呂昱+王立雄+嚴(yán)敏+田仁奎

摘 要：采用固相萃取（SPE）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法建立測定醬油中氨基甲酸乙酯含量的方法，醬油試樣經(jīng)過C18萃取柱凈化提純后，用丙酮-二氯甲烷溶液進(jìn)行洗脫后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）檢測，利用選擇離子掃描模式以及外標(biāo)法進(jìn)行定性定量分析。氨基甲酸乙酯在1-10μg/mL濃度范圍之間線性關(guān)系良好，r2=0.9938，檢測限為0.014μg/mL，定量限為0.048μg/mL，加標(biāo)回收率為97.78%（n=6），用這種方法對(duì)貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量檢測，結(jié)果在340-440μg/mL之間。

關(guān)鍵詞：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；氨基甲酸乙酯；市售醬油；外標(biāo)法

中圖分類號(hào)：O658.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2017）33-0067-03

1 概述

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是一種具有基因致癌的多位點(diǎn)致癌物質(zhì)，在2007年2月被國際癌研究機(jī)構(gòu)將其從2B類（“可能令人類患癌的物質(zhì)”）升級(jí)為2A類（“能令人類患癌的物質(zhì)”）致癌物質(zhì)[1]，[2]，但是在它被定義為可能致癌物質(zhì)以前，它曾經(jīng)在醫(yī)學(xué)上作為抗腫瘤藥物和麻醉劑使用過[3]。它是發(fā)酵食品（如醬油、腐乳、奶酪）和酒精飲品在發(fā)酵過程中的中間產(chǎn)物[4]。

醬油是我國各大菜系中一種傳統(tǒng)的調(diào)味品，它是用豆、麥或者麩皮釀造的液體調(diào)味品，因?yàn)檫@種釀造技術(shù)屬于發(fā)酵工程，在發(fā)酵過程中容易發(fā)生各種復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，生成如氨基甲酸乙酯、氯丙醇、酚醛類等物質(zhì)。其中氨基甲酸乙酯這一物質(zhì)作為一種2A類致癌物質(zhì)，它具有生物遺傳毒性，在進(jìn)入人體后會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)造成不可逆的損傷，它在人體內(nèi)被細(xì)胞色素P450氧化后，氧化產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)Cμ2+調(diào)控的DNA發(fā)生損傷，從而導(dǎo)致癌變[5]。所以越來越多的國家認(rèn)識(shí)到這種物質(zhì)的危害性，國際上現(xiàn)行的氨基甲酸乙酯的檢測方法是氣質(zhì)聯(lián)用檢測法[6]，我國目前對(duì)醬油中氨基甲酸乙酯的含量限定及檢測方法尚無標(biāo)準(zhǔn)，本研究以固相萃取結(jié)合GC/MS建立一種使用外標(biāo)法來測定市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量的方法，為貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯的含量限定作一定參考。

2 試驗(yàn)材料、試劑及儀器

正己烷使用液：（色譜純）天津市化學(xué)試劑廠

二氯甲烷使用液：（分析純）成都金山化學(xué)試劑有限公司

甲醇使用液；（分析純）純度≥99.5%，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

丙酮使用液；（分析純）天津市康科德科技有限公司

氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品；

1號(hào)醬油；味莼園牌黃豆醬油，貴陽味莼園食品有限公司

2號(hào)醬油；味莼園牌特鮮醬油，貴陽味莼園食品有限公司

3號(hào)醬油；味莼園牌衛(wèi)生醬油，貴陽味莼園食品有限公司

4號(hào)醬油；味莼園牌鮮醬油，貴陽味莼園食品有限公司

5號(hào)醬油；黃豆醬油，貴陽市白云區(qū)醬菜廠

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；安捷倫公司7890A/5975C型GC/MS

實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)；四川沃特爾科技發(fā)展有限公司

固相萃取儀；12位方缸固相萃取裝置，月旭材料科技（上海）有限公司

3 實(shí)驗(yàn)條件

3.1 儀器條件

進(jìn)樣口溫度230℃，初始柱溫100℃保持3min，階升20℃至180℃，后運(yùn)行230℃保持2min，分流模式，分流比1：10，溶劑延遲2min，全掃描模式。

3.2 固相萃取條件

醬油中成分復(fù)雜，基質(zhì)種類繁多，極容易對(duì)檢測結(jié)果造成干擾，所以在進(jìn)行儀器分析方法檢測含量之前對(duì)醬油進(jìn)行預(yù)處理，盡可能的進(jìn)行分離純化，將其中所含的EC提取出來[7]。由于氨基甲酸乙酯屬于極性易溶于水的物質(zhì)[7]，為保證醬油中樣品檢測的回收率，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明EC需停留在萃取柱中的萃取時(shí)間在30min，選擇添加丙酮-二氯甲烷（V/V）洗滌液來進(jìn)行洗脫，而且體積比為1：9的丙酮-二氯甲烷洗脫液過C18萃取小柱時(shí)，回收效果最好。

3.3 氨基甲酸乙酯氣質(zhì)聯(lián)用的定性離子的確定

建立一個(gè)氨基甲酸乙酯檢測方法，進(jìn)樣口溫度230℃，選擇分流模式，分流比1：10；柱溫：初始100℃，保持3min，后20℃/min上升至180℃，后運(yùn)行230℃，保持2min，輔助加熱器230℃；MS條件：溶劑延遲2min，全掃描模式，全掃描參數(shù)開始 30結(jié)束450。

以濃度為10μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶夜進(jìn)樣一次，檢測得到一個(gè)峰型較好的峰圖，對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行Nist譜庫檢索，譜庫檢索為氨基甲酸乙酯這一物質(zhì)，并確定保留時(shí)間為5.75min，確定氨基甲酸乙酯的定性離子為44、62、89，總離子流圖如圖1。

