孫振, 董立華, 王修杰

610021 成都 四川大學華西醫(yī)院 實驗腫瘤研究室(孫振、董立華、王修杰)；610021 成都 四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院 人體解剖學教研室(董立華)

?綜述?

外泌體與腫瘤干細胞動態(tài)平衡*

孫振, 董立華, 王修杰△

610021 成都 四川大學華西醫(yī)院 實驗腫瘤研究室(孫振、董立華、王修杰)；610021 成都 四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院 人體解剖學教研室(董立華)

外泌體是直徑為30～100 nm，表達特異性表面分子，如CD63、CD81等的胞外囊泡，其內(nèi)包有DNA、mRNA、ncRNAs、蛋白以及脂類等生物活性物質。通過轉運其包含物，外泌體可調(diào)控受體細胞的信號通路及蛋白表達，在介導腫瘤細胞與其腫瘤微環(huán)境中其他細胞間的細胞通訊和物質交流中起重要作用。腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織內(nèi)，具有自我更新和分化潛能的細胞亞群，被認為是導致腫瘤傳統(tǒng)治療失敗和復發(fā)的根源。然而，腫瘤干細胞與非干性腫瘤細胞之間實則處于分化和去分化的動態(tài)平衡狀態(tài)，腫瘤干細胞不再是腫瘤治療的固定靶點，因此，阻斷其相互轉化尤為重要，更是較好的腫瘤治療策略。外泌體作為細胞間信息傳遞的載體，是否參與調(diào)控腫瘤干細胞與非干性腫瘤細胞之間的相互轉化，靶向外泌體及其信號通路是否有利于減少腫瘤干細胞的生成，最終根治腫瘤，值得深入研究。

外泌體；腫瘤干細胞；動態(tài)平衡；腫瘤微環(huán)境；靶向治療

外泌體是起源于核內(nèi)體(endosomes)、大小為30～100 nm的囊泡，幾乎所有細胞都釋放外泌體或胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，并存在于所有體液中。外泌體作為細胞間物質交換的載體，介導細胞-細胞間通訊，參與機體各種生理及病理過程。異質性是惡性腫瘤的重要特征，腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤組織內(nèi)存在一類具有自我更新和分化潛能的細胞亞群，CSCs的存在是導致傳統(tǒng)治療失敗及發(fā)腫瘤復發(fā)的根本原因。然而，CSCs并非是穩(wěn)定的、靜止不變的實體細胞群，在特定的微環(huán)境下，一些已分化、失去干細胞特性的腫瘤細胞(non-CSCs)可通過去分化或重編程等重新獲得干性表型，CSCs與non-CSCs處于分化和去分化的動態(tài)平衡狀態(tài)[1]，CSCs與腫瘤細胞及其腫瘤微環(huán)境中其他細胞間的細胞通訊和物質交流對維持其動態(tài)平衡至關重要。外泌體作為載體，在介導腫瘤細胞與其腫瘤微環(huán)境中其他細胞間的細胞通訊和物質交流中起重要作用；通過轉運腫瘤相關mRNA、miRNA、蛋白等調(diào)控腫瘤的生長、轉移、耐藥、血管生成以及免疫逃逸等過程。外泌體作為信息載體，是否參與non-CSCs與CSCs之間相互轉化及維持腫瘤干細胞動態(tài)平衡及作用機制，是否可以靶向外泌體及其信號通路從而清除腫瘤干細胞，根治腫瘤值得深入研究。為此，本文將對外泌體的生物發(fā)生過程及其內(nèi)容物、腫瘤干細胞、腫瘤干細胞動態(tài)平衡及其影響因素、外泌體在維持腫瘤干細胞表型中的作用、靶向外泌體與腫瘤治療等研究進展作一簡要綜述，以期為相關研究提供參考。

1 外泌體的生物發(fā)生

1.1 外泌體的發(fā)生與內(nèi)容物分選

外泌體(exosome)這一術語是Trams等[2]在20世紀80年代初第一次提出的。他們將在電鏡下觀察到的直徑在40 nm和500～1000 nm且攜帶有5'核苷酸酶活性的兩種類型的囊泡稱為外泌體(exosomes)，并提出這些囊泡可能具有生理學功能。隨后研究揭示了外泌體的內(nèi)體起源[3]，并能夠攜帶多種信號分子[4-6]，研究結果提示外泌體可能是細胞間通訊中的重要介質，由此引發(fā)了對外泌體的研究興趣。隨著其研究的不斷深入，對外泌體的生物發(fā)生過程有了初步認識。

外泌體的生物發(fā)生是一個嚴密有序的過程，其中涉及到多種細胞調(diào)控機制。首先，細胞通過內(nèi)吞作用將胞外配體或細胞組分內(nèi)化形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體在成熟的過程中，通過向內(nèi)出芽形成管腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles, ILVs)，并選擇性的將蛋白、核酸、脂質等物質包裹其內(nèi)，這一過程使早期內(nèi)體轉變成多泡內(nèi)體或多泡體(multivesicular bodies, MVBs)[7]。形成的多泡體一部分與溶酶體融合而被降解，為細胞提供能量物質和結構分子；另一部分通過高爾基體再循環(huán)或通過細胞分泌而被釋放到胞外[5]。

