金璐，陳品品，王瀟，趙昱堃，李得康，冀馨寧，吳楠 通信作者

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環(huán)境樣品中抗生素的前處理及檢測方法研究進展

金璐1a，陳品品1a，王瀟1a，趙昱堃1a，李得康1a，冀馨寧1b，吳楠1a 通信作者

（1. 天津農(nóng)學院 a. 工程技術(shù)學院，b. 園藝園林學院，天津 300384）

抗生素的大量使用所導(dǎo)致的環(huán)境問題日趨嚴重，亟需建立有效的抗生素分析方法。但環(huán)境樣品成分復(fù)雜，且抗生素濃度常處于痕量水平，通常需要經(jīng)過復(fù)雜的提取、凈化、濃縮等前處理過程才能進行分析測定。本文系統(tǒng)闡述了環(huán)境樣品中抗生素的各類前處理和檢測方法的原理、應(yīng)用及優(yōu)缺點，并對未來的趨勢進行展望。

環(huán)境樣品；抗生素；前處理方法；檢測方法

抗生素（antibiotics）自20世紀被發(fā)現(xiàn)以來，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療和畜禽養(yǎng)殖業(yè)。但抗生素的大量使用所導(dǎo)致的環(huán)境污染問題日趨嚴重，除了會造成化學污染外，還可能會加速環(huán)境中抗生素耐藥性的傳播和擴散[1]。環(huán)境樣品中抗生素殘留的檢測是目前環(huán)境健康安全評價中的重要課題。但環(huán)境基質(zhì)成分復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，抗生素種類繁多且殘留濃度低，給環(huán)境樣品中抗生素的測定帶來很大難度。本文對不同環(huán)境基質(zhì)中抗生素的預(yù)處理和檢測方法進行綜述，旨在為相關(guān)研究提供方法借鑒。

1 環(huán)境樣品中抗生素的前處理方法

1.1 固相萃取

固相萃取（Solid-Phase Extraction, SPE）是由液-固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來的，可將其近似地看作一種簡單的色譜過程，基于固體吸附劑將目標物吸附，從而實現(xiàn)目標物與干擾物質(zhì)的分離和富集，較常用的方法是使液體樣品通過吸附劑，保留其中待測物，再選用適當強度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量溶劑迅速洗脫待測物。也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓待測物流出；或同時吸附雜質(zhì)和待測物，再用合適的溶劑選擇性洗脫待測物。SPE的操作步驟一般包括活化（除去小柱內(nèi)的雜質(zhì)并創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境）、上樣（將樣品用一定的溶劑溶解，轉(zhuǎn)移入柱內(nèi)并使組分保留在柱上）、淋洗（最大程度除去干擾物）和洗脫（用小體積的溶劑將待測物洗脫下來并收集）。

例如，馬麗麗等[2]用固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（SPE-HPLC-MS/MS）同時檢測土壤中氟喹諾酮類、四環(huán)素類和磺胺類共18種抗生素。其中土樣通過含50%乙腈的磷酸鹽緩沖液（pH＝3）提取后，以SAX-HLB串聯(lián)小柱凈化富集。目標抗生素添加濃度為200和50 μg/kg時，氟喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類的加標回收率分別為67.2%～89.0%，62.2%～85.4%和55.8%～97.4%。同樣方法被用于測定自然水體中5種磺胺類抗生素[3]，試驗比較了兩種萃取柱（HLB和C18）的富集效果，并對水樣的pH值、萃取柱的洗脫溶劑及水樣體積進行了優(yōu)化，回收率為86.8%～97.3%。SPE還被用于分析城市污水處理廠進水和出水中7大類共21種抗生素[4]，在最佳條件下，不同抗生素的回收率在60.5%～109.7％之間。此外，還用于提取畜禽類糞便中土霉素、四環(huán)素和金霉素等四環(huán)素類抗生素[5]。畜禽糞便首先采用EDTA- Mcllvaine緩沖液提取，再用LC-18固相萃取柱富集抗生素，加標回收率介于51.3%～93.7%之間。

SPE吸附劑種類很多，如C18小柱和HLB小柱常用于抗生素的凈化富集。其中HLB小柱吸附劑是由親脂性二乙烯基苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮2種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，對親水和疏水化合物都有較強保留能力，回收率相對大。強陰離子交換柱SAX與HLB小柱串聯(lián)使用時，可去除環(huán)境樣品中的天然有機質(zhì)（如腐殖酸），從而減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾作用。SPE常用的洗脫溶劑有：甲醇、水、乙酸、丙醇、異丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、苯、甲苯四氯化碳、環(huán)己烷、正己烷等。與傳統(tǒng)的液-液萃取法相比，SPE可以提高分析物的回收率，更有效地將分析物與干擾組分分離，減少樣品預(yù)處理過程，操作簡單。

1.2 固相微萃取

固相微萃?。⊿olid-Phase Microextraction, SPME）是以熔融石英光導(dǎo)纖維或其他材料為基體支持物，采取“相似相溶”的特點，在其表面涂漬不同性質(zhì)的高分子固定相薄層，通過直接或頂空方式，對待測物進行提取、富集、進樣和解析。然后將富集有待測物的纖維直接轉(zhuǎn)移到儀器（氣相或液相色譜）中，通過一定方式解吸附（如熱解吸，溶劑解吸），然后進行分離分析。