4 試驗(yàn)過程

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

4.1.1 EC標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

用分析天平精密稱定100mg在120℃干燥至恒重的EC標(biāo)準(zhǔn)樣品，用甲醇定容至100ml得到濃度為1mg/mL的母液（冰箱里3℃存放）；準(zhǔn)確吸取1000μL母液于100mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度，所得溶液即濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4.1.2 梯度濃度的EC標(biāo)液的配置

準(zhǔn)確量取100μL、1000μL、2000μL、5000μL、10000μL濃度為10μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度，即為0.1μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：按照3.3的方法分別進(jìn)樣5個(gè)不同濃度的EC標(biāo)液，然后以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.2 樣品處理

稱取1號(hào)市售醬油5mL于干燥潔凈的燒杯中，對(duì)固相萃取柱作如下處理，將固相萃取柱裝上樣，依次用2mL甲醇和正己烷活化萃取小柱，接著再用4mL純化水平衡萃取小柱。將燒杯中的醬油倒入萃取小柱中抽真空，讓醬油停留在萃取小柱中保持30min，然后將萃取小柱上的醬油緩慢抽到廢液管中，再用正己烷淋洗以洗去雜質(zhì)，最后用1：9丙酮-二氯甲烷洗脫液以自然流速洗脫，洗脫液置于45℃恒溫水浴鍋中濃縮至0.3mL左右，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中并用甲醇加至1mL，對(duì)2到5號(hào)醬油同操作。endprint

4.3 醬油中氨基甲酸乙酯含量的測定

將4.4中的1至6號(hào)醬油處理液用標(biāo)簽紙做好相應(yīng)標(biāo)記，按順序放入GC/MS自動(dòng)進(jìn)樣器的旋轉(zhuǎn)盤上。調(diào)用方法，并且改變MS掃描模式為離子掃描模式，離子掃描參數(shù)44、62、89。分別進(jìn)樣1至5號(hào)進(jìn)樣瓶，檢測五個(gè)樣品中的氨基甲酸乙酯含量，每個(gè)樣品瓶分別進(jìn)樣6次。

4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取2號(hào)醬油樣品（含量約0.43μg/mL）1mL，分別添加0.5μg/mL和0.75μg/mL和1.0μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液各1mL，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液都添加三份，共九份，按照3.3項(xiàng)下的檢測方法進(jìn)行檢測，檢測出加標(biāo)后的測定值。

加標(biāo)回收率公式：加標(biāo)回收率=（加標(biāo)試樣測定值-試樣測定值）/加標(biāo)量×100%。

4.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取5號(hào)醬油處理液，連續(xù)六次測定數(shù)據(jù)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

4.6 線性范圍

取濃度為10μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)溶夜，GC/MS進(jìn)樣1μL，選擇離子掃描模式檢測，以62離子作為定量離子峰，以氨基甲酸乙酯濃度為橫坐標(biāo)，62離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]，在安捷倫工作站里建立曲線校正方法，得出它的線性條件和線性范圍。

4.7 檢測限的測定

取濃度為2μg/mL的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)液，GC/MS進(jìn)樣1μL，對(duì)其進(jìn)行性能報(bào)告分析，然后根據(jù)信噪比公式D=3S/N，由此推算出學(xué)院GC/MS儀器用這種方法檢測氨基甲酸乙酯的檢測限。

5 結(jié)果分析

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液在1-10μg/mL濃度范圍之間線性關(guān)系良好，實(shí)驗(yàn)所得線性方程為Y=2.906X-7.925（r2=0.9938）。

由性能報(bào)告峰譜圖89，所以其檢測限應(yīng)該為0.014μg/mL，按照信噪比S/N為10得出定量限為0.048μg/mL。

回收率實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析

平均回收率為97.78%，RSD為2.59%，表明該方法準(zhǔn)確度較高，可以準(zhǔn)確地檢測出醬油中的氨基甲酸乙酯的含量。

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

5號(hào)醬油的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=6）為6.5%，表明該儀器精密度良好。

市售醬油中的氨基甲酸乙酯含量確定

貴州地區(qū)5種市售醬油結(jié)果見表1，表明1至4號(hào)醬油中氨基甲酸乙酯濃度較5號(hào)醬油中的多。

6 結(jié)束語

經(jīng)過固相萃取和液液萃取的結(jié)果分析，該方法用到固相萃取對(duì)醬油進(jìn)行凈化和提純是因?yàn)镋C這一物質(zhì)在C18萃取柱中溶解度比在液體中的溶解度高，固相萃取法能有效分離提取醬油中EC。經(jīng)過GC/MS儀器檢測后，利用系統(tǒng)自帶的質(zhì)譜可以輕易的發(fā)現(xiàn)EC這一物質(zhì)，雖然學(xué)院的氣質(zhì)聯(lián)用儀在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)的質(zhì)譜和標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的EC質(zhì)樸圖并不完全一樣，但是這是由于EC的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和我們所用的質(zhì)譜檢測器的檢測原理不同而造成的[9]，這并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

GC/MS檢測法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.5%（n=6），這種方法的檢測限為0.014μg/mL，線性范圍為1-100μg/mL，加標(biāo)回收率可達(dá)到97.78%，加標(biāo)回收率的RSD可達(dá)2.59%，這種方法具有靈敏度高、緊密度良好、線性范圍較廣等特點(diǎn)，貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯含量在0.34-0.44μg/mL（既是340-440μg/Ml）之間，超過20μg/L。結(jié)果表明采用SFE結(jié)合GC/MS法對(duì)貴州地區(qū)市售醬油中氨基甲酸乙酯的檢測進(jìn)行定性、定量分析能達(dá)到檢測目的。

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