外泌體內(nèi)容物可通過多種機制選擇性的被分選進入ILVs。內(nèi)體蛋白分選轉運裝置(ESCRT)能選擇性的將泛素化蛋白分選進入ILVs，這一過程需要ESCRT-0, -I, -II and -III以及VPS4、VTA1、ALIX/PDCD6IP及TSG101等的參與[8]。脂類如神經(jīng)酰胺、膽固醇，和四跨膜蛋白超家族,如CD9、CD63和CD81也被發(fā)現(xiàn)能介導外泌體蛋白的分選[9]。外泌體mRNA的分選可能由其3′-UTR的Z拉鏈結構介導，而miRNA則可通過與RISCs組成復合物而被分選進入MVBs[10-11]。

1.2 外泌體的釋放與攝取

MVBs形成后，將向質膜邊緣轉移，并與質膜(PM)融合將外泌體釋放到細胞外。這一過程需要細胞骨架蛋白(肌動蛋白和微管)、相關的分子馬達(驅動蛋白和肌球蛋白)、分子開關(小GTP酶)和融合機器(SNAREs)等的參與。Rab蛋白通過與細胞骨架的相互作用參與囊泡的出芽與轉移，負責介導MVBs向質膜轉運[8]，且不同類型的細胞中有不同的Rab蛋白亞型參與介導MVBs向質膜邊緣的轉移[12-14]。SNARE蛋白能在兩膜之間與SNAPs形成復合物并介導兩個細胞器之間的膜融合，SNARE蛋白能夠促進MVBs與質膜的融合[15]。

分泌到胞外的外泌體可被受體細胞通過多種途徑攝取。首先，外泌體通過特異的表面受體綁定到受體細胞表面[16-17]；然后，被受體細胞通過內(nèi)吞作用、胞飲或吞噬作用以及質膜融合等途內(nèi)化[18-19]，從而將內(nèi)含物釋放到受體細胞胞質中，發(fā)揮其生物學功能。

2 外泌體的內(nèi)容物與功能

活細胞分泌的外泌體包含多種生物活性物質，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)9769種蛋白、2838種miRNA以及1116種脂類物質(ExoCarta數(shù)據(jù)庫)。外泌體所攜帶的內(nèi)含物高度可變，取決于起源細胞但又與之有別。更重要的是，外泌體可將這些生物活性物質轉運到鄰近或遠端細胞中，發(fā)揮其相應的生物學功能，從而改變受體細胞的生物學行為。

2.1 蛋白

由于外泌體起源于內(nèi)體，一些內(nèi)體相關蛋白普遍存在于外泌體中，包括膜轉運與融合相關蛋白：Rab-GTP酶、膜聯(lián)蛋白(Annexin)，熱休克蛋白(HSPs), 包括Hsp60、Hsp70和 Hsp90，四跨膜交聯(lián)蛋白(Tetraspanins)，包括CD9、CD63、CD81、CD82，以及MVBs相關蛋白, Alix 和TSG101(廣泛用于外泌體的鑒定[4, 20]。腫瘤細胞來源的外泌體還攜帶有與腫瘤細胞相關的特異性蛋白。膠質瘤細胞(GBMs)釋放的外泌體中富含細胞因子，如VEGF-A、Semaphorin3A以及TGFβ[21]；GBM以及肺癌細胞來源的外泌體中發(fā)現(xiàn)有EGFRvIII存在[22]；鼻咽癌細胞來源的外泌體中高表達HIF1α(與腫瘤細胞的增殖、遷移及血管生成有關)，促進受體細胞遷移[23]；纖維肉瘤和黑色素瘤細胞來源的外泌體中含有MT1-MMP，能激活受體細胞中的MMP2，從而改變受體細胞的胞外基質[24]。還有研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞來源外泌體中包含有FasL和TRAIL，能誘導樹突細胞(DCs)和外周血單個核細胞(PBMCs)發(fā)生凋亡，從而引起免疫抑制，促進腫瘤發(fā)展[25]。有趣的是，外泌體中還含有細胞信號通路相關蛋白質, 如Wnt蛋白[26-27]、Notch配體DLL4[28]，以及介導細胞間通訊的蛋白，如白介素[29]。這些蛋白在腫瘤發(fā)展、維持以及耐藥等方面發(fā)揮重要作用。

