鴻英1，+朱亞露1，+揭畢志香+趙陽+何家惠+于漾+侯繼波

摘要：為完善現(xiàn)有雞傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，簡稱IBDV）滅活疫苗生產工藝，形成適用于批量生產的抗原制備技術流程，對IBDV NJ09株病毒在DF-1細胞上的增殖工藝進行研究。通過培養(yǎng)基篩選、血清最適濃度比較、接毒量測定等相關試驗，明確了規(guī)?；a工藝，即將DF-1細胞以1 ∶3、1 ∶4比例分瓶（0.85×105～1.2×105個/mL）傳代培養(yǎng)，細胞生長36～48 h后按體積分數(shù)0.1%～0.2%接種IBDV NJ09株毒種，接毒后 36～48 h收毒；同時篩選出適宜IBDV NJ09株病毒增殖的MD611培養(yǎng)基及小牛血清，既可以滿足高滴度抗原增殖的生長需要，又降低了疫苗生產成本，形成了適用于規(guī)?；a的抗原接種、收獲、處理工藝技術指標，按上述工藝所增殖的IBDV NJ09株抗原病毒含量穩(wěn)定在108.0 TCID50/mL以上，可滿足含IBDV組分的系列滅活疫苗生產需要，為該病毒滅活疫苗大規(guī)模生產提供了技術支持。

關鍵詞：雞傳染性法氏囊病毒；NJ09株；DF-1細胞；生產工藝

中圖分類號： S858.315.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0152-03

收稿日期：2017-02-24

基金項目：公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（編號：201303046）。

作者簡介：揭鴻英（1978—），女，福建三明人，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究。E-mail：hongying6090@163.com。

通信作者：于漾，碩士，助理研究員，主要從事獸用生物制品研究。Tel：（025）84392058；E-mail：yangyu1719223@163.com。DF-1細胞是一種可以持續(xù)傳代的雞胚成纖維細胞系，由美國明尼蘇達大學的Himly等于1998年用10日齡EV-0雞胚胎制備而成[1]。與傳統(tǒng)的雞成纖維（chicken embryo fibroblast，簡稱CEF）細胞相比，該細胞系在產業(yè)化生產中有著明顯的優(yōu)勢，目前已廣泛應用于禽類病毒的增殖研究及疫苗的規(guī)?；a中[2-3]，其中在雞傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，簡稱IBDV）的增殖研究上也有相關報道[4-9]。IBDV是雞傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease）的致病病原，雞感染該病毒不僅會引起雛雞發(fā)病死亡，更重要的是會破壞雛雞法氏囊組織，導致免疫抑制，誘發(fā)機體對其他病原的敏感性，威脅禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[10-13]。在IBDV的疫苗研究中，近年來也有利用傳代細胞培養(yǎng)病毒的報道，但由于IBDV包含多個株系，受毒源株系差別、培養(yǎng)體系等因素的影響，IBDV在DF-1等傳代細胞上的增殖條件也各不相同[14-18]。為提高IBDV NJ09株在DF-1細胞上增殖的病毒含量，同時考慮大規(guī)模培養(yǎng)的生產成本，筆者所在實驗室對IBDV NJ09株細胞適應毒在DF-1細胞上的增殖進行不同條件的篩選，擬確定IBDV NJ09株在DF-1細胞上的最佳生產工藝。

1材料與方法

1.1材料

25 cm2細胞瓶、細胞計數(shù)板、96孔細胞培養(yǎng)板，均購自美國Corning Coster公司；DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、小牛血清、胎牛血清，均購自GIBCO公司；MD611培養(yǎng)基，購自北京清大天一科技有限公司；DF-1細胞，從美國ATCC公司購入，由國家獸用生物制品工程技術研究中心傳代、建庫和保存；雞傳染性法氏囊病毒NJ09株細胞適應毒F3代，病毒含量為108.0 TCID50/mL（TCID50表示半數(shù)組織感染量），由筆者所在實驗室培育和保存。

