徐志彬，袁麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 內(nèi)鏡科，河北 石家莊 050011）

臨床研究·論著

MMP-2、VEGF在食管癌變過程中的作用研究*

徐志彬，袁麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 內(nèi)鏡科，河北 石家莊 050011）

目的 研究活化的間質(zhì)成纖維細胞表達的基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白在正常食管、食管癌前病變、早期食管癌、進展期食管癌發(fā)展過程中的作用。方法 免疫組織化學(xué)法檢測MMP-2和VEGF蛋白在正常食管20例，低級別上皮內(nèi)瘤變30例，高級別上皮內(nèi)瘤變50例，早期癌25癌，進展期癌25例中的表達?？贵wCD34標記血管內(nèi)皮細胞，檢測微血管密度。結(jié)果 隨食管癌變進展，MMP-2 蛋白在食管間質(zhì)中的表達陽性率依次為 0%（0/20）、0%（0/30）、28%（14/50）、40%（10/25） 和 60%（15/25）。VEGF 蛋白在間質(zhì)成纖維細胞中的表達陽性率依次為 0%（0/20）、3%（1/30）、26%（13/50）、36%（9/25）和52%（13/25），MMP-2和VEGF蛋白在5組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 隨著食管癌變進展，間質(zhì)成纖維細胞發(fā)生活化，分泌表達的MMP-2逐漸增多，從而降解基底膜，促進癌的下侵；過度表達的VEGF蛋白促進間質(zhì)微血管的形成，加速癌的進展和轉(zhuǎn)移。

癌相關(guān)纖維母細胞；基質(zhì)金屬蛋白酶；癌變；癌前病變

癌相關(guān)纖維母細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1-4]。CAFs的活化狀態(tài)常為平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）陽性表達，該類細胞的膠原蛋白和透明質(zhì)酸合成明顯增多，分泌能力、增殖能力及侵襲能力發(fā)生顯著改變。研究表明，在食管癌變進程中，食管間質(zhì)中的成纖維細胞逐步發(fā)生活化，在食管癌階段即稱為食管癌相關(guān)纖維母細胞；觀察發(fā)現(xiàn)食管癌前病變和早期癌階段的活化間質(zhì)成纖維細胞可見多種細胞因子和生長因子[5-7]。除食管癌細胞以外，活化的間質(zhì)成纖維細胞也是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的重要來源。在食管癌變的多個階段，間質(zhì)中活化的間質(zhì)成纖維細胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和 VEGF 蛋白在食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中是否會促進病變的血管生成和血運轉(zhuǎn)移，尚需進一步探討和研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2006年1月-2012年12月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理組織標本150例，共分為5組：正常食管組織20例，低級別上皮內(nèi)瘤變組30例，高級別上皮內(nèi)瘤變組50例，早期癌組25例，進展期癌組25例。本研究經(jīng)過本院倫理委員會審批通過。

1.2 α-SMA、MMP-2和VEGF蛋白檢測

采用免疫組織化學(xué)一步法，用已知陽性的人癌組織切片作陽性對照組，以磷酸鹽緩沖溶液代替一抗作陰性對照。α-SMA鼠抗人單克隆抗體和CD34鼠抗人單克隆抗體由北京西雅金橋生物技術(shù)有限公司提供，MMP-2兔多抗免疫球蛋白G、VEGF兔多克隆抗體由美國bioworld公司提供，工作濃度1∶100。

判斷標準：按照王立峰等[8]的標準，以間質(zhì)成纖維細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，觀察5個具有代表性的高倍鏡視野（×400），無明顯陽性細胞為（-），局灶陽性為（+），彌漫陽性為（++），為便于統(tǒng)計，將（+）、（++）合并為陽性。上皮細胞質(zhì)及細胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。在染色均勻的區(qū)域，選取5個高倍鏡視野（×400），根據(jù)陽性細胞所占百分比，＜1/3為陰性表達，≥1/3為陽性表達。

1.3 食管癌變過程中微血管密度的測算

參照MAEDA等[9]的方法，先在100倍鏡視野下觀察CD34陽性染色的微血管高密度區(qū)，即熱點區(qū)。在400倍鏡視野下觀察，凡與周圍細胞和結(jié)締組織成份有明顯區(qū)別的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇作為1個微血管；管腔直徑＞8個紅細胞或肌層較厚的血管均不計數(shù)。記錄3個高倍鏡視野下的微血管數(shù)值，取平均值作為每例食管癌變過程中的微血管密度（microvessel density，MVD）值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以率或百分比表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