2.2 核酸

隨著高通量測序等新一代技術在生物學中的應用，大量的遺傳物質被發(fā)現(xiàn)存在于外泌體中。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中富含一些小非編碼RNA(包括miRNA、snRNAs、snoRNAs)[30]，也包含有特異的mRNA，但只含有極低水平的或無法檢測到的18s和28s RNA[6]。在EVs中甚至還發(fā)現(xiàn)線粒體DNA以及小片段的DNA序列[31-32]。

miRNA是一類長度在20～25 nt的小非編碼RNA，通過靶向mRNA序列，從而參與基因的轉錄后調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA分選進外泌體的過程并不是隨機的，外泌體中的miRNA的種類和表達水平與其起源細胞相關，但又與之有所不同。Guduric-Fuchs等[33]通過分析各種不同細胞系及其釋放的外泌體中miRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)一些miRNA(如，miR-150、miR-142-3p、 miR-451等)被優(yōu)先分選到外泌體中；Ohshima等[34]也發(fā)現(xiàn)let-7 miRNA家族大量存在與胃癌細胞系AZ-P7a來源的外泌體中，而在其它腫瘤細胞的外泌體中的表達水平較低。在腫瘤細胞來源的外泌體中發(fā)現(xiàn)含有腫瘤細胞特異性的miRNA。轉移性乳腺癌細胞的外泌體中富含與miR-200s，并能增強非轉移性的腫瘤細胞的轉移能力[35]；GBM來源的EVs中富含多種致瘤性miRNA，包括miR-21、miR-23a、miR-30a、 miR-221和miR-451，通過轉運這些miRNA，GBM-EVs可改變其微環(huán)境中的非惡性細胞的表型，并促進腫瘤發(fā)展。然而，在腫瘤細胞的外泌體中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤抑制性miRNA，如，促進凋亡和衰老的miR-34 被發(fā)現(xiàn)存在于乳腺癌、前列腺癌、腦瘤及膀胱癌細胞釋放的外泌體中[36-37]。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白，而是以RNA的形式參與染色體修飾、基因的轉錄、mRNA的翻譯以及蛋白功能的調(diào)控[38]。Gezer等[39]在HeLa和 MCF-7細胞及其分泌的外泌體中鑒定出MALAT1，HOTAIR，lincRNA-p21，GAS5，TUG1和CCND1-ncRNA 6種LncRNA，并發(fā)現(xiàn)這6種LncRNA在細胞核其外泌體中的表達水平存在差異。Kogure等[40]也在肝癌細胞的外泌體中發(fā)現(xiàn)一個新的超保守的LncRNA(ucRNA)TUC339。此外，有miRNA海綿作用的環(huán)狀RNA(circRNA)也在腫瘤細胞的外泌體中被發(fā)現(xiàn)，且外泌體中的表達水平遠高于來源細胞的[41]。

外泌體所攜帶的mRNA遠沒有其所攜帶的miRNA豐富，且其在外泌體中的表達水平與來源細胞的也有所不同。研究發(fā)現(xiàn)外泌體攜帶的mRNA在受體細胞內(nèi)翻譯成蛋白，發(fā)揮其功能[42]。

2.3 脂類

與蛋白、核酸相比，對外泌體的脂質組成研究較少。一般來說, EVs(包括外泌體)的脂質成分與起源細胞有共同的特征。但一些研究也發(fā)現(xiàn)，不同類型的胞外囊泡含有一些特異性的脂類，外泌體中富含鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸(PS)、膽固醇以及飽和脂肪酸[43]。另外還發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)苷脂GM3和神經(jīng)酰胺及其衍生物也在外泌體中富集[44]。其中鞘磷脂、膽固醇以及GM3能夠增強外泌體膜的剛性及穩(wěn)定性[45]。然而，存在于ILVs中的LBPA卻不在外泌體中富集。Huarte等[38]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞來源的EVs中甘油二酯(diacyl-glycerol)和鞘磷脂(sphingomyelin)的含量較高，而神經(jīng)酰胺的含量則相對較低。外泌體的脂類及脂代謝相關的酶被發(fā)現(xiàn)參與外泌體的發(fā)生與釋放過程以及內(nèi)容物的分選。Trajokovic等[46]發(fā)現(xiàn)通過抑制劑或siRNA抑制中性鞘磷脂酶(nSMase)的活性后，能夠減少外泌體的釋放。Phuyal等[47]發(fā)現(xiàn)增加前列腺癌細胞中醚脂(Ether lipids)水平不僅能促進外泌體的分泌，同時還改變了外泌體的脂類和蛋白組分。