1.2DF-1細胞傳代比例篩選

選擇細胞生長良好、致密度為95%以上的25 cm2細胞瓶，棄去培養(yǎng)液，用0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）輕輕蕩洗2次，加入0.1%胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）液2 mL進行消化。當細胞面呈毛玻璃狀，棄去消化液，利用瓶內殘留的0.5 mL消化液繼續(xù)消化，當細胞面出現(xiàn)松散脫落時，加入不同比例含5%小牛血清的MD611培養(yǎng)液輕輕吹打，懸浮細胞，進行細胞計數(shù)，使細胞生長液中DF-1細胞數(shù)分別為 0.5×105～0.7×105個/mL（傳代比例1 ∶6）、0.67×105～083×105個/mL（傳代比例1 ∶5）、0.85×105～1.0×105個/mL（傳代比例 1 ∶4）、1.0×105～1.2×105個/mL（傳代比例1 ∶3），在25 cm2細胞瓶中加入10 mL細胞懸液，在37 ℃條件下培養(yǎng)，觀察細胞的貼壁情況、生長狀態(tài)及細胞的密度。

1.3IBDV NJ09株在DF-1細胞上的最佳接毒量的確定

取已長滿單層的25 cm2細胞瓶12個，分4組，每組3個重復，分別按0.1%、0.2%、0.5%、1.0%接毒量（體積分數(shù)）接毒。接毒后，觀察細胞病變出現(xiàn)情況，待80%以上細胞出現(xiàn)病變時，收獲細胞毒。收獲的細胞毒反復凍融3次后，12 000 r/min 離心 10 min，取上清測定病毒含量。

1.4不同營養(yǎng)液對擴繁DF-1細胞的影響

DF-1細胞分別用3種細胞生長液（DMEM+5%小牛血清、DMEM/F12+5%小牛血清、MD611+5%小牛血清）連傳3代后，消化細胞，進行細胞計數(shù)。

1.5不同營養(yǎng)液擴繁DF-1細胞對IBDV增殖的影響

取分別用3種細胞生長液（DMEM+10%小牛血清、DMEM/F12+10%小牛血清、MD611+5%小牛血清）連傳細胞長滿單層的25 cm2細胞瓶9個，3個1組，每個細胞瓶按 0.1%（體積比）接毒。第1組維持液為DMEM培養(yǎng)基（DMEM+2%小牛血清），第2組維持液為DMEM/F12培養(yǎng)基（DMEM/F12+2%小牛血清），第3組維持液為MD611培養(yǎng)基（MD611+2%小牛血清）。接毒后觀察細胞病變情況，各組均在接毒后細胞病變數(shù)量超過80%時收毒，收獲的細胞毒反復凍融3次后，12 000 r/min離心10 min，取上清測定病毒含量。endprint

1.6不同血清對IBDV增殖的影響

取已長滿單層細胞的25 cm2細胞瓶6個，3個1組，按 0.1%（體積比）接毒。第1組維持液為含2%小牛血清的培養(yǎng)基，第2組為含2%胎牛血清的培養(yǎng)基。接毒后觀察細胞病變情況，各組均在接毒后細胞病變數(shù)量達到80%以上時收毒，-20 ℃凍存，12 000 r/min離心10 min，取上清測定病毒含量。

1.7IBDV收毒時凍融次數(shù)對病毒含量的影響

取已長滿單層細胞的25 cm2細胞瓶6個，3個1組。按0.1%（體積比）接毒。接毒后觀察細胞病變情況，當細胞病變數(shù)量超過80%時收毒，第1組將所取的3個方瓶細胞毒懸液混勻，反復吹打，不凍融，收獲病毒液。第2組將細胞置于 -20 ℃ 凍融，分別在凍融1、2、3次時取樣。所有樣品經 12 000 r/min 離心10 min，取上清測定病毒含量。