正常食管組織組20例，男性9例，平均年齡（58.0±2.1）歲；女性 11例，平均年齡（62.0±3.3）歲。低級別上皮內(nèi)瘤變組30例，男性20例，平均年齡（58.0±1.5）歲；女性 10例，平均年齡（63.0±1.8）歲。高級別上皮內(nèi)瘤變組50例，男性29例，平均年齡（57.0±1.1）歲；女性 21例，平均年齡（60.0±5.3）歲。早期癌組25例，男性13例，平均年齡（60.0±2.3）歲；女性12例，平均年齡（63.0±2.6）歲。進展期癌組25例，男性13例，平均年齡（60.0±3.1）歲；女性12例，平均年齡（62.0±4.5）歲。各組性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；各組年齡呈正態(tài)分布，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 α-SMA在食管癌變過程中的表達

α-SMA陽性間質(zhì)成纖維細胞呈梭形或條帶樣，主要存在于癌前病變或癌巢周圍間質(zhì)中，在進展期癌時密集呈條索狀包裹著癌巢。α-SMA在正常食管組織成纖維細胞基本無表達（0/20），低級別上皮內(nèi)瘤變組表達率為10%（3/30），高級別上皮內(nèi)瘤變組表達率為36%（18/50），早期癌組表達率為60%（15/25），進展期癌組的表達率為92%（23/25），α-SMA表達陽性率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。低級別上皮內(nèi)瘤變組與正常食管組織組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高級別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組及進展期癌組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖1。

2.3 MMP-2蛋白在食管癌變過程中的表達

MMP-2蛋白表達主要定位于不典型增生上皮細胞、癌細胞、癌旁纖維母細胞及癌前病變間質(zhì)中的成纖維細胞，胞質(zhì)著色。MMP-2在正常食管上皮、低級別上皮內(nèi)瘤變上皮不表達，在高級別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組、進展期癌組上皮的表達率分別為28%（14/50）、40%（10/25）及 60%（15/25）。低級別上皮內(nèi)瘤變組與正常食管組織組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高級別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組及進展期癌組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖2。

表1 臨床病理特征與α-SMA、MMP-2及VEGF蛋白的關(guān)系 例（%）

圖1 α-SMA在食管不同病變階段間質(zhì)成纖維細胞中的表達 （免疫組織化學(xué)法×200）

圖2 MMP-2蛋白在食管不同病變階段間質(zhì)成纖維細胞中的表達 （免疫組織化學(xué)法×200）

2.4 VEGF在食管癌變過程中的表達

VEGF蛋白表達主要定位于食管不典型增生上皮細胞、食管癌細胞、食管癌相關(guān)纖維母細胞及食管癌前病變間質(zhì)中的成纖維細胞。正常食管鱗狀上皮細胞不表達，低級別上皮內(nèi)瘤變組表達率為3%（1/30），高級別上皮內(nèi)瘤變組表達率為26%（13/50），早期癌組表達率為36%（9/25），進展期癌組的表達率為52%（13/25）。低級別上皮內(nèi)瘤變組與正常食管組織組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高級別上皮內(nèi)瘤變組、早期癌組及進展期癌組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖3。

圖3 VEGF在食管不同病變階段間質(zhì)成纖維細胞中的表達 （免疫組織化學(xué)法×200）

2.5 MVD

正常食管和低級別上皮內(nèi)瘤變黏膜下間質(zhì)中血管稀疏，形態(tài)規(guī)則，而進展期癌血管數(shù)目明顯增多，管腔直徑大小不一，分布無序、雜亂，呈攀狀。正常食管組織組MVD值為（12.3±1.6）；低級別上皮內(nèi)瘤變組為（15.7±2.0）；高級別上皮內(nèi)瘤變組為（20.9±2.2）；早期癌組為（26.4±2.0）；進展期癌組為（30.0±2.3），組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 臨床病理特征與MVD的關(guān)系

2.6 α-SMA、VEGF蛋白與MVD的關(guān)系

α-SMA陰性組的MVD值與α-SMA陽性組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；VEGF陰性組的MVD值與VEGF陽性組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。