外泌體所攜帶的內(nèi)容物與其來源細胞在種類和表達水平上都存在差異，這表明外泌體內(nèi)容物是有選擇性的被分選進入ILVs中的。

3 腫瘤干細胞及可塑性

3.1 腫瘤干細胞模型

大量實驗研究表明，腫瘤組織是有各種異質性的腫瘤細胞組成的，其中存在著一小群具有干細胞特性的腫瘤細胞，即CSCs或腫瘤起始細胞(cancer initiating cells,CICs)。因具有自我更新能力和多向分化潛能，且對放化療耐受等特性，腫瘤干細胞被認為是腫瘤生長、發(fā)展以及復發(fā)的根本原因。 支持腫瘤干細胞存在的最早證據(jù)是源自于對惡性白血病的研究。Shimada等[48]在研究鼠的原發(fā)性淋巴瘤細胞時，發(fā)現(xiàn)移植的淋巴瘤細胞中有一小群細胞具有干細胞性質，能夠在受體小鼠的脾臟上形成集落的亞細胞群。隨后，Hamburger等[49]和Bonnet等[50]也通過軟瓊脂克隆的方法也證實鼠或人的原發(fā)性腫瘤組織中有一小部分癌細胞具有無限增殖能力，其研究結果證實了具有自我更新能力的惡性白血病細胞的存在，為腫瘤干細胞假說提供了直接的證據(jù)。隨后，研究者通過免疫熒光技術和流式細胞術成功的從急性髓細胞性白血病(acute myelocytic leukemia，AML)組織中分離CD34+CD38-[51]和CD90-[52]表型的白血病細胞，發(fā)現(xiàn)只有此細胞亞群能夠在NOD/SCID小鼠體內(nèi)形成AML。Al-Hajj等[53]采用相同的方法，從乳腺癌組織中分離得到了CD44+CD24-/lowLineage-的癌細胞，并發(fā)現(xiàn)此亞群細胞在NOD/SCID小鼠中可持續(xù)地形成腫瘤，并有很強的致瘤性。而其余的腫瘤細胞即使注射數(shù)倍數(shù)量的細胞也未能形成腫瘤。此外，通過利用表面分子(CD133、CD44)[54-55]側群分分選和腫瘤球形成分析[56]，研究者成功地從人膠質瘤組織中分離并鑒定出腫瘤干細胞。隨后，在一系列的實體瘤中也都發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細胞的存在[57-58]。

腫瘤干細胞假說認為，腫瘤干細胞是腫瘤組織中唯一具有起始腫瘤、促進腫瘤生長的一小群細胞。在過去幾十年間，腫瘤干細胞在血液癌及實體瘤中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞具有自我更新能力和多向分化潛能，并對放化療具有耐受性。腫瘤干細胞的干性特性被認為是導致腫瘤傳統(tǒng)治療失敗及腫瘤復發(fā)的根本原因。因此，靶向腫瘤干細胞可能是有效的根治腫瘤的新方法。

3.2 腫瘤干細胞的可塑性

腫瘤干細胞具有自我更新能力和多向分化潛能，分化產(chǎn)生多種具有有限增殖能力的腫瘤細胞亞群，由此可區(qū)分或鑒定腫瘤干細胞。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞分化成非干性的腫瘤細胞(non-CSCs)可能并非像之前認識的那樣總是單向不可逆的過程，相反，腫瘤干細胞表型具有可塑性，一些已分化的腫瘤細胞可從非干細胞狀態(tài)轉化到干細胞狀態(tài)，非腫瘤干細胞亞群細胞也可轉化為腫瘤干細胞[59-60]。Vermeulen等[61]研究發(fā)現(xiàn)，從結腸癌中分離的非腫瘤起始細胞在與成纖維細胞共培養(yǎng)后，重新表達CSC標志物，并恢復了致瘤能力，這表明，腫瘤細胞的干性并非是固定不可變的，而是可被調(diào)控的。Roesch等[62]發(fā)現(xiàn)，即使是單一的JARID1B-黑色素瘤細胞也能產(chǎn)生包括JARID1B+細胞(具有腫瘤干細胞特性)在內(nèi)的多種異質的子代細胞。在膠質瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)替莫唑胺處理的非干性GBM 細胞可去分化而獲得干細胞表型和潛能[63]。在其他類型的腫瘤中，也證實了已分化的、失去成瘤能力的腫瘤細胞可通過各種途徑重新獲得干細胞樣表型[64-65]。

上述發(fā)現(xiàn)提示，腫瘤干細胞可能并非是靜止不變的細胞群，而是處于動態(tài)變化的群體。一方面腫瘤干細胞不斷的自我更新和分化產(chǎn)生非干性的腫瘤細胞，另一方面已分化的腫瘤細胞又不斷的去分化，獲得干性成為腫瘤干細胞，以維持腫瘤內(nèi)干細胞的動態(tài)平衡和腫瘤生長復發(fā)。目前，對于腫瘤干細胞這種動態(tài)平衡的調(diào)控機制尚不清楚，但有研究發(fā)現(xiàn)，一些因素可誘導非干性的腫瘤細胞向干細胞轉化。