1.8毒價測定方法

已長滿單層細胞的96孔細胞板，棄去培養(yǎng)液，每孔用PBS洗滌1次。將病毒用無血清的培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，從最低稀釋度的病毒液開始接種細胞，每個稀釋度接4個孔，每孔100 μL，在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h之后，每孔加入100 μL維持液（血清終濃度為2%）。放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并記錄細胞病變情況，連續(xù)觀察7 d，計算TCID50。

2結果與分析

2.1DF-1細胞傳代比例篩選

由表1可以看出，將DF-1細胞按1 ∶3～1 ∶6不同比例分瓶傳代，在一定時間內均能長成致密單層。但隨著分瓶比例的加大，長成致密單層的時間延長。DF-1細胞按1 ∶3、1 ∶4 比例分瓶傳代時，接種后24～48 h能長成致密單層，培養(yǎng) 48 h 時細胞數(shù)較多；而按1 ∶5～1 ∶6分瓶培養(yǎng)48 h細胞數(shù)少于1 ∶3、1 ∶4比例分瓶試驗組，且于接種后60～84 h才長成致密單層。因此，以1 ∶3、1 ∶4的傳代比例培養(yǎng)36～48 h 為最佳。

2.2IBDV在DF-1細胞上的最佳接毒量的確定

IBDV NJ09株在DF-1細胞上按0.5%～1.0%的量接毒，細胞在接毒后24 h出現(xiàn)病變，24～36 h細胞全部脫落，由表2可見，接種量0.5%～1.0%條件下，收毒時間為28～30 h，病毒含量為107.4～107.8 TCID50/mL。按0.1%～0.2% 的量接毒，細胞在接毒后24～36 h開始出現(xiàn)病變，36～48 h 80%的細胞出現(xiàn)病變，病毒含量為108.0～108.2 TCID50/mL。因此，按0.1%～0.2%接毒量接毒時，36～48 h收毒的病毒含量最高。

2.3不同營養(yǎng)液對DF-1細胞增殖的影響

由表3可知，培養(yǎng)48 h時，含DMEM培養(yǎng)基的營養(yǎng)液中的細胞數(shù)為67萬個/mL，DMEM/F12培養(yǎng)基中的細胞數(shù)為70萬個/mL，而MD611培養(yǎng)基中的細胞數(shù)為100萬個/mL，高于另2種培養(yǎng)基；在生產成本上，MD611培養(yǎng)基增殖DF-1細胞的生產成本明顯低于DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基，因此MD611培養(yǎng)基是經濟又適宜的DF-1細胞培養(yǎng)基。

2.4不同營養(yǎng)液對IBDV增殖的影響

由表4可知，3種營養(yǎng)液中，含DMEM培養(yǎng)基的營養(yǎng)液中IBDV的增殖效價最低，病毒含量為107.67 TCID50/mL，而含DMEM/F12、MD611培養(yǎng)基的營養(yǎng)液中IBDV病毒含量分別為108.20、108.27 TCID50/mL，兩者IBDV的增殖量相當，而在生產成本上，DMEM/F12生產成本大約是MD611的3倍（表3），因此MD611是一種適宜IBDV NJ09株病毒在DF-1上增殖的培養(yǎng)基。

3討論與結論

DF-1作為一種重要的禽傳代細胞，目前已在多種禽病毒增殖研究中被應用，如IBDV、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、馬立克氏病病毒等[19-20]。筆者所在實驗室前期已經馴化獲得1株DF-1細胞適應毒——IBDV NJ09株，基于該細胞毒，本研究對其在DF-1細胞上進行增殖培養(yǎng)時的接毒量、營養(yǎng)液、血清、收毒方法等方面進行了條件優(yōu)化，為進一步完善該毒株的疫苗生產工藝提供支持。

從不同分瓶傳代比例看，DF-1細胞按1 ∶3～1 ∶6傳代，細胞都能長成單層，但長成單層需要的時間不同。因此可以根據(jù)不同的目的，選擇不同的分瓶比例。當需要接毒時，可以選擇1 ∶3～1 ∶4的比例傳代，細胞在培養(yǎng)24～48 h時可以長成致密單層。如果僅是維持細胞的傳代需要，可以選擇 1 ∶5～1 ∶6的比例分瓶，這樣既保存了細胞，又減輕了工作量。