3 討論

食管癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因參與、多步驟的緩慢過程，上皮細胞的惡變起主導(dǎo)作用，活化的間質(zhì)成纖維細胞能分泌多種細胞因子，其中MMPs在食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs的來源不僅限于癌細胞，癌間質(zhì)中大量出現(xiàn)的α-SMA陽性的纖維母細胞也是MMPs的重要來源[10-11]。MMPs與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中MMP-2與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[12-14]。MMP-2屬于MMPs中的明膠酶，底物為基底膜上變性的膠原蛋白、明膠、Ⅳ型膠原蛋白，不僅能降解基底膜糖蛋白及ECM成分，而且在腫瘤的新生血管形成中起著非常重要的作用。李書軍等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2主要在食管癌細胞漿內(nèi)或包膜表達，正常組織中無表達，癌組織及轉(zhuǎn)移灶中表達活性顯著增強。DAVIES等[16]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2的過表達與乳腺癌的組織學(xué)分級及侵襲能力有關(guān)，MMP-2通過降解細胞外基質(zhì)而破壞基底膜，使腫瘤細胞更易于浸潤淋巴管。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常食管組織和低級別上皮內(nèi)瘤變中，食管間質(zhì)成纖維細胞的α-SMA表達陰性或陽性率低，間質(zhì)成纖維細胞未發(fā)生活化或活化率低，MMP-2基本不表達或表達很弱，而在高級別上皮內(nèi)瘤變和癌組織中，伴隨著間質(zhì)成纖維細胞的α-SMA表達陽性而大量活化，其表達MMP-2的能力也增強，尤其是在進展期癌間質(zhì)組織中。提示在早期癌階段甚至是癌前病變階段，上皮細胞和間質(zhì)成纖維細胞中MMP-2即開始逐漸蓄積，為腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移做好準備。

有學(xué)者將癌相關(guān)母細胞、內(nèi)皮細胞與癌細胞體外共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞和癌相關(guān)纖維母細胞都向腫瘤團塊內(nèi)浸潤性生長[17]。這表明癌相關(guān)纖維母細胞可促進腫瘤血管的形成。實驗報道，癌相關(guān)纖維母細胞促進微血管增生的能力比正常纖維母細胞高4.7倍，其聚集血管內(nèi)皮細胞的能力是正常纖維母細胞的4.2倍[18]。研究證實，在多種腫瘤組織中，活化的間質(zhì)成纖維細胞可分泌多種生長因子和化學(xué)因子，如趨化因子、MMP-13、肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）等，其通過各自的傳導(dǎo)通路，交互或直接刺激VEGF蛋白的過表達，直接或間接刺激腫瘤血管生成[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌變進程中，隨著α-SMA蛋白的陽性表達，間質(zhì)成纖維細胞逐步活化，VEGF蛋白的表達陽性率逐漸增高，微血管密度逐漸升高。

以往腫瘤的治療都是以癌細胞為靶目標，腫瘤微環(huán)境的提出打破傳統(tǒng)的治療理念，針對間質(zhì)成纖維細胞開發(fā)的藥物，如HGF/c-Met signaling抑制劑SU11274、抗-HGF單克隆抗體NK4等，在人體和動物抑制腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移中也取得初步成效。開發(fā)能夠抑制和阻斷MMP-2、VEGF的抑制劑，并聯(lián)合其他靶點進行抗腫瘤治療，也許能為治愈食管癌帶來新的希望。

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Roles of MMP-2 and VEGF expressions in activated stromal fibroblasts during esophageal carcinogenesis*

Zhi-bin Xu,Li Yuan,Xiu-li Zheng,Shi-jie Wang,Ming-li Wu
(Department of Endoscopy,the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050011,China)

Objective To investigate the expressions of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2)and vascular endothelial growth factor(VEGF)proteins in the stromal fibroblasts in different esophageal lesions from normal tissue,precancerous lesion,to early carcinoma(CIS)and advanced carcinoma(EA).Methods IHC method was uesd to detect the expression of MMP-2 protein and VEGF protein in the stromal fibroblasts and epithelia in different lesions in esophageal carcinogenesis,including normal group (20 cases),low-grade intraepithelial neoplasia(LGIEN)group(30 cases),HGIEN group(50 cases),CIS group(25 cases)and EA group(25 cases)respectively.Antibody CD34 was used to label vascular endothelial cells for microvascular density detection.Results In the esophageal stromal fibroblasts of the normal,LGIEN,HGIEN,CIS and EA groups,the positive-expression rates of MMP-2 protein were 0%(0/20),0%(0/30),28%(14/50),40%(10/25)and 60%(15/25)respectively;and the positive-expression rates of VEGF protein were 0.0%(0/20),3.3%(1/30),26.0%(13/50),36.0% (9/25)and 52.0% (13/25)respectively.The positive expression rates of each protein had significant differences among the five groups (P＜0.05).Conclusions With esophageal cancer progression,the interstitial fibroblasts are activated,the secretion of MMP-2 protrein increases,resulting in degradation of the basement membrane and promotion of cancer invasion.Excessive expression of VEGF protein promotes the formation of interstitial capillaries,accelerates cancer progression and metastasis.

cancer-associated fibroblast;matrix metalloproteinase;carcinogenesis;precancerous lesion

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.008

1005-8982（2017）26-0040-05

2016-09-02

河北省衛(wèi)生廳2015年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃項目（No：20150749）[

吳明利，E-mail：wu.ml@tom.com；Tel：13933083646

（童穎丹 編輯）