3.3 CSC可塑性的影響因素

3.3.1 腫瘤干細胞微環(huán)境 正常干細胞(NSC)需要依賴特殊的干細胞微環(huán)境(stem cell niche)來維持其干細胞特性，如自我更新和多向分化潛能[66-67]。類似的，腫瘤干細胞也需要同樣的特殊微環(huán)境—腫瘤干細胞微環(huán)境(CSC niche)來維持其自我更新與分化之間的平衡[68]。腫瘤干細胞與其微環(huán)境間的分子串話在維持其干細胞表型與功能中發(fā)揮著重要的作用。間充質干細胞(MSCs)是腫瘤干細胞微環(huán)境重要組成部分之一，可分泌多種細胞因子，為腫瘤干細胞的產(chǎn)生提供有利的微環(huán)境。乳腺癌干細胞通過分泌IL-6，招募間充質干細胞，并誘導其產(chǎn)生CXCL7細胞因子，以支持腫瘤干細胞表型[69]，且IL-6還能誘導已分化的腫瘤細胞向腫瘤干細胞表型轉化[70]；MSCs還可通過與乳腺癌細胞直接接觸，上調(diào)其miR-199a的表達水平，引起一系列相關microRNA的異常表達，并抑制FOXP2的表達，從而提高腫瘤細胞的干細胞特性[71]。腫瘤干細胞與內(nèi)皮細胞之間的相互作用對腫瘤干細胞表型的維持與其功能的發(fā)揮也是至關重要的。腫瘤微環(huán)境中的內(nèi)皮細胞可通過與腫瘤細胞的直接相互作用或釋放細胞因子來調(diào)控腫瘤干細胞的生物學行為[72]；血管內(nèi)皮細胞能夠通過分泌一氧化氮(NO)激活膠質瘤干細胞中NOTCH信號通路，促進腫瘤干細胞的自我更新并抑制其分化[73]。此外，腫瘤相關的成纖維細胞(CAFs)所釋放的肝細胞生長因子(HGF[61]和膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1)[74]能夠使已分化的腫瘤細胞重新獲得干細胞表型。Mayo等[75]發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞能夠促進乳腺癌細胞的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程，使其獲得腫瘤干細胞特性，包括高致瘤性和對放、化療的耐受性。此外，腫瘤微環(huán)境中的缺氧環(huán)境也能誘導非干性的腫瘤細胞獲得干細胞表型[76-77]。

腫瘤干細胞微環(huán)境是腫瘤干細胞增殖、分化和存活不可或缺的因素，腫瘤干細胞與其微環(huán)境的相互作用有利于其動態(tài)平衡的維持。

3.3.2 EMT及其轉錄因子 EMT是上皮細胞向間充質細胞轉分化的現(xiàn)象，對胚胎發(fā)育過程中的組織形態(tài)發(fā)生至關重要[78-79]。更重要的是，EMT過程的激活與正常和腫瘤細胞的干性的維持密切相關，大量實驗研究證實EMT能夠誘導腫瘤細胞向腫瘤干細胞轉化[80-81]。過表達EMT相關轉錄因子Snail、Twist或FOXC2不僅使乳腺癌細胞發(fā)生表型轉化，同時還提高其腫瘤球形成、軟瓊脂克隆能力和致瘤潛能，并使其獲得CD44high/CD24low(乳腺癌CSCs和乳腺上皮干細胞的標志物)抗原表型[82-83]。這表明EMT過程在腫瘤干細胞狀態(tài)轉變的過程中發(fā)揮著重要的作用。在腫瘤細胞中研究發(fā)現(xiàn)，E-鈣粘蛋白的阻遏物ZEB1-上皮-間質轉化的一個關鍵調(diào)節(jié)因子-能夠通過抑制上皮極性來促進浸潤性導管癌和乳腺小葉癌的去分化[84]。Chaffer等[64]也證實EMT轉錄因子ZEB1能夠介導非干性的基底樣乳腺癌細胞(CD44low)向干細胞狀態(tài)轉化(CD44high)；同時還發(fā)現(xiàn)EMT的誘導劑TGF-β也能有效地促進基底樣乳腺癌細胞中非干細胞向干細胞轉化。此外，F(xiàn)ang等[85]發(fā)現(xiàn)另一個EMT轉錄因子Twist2能夠促進乳腺癌干細胞的自我更新能力。過表達Twist2，能夠提高乳腺癌細胞和乳腺上皮細胞的克隆形成能力，促進腫瘤的生長，并增加CD44high/CD24low細胞亞群的數(shù)量和干細胞標志物的表達。