不同營養(yǎng)液對DF-1細胞的增殖結果顯示，DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h，細胞數(shù)約增殖2倍，用MD611培養(yǎng)DF-1 48 h后，細胞數(shù)增殖3倍左右，而且MD611價格便宜，僅為DMEM價格的1/2左右、DMEM/F12價格的1/3左右。

病毒接毒量研究結果顯示，IBDV NJ09株在DF-1細胞上按1.0%的接毒量接毒，毒價并不是最高，這一結果說明了1.0%的接毒量過大，導致細胞病變出現(xiàn)過早，毒價亦未因接種量的增加而更高。病毒接毒量不是越大越好，細胞接毒量太大會造成細胞病變提前，導致細胞迅速圓縮脫落，毒價反而不高；而接毒量過少時又會造成細胞病變出現(xiàn)延遲，細胞衰老、狀態(tài)差也會影響病毒增殖的毒價，前人研究IBDV在細胞上的增殖時也有類似的發(fā)現(xiàn)[21-22]。最佳接毒量應該用每個細胞的病毒感染復數(shù)（MOI）表示更科學，而本試驗中，由于細胞培養(yǎng)工藝比較成熟，細胞數(shù)也比較穩(wěn)定，且毒種的病毒含量是穩(wěn)定的，故接毒量用占維持液的百分比表示，在具體操作中更便捷。

不同血清對IBDV增殖影響的研究結果顯示，胎牛血清中IBDV NJ09株的病毒增殖后的含量比小牛血清略高，而成本比小牛血清高300元/L，結合生產實際，選擇性價比高的小牛血清。endprint

IBDV收毒時，凍融次數(shù)對病毒含量影響的研究結果顯示，不凍融雖然對病毒含量影響不大，但有一部分細胞未脫壁，不能完全收清，而凍融1、2次后少量未脫璧的細胞也能脫落，利于完全收獲。

通過系列試驗對DF-1的培養(yǎng)及IBDV NJ09株細胞毒生產工藝條件進行了研究，確定了培養(yǎng)基及血清，同時制定了適用于規(guī)?；a的抗原接種、收獲、處理工藝技術指標：（1）DF-1細胞在傳代時，以1 ∶3、1 ∶4比例傳代，培養(yǎng)36～48 h后能長成致密單層，適合接毒；（2）選用MD611培養(yǎng)基+2%小牛血清濃度維持液增殖IBDV病毒，既可以確保增殖抗原的高滴度，又降低了生產成本；（3）IBDV NJ09株最適接毒量為0.1%～0.2%（體積分數(shù)），接毒時間為細胞生長36～48 h后，收毒時間為接毒36～48 h（80%以上細胞出現(xiàn)細胞病變）后，可確保病毒含量不低于108.0 TCID50/mL；（4）IBDV NJ09株在DF-1細胞上增殖收毒時的凍融次數(shù)，對抗原病毒含量影響不明顯，為確保病毒收獲完全，建議選擇凍融1～2次。

參考文獻：

[1]Himly M，F(xiàn)oster D N，Bottoli I，et al. The DF-1 chicken fibroblast cell line：transformation induced by diverse oncogenes and cell death resulting from infection by avian leukosis viruses[J]. Virology，1998，248（2）：295-304.

[2]Lee C W，Jung K，Jadhao S J，et al. Evaluation of chicken-origin （DF-1） and quail-origin （QT-6） fibroblast cell lines for replication of avian influenza viruses[J]. Journal of Virological Methods，2008，153（1）：22-28.

[3]Maas R，van Zoelen D，Oei H，et al. Replacement of primary chicken embryonic fibroblasts （CEF） by the DF-1 cell line for detection of avian leucosis viruses[J]. Biologicals，2006，34（3）：177-181.

[4]Hui R K，Leung F C. Differential expression profile of chicken embryo fibroblast DF-1 cells infected with cell-adapted infectious bursal disease virus[J]. PLoS One，2015，10（6）：e0111771.

