yōu)良兼用型鴨品種，應(yīng)當(dāng)加大其保種和開(kāi)發(fā)利用力度。

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