此外，一些miRNA[86]及腫瘤微環(huán)境中的基質細胞分泌的細胞因子和生長因子[87]也能誘導腫瘤細胞的EMT過程，使分化的腫瘤細胞向腫瘤干細胞轉化。

3.3.3 重編程轉錄因子 重編程轉錄因子OCT3/4、SOX2、c-Myc、KLF4或OCT4、SOX2、NANOG、LIN28的瞬時表達，可使已分化的細胞重新獲取干細胞特性。這些在維持胚胎干細胞(ESCs)的自我更新中起著關鍵的作用的轉錄因子，常常在腫瘤組織中高表達，并能誘導腫瘤細胞去分化使之獲得干細胞表型。Suva等[88]鑒定出幾種與神經(jīng)發(fā)育相關的轉錄因子(POU3F2、SOX2、SALL2和 OLIG2)，發(fā)現(xiàn)過表達其中任一個轉錄因子都可誘導已分化的GBM細胞重編程為干細胞樣的GBM 細胞；Oshima等[89]發(fā)現(xiàn)，轉染OCT3/4、SOX2和KLF4三種轉錄因子可增強結腸癌細胞的干性表型；Zbinden等[90]和Jeter等[91]證實過表達轉錄因子NANOG，能夠誘導腫瘤細胞產(chǎn)生腫瘤干細胞樣表型和特性，并上調(diào)腫瘤干細胞標志物 CXCR4、IGFBP5、CD133和ALDH1的表達水平；而下調(diào)NANOG的表達，則抑制腫瘤細胞的自我更新和成瘤能力。還有研究發(fā)現(xiàn)，重編程轉錄因子OCT4和SOX2在未分化的腫瘤干細胞亞群中顯著高表達，在腫瘤干細胞干性表型的維持中起到重要作用。過表達OCT4能誘導黑色素瘤細胞去分化，向干細胞樣表型轉化，獲得形成腫瘤球的能力，耐藥性、體內(nèi)成瘤潛能增加[92]；Murakami等[93]也發(fā)現(xiàn)過表達OCT4 和SRY能增強肝癌細胞干性表型，而下調(diào)OCT4的表達水平則會抑制腫瘤細胞的干細胞特性[94]。在膠質瘤(GBM)的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達SOX2能夠顯著增強GBM的干細胞表型[95]，而通過RNAi技術沉默SOX2基因的表達可抑制GBM干細胞的增殖，并使其失去腫瘤啟動能力[96-97]。在其他腫瘤中也發(fā)現(xiàn)，SOX2能夠誘導腫瘤細胞的去分化，并賦予其干細胞樣表型[98-99]。

上述研究結果表明，重編程轉錄因子，能夠調(diào)節(jié)腫瘤干細胞的可塑性，在維持腫瘤干細胞動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用。

4 外泌體在維持腫瘤干細胞表型中的作用

如上所述，已分化、非干性腫瘤細胞與腫瘤干細胞之間能夠相互轉化，維持了腫瘤干細胞動態(tài)平衡。腫瘤細胞、腫瘤干細胞與其微環(huán)境間的“物質串話(crosstalk)”是該動態(tài)動態(tài)平衡的重要場地和物質基礎。外泌體作為生物活性物質轉運的載體，介導了多種類型的細胞通訊，由此可以推測，外泌體可能通過轉運干性相關特異分子調(diào)控腫瘤干細胞分化和腫瘤細胞去分化，從而維持腫瘤干細胞動態(tài)平衡。具體見表1。

4.1 外泌體介導腫瘤細胞與其微環(huán)境間通訊

腫瘤干細胞與腫瘤細胞以及腫瘤微環(huán)境中的基質細胞間的物質交流與信號通訊在腫瘤干細胞動態(tài)平衡的維持中至關重要，而胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)的釋放與攝取是介導腫瘤細胞間以及腫瘤細胞與其微環(huán)境間信息交流的一個重要方式[100]。最新研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)釋放的外泌體可促進已分化的腫瘤細胞干性表型增強[101]，并能調(diào)控腫瘤細胞的存活與增殖[102]。Rodriguez等[103]的研究也發(fā)現(xiàn)，干細胞樣的乳腺癌細胞釋放的外泌體中富含干性及轉移相關的mRNA，并能促進受體細胞的致瘤潛能。

4.2 外泌體介導干性通路

Wnt信號通路在生長、發(fā)育、代謝和干細胞維持等多種生物學過程中發(fā)揮重要作用。Wnt通路的異常激活與腫瘤的發(fā)展密切相關[104]，并參與CSC自我更新與分化的調(diào)控[105-107]。近期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體能夠介導受體細胞的Wnt通路的調(diào)控。在結直腸癌(colorectal cancer,CRC)的研究中也發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞的外泌體能夠激活CRCs的Wnt 信號通路，使其表現(xiàn)出干細胞特性，包括成球和致瘤能力，并增加了CRCs中CSCs所占比例[108]。相似的，人間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)來源的外泌體也能夠通過激活Wnt信號通路促進乳腺癌細胞的增殖[109]。淋巴瘤的側群細胞分泌的外泌體可轉運Wnt3a激活受體細胞中Wnt信號通路，介導側群細胞與非側群細胞間的轉化[26]；此外，研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞來源的外泌體可通過PI3K/Akt和MAPK/ERK 信號轉導通路促進腫瘤細胞的增殖[110]；基質細胞釋放的外泌體能夠激活乳腺癌細胞中Notch3信號通路，增強乳腫瘤細胞的治療耐受性[111]。

4.3 外泌體誘導EMT

EMT過程在調(diào)控CSC的自我更新與分化中起著重要的作用，且細胞通過EMT過程可獲得干細胞表型。轉化生長因子β (TGF-β)，其能夠誘導EMT的發(fā)生，在近期研究中被發(fā)現(xiàn)存在于腫瘤細胞來源的外泌體中。例如，慢性粒細胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)來源的外泌體中富含TGF-β1，通過外泌體轉運TGF-β1，促進白血病細胞的增殖、克隆形成以及體內(nèi)成瘤[112]。結腸癌起始細胞釋放的外泌體可轉運cld7到低轉移性的細胞中，誘導其發(fā)生EMT過程[113]。