[5]Rekha K，Sivasubramanian C，Chung I M，et al. Growth and replication of infectious bursal disease virus in the DF-1 cell line and chicken embryo fibroblasts[J]. Biomed Res Int，2014，2014：1-6.

[6]Wang Y Q，Qi X L，Gao H L，et al. Comparative study of the replication of infectious bursal disease virus in DF-1 cell line and chicken embryo fibroblasts evaluated by a new real-time RT-PCR[J]. Journal of Virological Methods，2009，157（2）：205-210.

[7]Yip C W，Hon C C，Zeng F，et al. Cell culture-adapted IBDV uses endocytosis for entry in DF-1 chicken embryonic fibroblasts[J]. Virus Research，2012，165（1）：9-16.

[8]沈佳，姜北宇，章振華，等. 雞傳染性法氏囊病病毒BJQ902株在懸浮培養(yǎng)DF-1細胞上的增殖特性研究[J]. 中國家禽，2016，38（1）：16-20.

[9]沈佳，章振華，李林，等. 雞傳染性法氏囊病病毒BJQ902株對三種傳代細胞敏感性的比較研究[J]. 中國家禽，2016，38（16）：17-21.

[10]Cho Y，Edgar S A. Characterization of the infectious bursal agent[J]. Poultry Science，1969，48（6）：2102-2109.

[11]Faragher J T，Allan W H，Cullen G A. Immunosuppressive effect of the infectious bursal agent in the chicken[J]. Nature：New Biology，1972，237（73）：118-119.

[12]Li K，Courtillon C，Guionie O，et al. Genetic，antigenic and pathogenic characterization of four infectious bursal disease virus isolates from China suggests continued evolution of very virulent viruses[J]. Infection，Genetics and Evolution，2015，30：120-127.endprint

[13]Sharma J M，Kim I J，Rautenschlein S，et al. Infectious bursal disease virus of chickens：pathogenesis and immunosuppression[J]. Developmental and Comparative Immunology，2000，24（2/3）：223-235.

[14]Lu Z，Zhang L Z，Wang N，et al. Naturally occurring reassortant infectious bursal disease virus in northern China[J]. Virus Research，2015，203：92-95.

[15]Wang Y S，Wang Z C，Tang Y D，et al. Comparison of four infectious bursal disease viruses isolated from different bird species[J]. Archives of Virology，2007，152（10）：1787-1797.

[16]高立，李凱，祁小樂，等. 三株傳染性法氏囊病病毒超強毒株全基因組的克隆與序列分析[J]. 中國獸醫(yī)科學，2014，44（9）：887-894.

[17]孫曉媛，周繼勇，廖敏. 5株傳染性囊病病毒超強毒株的分離與鑒定[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2014，50（11）：21-23.

[18]詹麗娥，陸冰洋，劉華棟，等. 雞傳染性法氏囊病超強毒株的分子鑒定[J]. 華北農學報，2013，28（3）：234-238.

[19]劉玉鵬，賴漢漳，李延鵬，等. 馬立克氏疫苗病毒在雞傳代細胞上的培養(yǎng)工藝[J]. 中國獸醫(yī)學報，2014，34（8）：1244-1247，1252.

[20]史愛華，姜北宇，沈佳，等. 3株H9亞型禽流感病毒在3種傳代細胞系上增殖效果研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（21）：111-113.

[21]章振華，李林，景小冬，等. 雞傳染性法氏囊病病毒BJQ902株在DF-1細胞系上增殖工藝研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（10）：2775-2779.

[22]王永生，周欣，楊霞，等. 雞傳染性法氏囊病毒在DF-1細胞系上繁殖特性研究[J]. 河南農業(yè)大學學報，2011，45（6）：662-667.高平章，簡迪強，呂鳳嬌，等. 鄰苯二甲酸二甲酯暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質酶的影響[J]. 江蘇農業(yè)科學，2017，45（17）：155-158.endprint