4.4 轉運重編程轉錄因子

重編程轉錄因子的異常表達能夠誘導non-CSCs向CSCs轉化，外泌體可通過轉運這些轉錄因子亦或通過調(diào)控受體細胞中轉錄因子的表達水平來調(diào)控腫瘤干細胞的動態(tài)平衡。例如，前脂肪細胞分泌的外泌體通過轉運轉錄因子SOX2和SOX9，促進早期乳腺癌形成和體內(nèi)腫瘤生長[114]。

此外，外泌體所含miRNA對腫瘤細胞增殖、自我更新以及致瘤性也具有重要調(diào)控作用。黑色素瘤細胞來源的外泌體高表達miR-222，能夠增加黑色素瘤細胞的惡性表型[115]；胃癌細胞可選擇性將Let-7 miRNAs包裝到外泌體中并釋放到腫瘤微環(huán)境中，進而促進胃癌的惡性表型及腫瘤生長[34]。其他一些致癌性miRNA(oncomiRs)，如miR-21[116]、miR-34a[117]等也發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞來源的外泌體中大量存在。

表1 外泌體在維持腫瘤細胞干性表型中的作用

5 靶向外泌體與腫瘤治療

綜上可見，外泌體介導的細胞通訊在腫瘤發(fā)展與腫瘤干細胞動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用，因此，阻斷外泌體的生物發(fā)生、釋放、轉運及其信號通路很有可能成為另一個新的腫瘤靶向治療措施。

5.1 抑制外泌體的生物發(fā)生

近期研究發(fā)現(xiàn)參與外泌體發(fā)生的幾種關鍵蛋白，如，ESCRT的組分參與MVBs和ILVs的形成[9]。一些研究發(fā)現(xiàn)敲除HRS、STAM1和TSG101能夠減少外泌體的釋放量，抑制這些ESCRT組分可改變囊泡的屬性和內(nèi)容物[118]。外泌體除了通過ESCRT依賴的途徑產(chǎn)生外，鞘脂類神經(jīng)酰胺亦可介導外泌體的產(chǎn)生，一種鹽酸鹽水合物(GW4869)能夠誘導酸性鞘磷脂酶(aSMase)失去活性，用其處理細胞可減弱外泌體內(nèi)體分選和產(chǎn)生[119]。此外，四跨膜交聯(lián)分子(tetraspanin)也能夠介導MVBs的產(chǎn)生，在大鼠胰腺癌細胞表達Tspan8能改變外泌體中的mRNA的含量和蛋白質的組成[120]。如果干擾或抑制四跨膜交聯(lián)分子表達，有可能抑制胰腺癌細胞外泌體的生物發(fā)生。

5.2 抑制外泌體釋放

Rab27家族是一類小GTP酶蛋白，在外泌體的釋放中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。通過干擾RNA技術抑制Rab27a的表達，能夠減少腫瘤細胞釋放外泌體，并抑制腫瘤生長及轉移克隆的形成[121]。其他Rab蛋白，如Rab11、Rab35等也可通過抑制MVBs與質膜的結合從而消弱了外泌體的釋放[12, 13]。另外，一些脂類也被證實參與調(diào)控外泌體的釋放，研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)二酰甘油激酶α的表達可抑制含有Fas配體的外泌體的釋放[122]。大多數(shù)細胞外泌體的釋放與胞內(nèi)Ca2+濃度相關，升高胞內(nèi)Ca2+濃度能夠刺激外泌體的釋放，而Na+/Ca2+交換通道的抑制劑二甲基阿米洛利(dimethyl amiloride, DMA)則能減弱Ca2+濃度升高引起的外泌體的釋放[123]。

5.3 抑制外泌體攝取

細胞可通過多種途徑將胞外環(huán)境中的外泌體攝入到胞內(nèi)，包括胞飲、受體介導的胞吞作用以及直接與質膜融合等，雖然細胞內(nèi)化外泌體的機制還不十分清楚，已有一些研究發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的EVs的攝取似乎與其表面上的磷脂酰絲氨酸有關[124-125]。其他研究發(fā)現(xiàn)GBM細胞的EVs能通過存在于受體細胞上的肝素蛋白多糖(HSPGs)介導被攝取，利用肝素處理細胞，可干擾EVs與受體細胞的綁定，從而抑制了EVs引起的細胞表型的改變[126-127]。此外，通過下調(diào)一些與內(nèi)吞作用相關的蛋白，如動力蛋白2[19]，也能抑制外泌體被受體細胞攝入。

綜上，抑制外泌體的發(fā)生、釋放和攝取可為治療腫瘤提供新的潛在靶點。然而，問題是如何特異性地干擾腫瘤細胞這些途徑而不影響正常細胞外泌體的發(fā)生、釋放和攝取。因此，未來研究要尋找特異性抑制腫瘤細胞的外泌體的發(fā)生、釋放和攝取的策略和方法，以增強其對腫瘤細胞的特異性和靶向性。具體見表2。

表2 靶向外泌體與腫瘤治療可能途徑

6 結語與展望

腫瘤干細胞(CSC)是一群具有干細胞樣特性的腫瘤細胞，其可以驅動腫瘤的生長和復發(fā)，并對目前許多常規(guī)治療具有耐受性。 CSC假說的提出對臨床治療策略將發(fā)生重要影響。然而，越來越多的研究表明，CSC是一群處于分化-去分化的動態(tài)平衡細胞，這就可以解釋為何單一的抗癌或抗CSC藥物不能殺傷所有腫瘤細胞或CSC的原因。外泌體是所活細胞分泌到胞外的納米級囊泡，可通過轉運其內(nèi)容物調(diào)控受體細胞的基因表達和信號通路，從而介導細胞-細胞間的通訊，參與non-CSCs和CSCs間相互轉化，并維持其動態(tài)平衡。外泌體可通過介導受體細胞發(fā)生EMT過程或調(diào)控干性相關的信號通路(如Wnt通路、Notch通路、Hedgehog通路等)以及其他途徑而使non-CSCs重新獲得干細胞表型，向CSCs轉化。因此，我們推測，外泌體可作為non-CSCs和CSCs之間的動態(tài)平衡的調(diào)控器。一方面，來源于CSCs的外泌體，能將干性分子轉移到non-CSCs，使其獲得干性表型；另一方面，腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境中的基質細胞也可通過外泌體增加CSCs的形成和促進腫瘤的進展。

外泌體是所有活細胞分泌到胞外的納米級囊泡，通過轉運其內(nèi)容物介導的細胞與細胞之間的信息傳遞,調(diào)控受體細胞的信號通路和基因表達；通過誘導受體細胞EMT或調(diào)控干性相關的信號通路(如Wnt、Notch、Hedgehog通路等)或通過其他途徑而使non-CSCs重新獲得干性表型，參與non-CSCs和CSCs間相互轉化，并維持其動態(tài)平衡。因此，可以推測，外泌體可能作為維持non-CSCs和CSCs之間的動態(tài)平衡的信息載體(Information carrier)。一方面，來源于CSCs的外泌體，可將干性分子轉移到non-CSCs，賦予其干細胞表型；另一方面，腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境中的其他細胞也可通過釋放或攝入外泌體促進CSCs形成和腫瘤進展。

總之，外泌體作為信息載體，在維持non-CSCs和CSCs之間動態(tài)平衡中起著不可或缺的作用。靶向抑制外泌體的生物合成或通過干擾其形成、釋放和攝取，阻斷non-CSCs與CSCs之間的動態(tài)轉化和動態(tài)平衡，從而清除腫瘤干細胞，根治腫瘤另辟蹊徑。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔相應責任；

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關利益沖突；

學術不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學術不端文獻檢測系統(tǒng)學術不端檢測；

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達到刊發(fā)要求。

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ExosomesandCancerStemCellDynamicEquilibrium*

Sun Zhen1, Dong Lihua1,2,Wang Xiujie1△

(1.LaboratoryofExperimentalOncology,WestChinaClinicalMedicalSchool,SichuanUniversity,Chengdu, 610041,Sichuan,China; 2.HumanAnatomyDepartment,SchoolofPreclinicalandForensicMedcine,SichuanUniversity,Chengdu, 610041,Sichuan,China.)

Exosomes, expressing the specific surface molecules such as CD63 and CD81, are 30-100 nm extracellular vesicles, and contain a broad array of biologically active materials including DNA, mRNAs, ncRNAs, proteins, and lipids. Exosomes modulate signaling pathways and protein expression by transferring their molecular contents into receptor cells, and play crucial roles in mediating intercellular communication between tumor cells and their surrounding microenvironment. Cancer stem cells are a small kind of heterogeneous cells existed in tumor tissues or cancer cell lines. These cells possess stemness phenotype containing self-renewal ability and multi-potential differentiation which was considered as the reason for the failure of conventional cancer therapies and tumor recurrence. However, a highly dynamic equilibrium was found between cancer stem cells and cancer cells and this indicates that cancer stem cells are no more special target and blocking the transformation of cancer stem cells and cancer cells seem to be a more significant therapied strategy. As information transforming carrier between cells, whether exosomes regulated cancer cell transformation among cancer stem cell dynamic equilibrium, and targeting exosome signaling attenuated the formation of cancer stem cells and finally cure cancers, this is worthy of further study.

Exosomes; Cancer stem cells; Dynamic equilibrium; Tumor microenvironment; Targeting therapy

2017- 05- 10

2017- 09- 12

*國家自然科學基金(編號:31371148)

△王修杰，E-mail:xiujiewang@scu.edu.cn

R730.2

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.05.010

Sun Z ,Dong LH, Wang XJ. Exosomes and cancer stem cell dynamic equilibrium[J]. J Cancer Control Treat, 2017,30(5):373-384.[孫振,董立華,王修杰.外泌體與腫瘤干細胞動態(tài)平衡[J].腫瘤預防與治療，2017,30(5):373-384.]