例如，采用SPME方法對污水處理廠活性污泥中甲砜霉素和氟甲砜霉素進行提取，以活性炭為吸附劑對萃取溶液進行凈化，除去溶液中的色素。甲砜霉素和氟甲砜霉素的加標回收率為94.00%～98.07%，檢出限（S/N＝3）分別為0.008 4 mg/kg和0.015 mg/kg[6]。莊園等[7]以土霉素為模板分子制備了分子印跡SPME涂層, 同時測定牛奶和水樣中四環(huán)素、鹽酸土霉素和金霉素。3種抗生素在100～1 000 μg/L（牛奶）和10～1 000 μg/L（水樣）濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.995 9以上，四環(huán)素、鹽酸土霉素和金霉素的檢出限為40～80 μg/L（牛奶）和5～10 μg/L（水樣）；加標水平為500 μg/L時，回收率為97.8%～109.0%，相對標準偏差（＝7）分別為5.3%～8.2%（牛奶）、3.7%～6.4%（水樣）。SPME結(jié)合高效液相色譜被用于檢測地下水、土壤及糞便中4種常用磺胺類獸藥抗生素[8]，在最佳測試條件下，4種磺胺類抗生素在0.005～10.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9；磺胺噻唑（ST）、磺胺甲基嘧啶（SM）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）和磺胺甲惡唑（SMX）的檢出限分別為1.08、3.56、4.63、1.84 ng/L；其中固相微萃取對于地下水樣的富集倍數(shù)為4 000倍，對實際樣品的加標回收率為69.8%～117.6%。

隨著研究的深入和方法的不斷完善及裝置的改進，SPME已逐步擴展到食品、天然產(chǎn)物、醫(yī)藥、生化、毒理等諸多領(lǐng)域。

1.3 加速溶劑萃取

加速溶劑萃?。ˋccelerated Solvent Extraction, ASE）是在升高溫度（50～200 ℃）和壓力（1 000～3 000 psi或10.3～20.6 MPa）的條件下，用溶劑萃取固體或半固體樣品的新穎前處理方法。溫度和壓力的提高可增加物質(zhì)溶解度和物質(zhì)擴散速率，從而提高萃取效率。結(jié)合使用有機溶劑，可快速有效地從基體中萃取各種待測物。

通過優(yōu)化ASE萃取參數(shù)和凈化條件, 孫寶利等[9]建立了土壤中4種四環(huán)素類抗生素殘留的ASE-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。方法檢出限為2.2～3.2 μg/kg，樣品加標回收率在60.1%～103.8%之間，相對標準偏差為2.6%～4.8%。唐才明等[10]在測污泥和沉積物中微量抗生素時，對比了ASE和超聲波輔助萃取的萃取效率，優(yōu)化了萃取條件。結(jié)果表明，ASE和超聲萃取對目標抗生素的萃取效率相當，而50％甲醇溶液在酸性條件下（pH＝2）萃取效果最好。同樣，孫奉翠[11]也對比這兩種方法對土壤中抗生素的提取效果，ASE方法中，以乙腈-磷酸鹽緩沖液為萃取劑，EDTA處理的硅藻土為分散劑，在壓力1 500 psi、溫度70 ℃、靜態(tài)萃取10 min、循環(huán)1次的參數(shù)下完成萃取。超聲萃取中，以乙腈-磷酸鹽緩沖液為萃取劑，通過振蕩混勻、超聲和離心完成萃取，殘渣反復(fù)提取2次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASE法在提取效率、自動化程度及對實驗人員身體健康影響等方面均優(yōu)于超聲萃取法，但超聲萃取在批量處理方面優(yōu)于ASE法。

1.4 微波萃取

微波萃取（Microwave Aided Extraction, MAE）的原理是在微波場中，吸收微波能力的差異使得基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使待測物從基體或體系中分離，進入萃取劑中。應(yīng)盡量選擇對微波透明或部分透明的介質(zhì)作為萃取劑，選擇介電常數(shù)較小的溶劑，同時要求萃取劑對目標成分要有較強的溶解能力，對萃取成分的后續(xù)操作干擾較小。

胡獻剛[12]利用MAE提取畜禽糞便中抗生素，并對MAE的各參數(shù)（萃取溫度、輻射時間、升溫時間和提取溶液體積）進行正交設(shè)計優(yōu)化，其中萃取溫度對回收率的影響最為明顯，如磺胺嘧啶在40 ℃回收率為110％，在60 ℃回收率為40％，磺胺甲惡唑在40 ℃回收率為70％，在60 ℃回收率為29％。四環(huán)素類抗生素在100 ℃條件下萃取比在60 ℃下回收率要低。和超聲萃取相比，結(jié)果表明MAE具有更高的回收率。

與傳統(tǒng)的萃取方法相比，MAE設(shè)備比較簡單、價格低廉、節(jié)能、節(jié)省溶劑、污染小，表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景和巨大的應(yīng)用潛力。

1.5 磁性固相萃取

磁性固相萃?。∕agetic Solid Phase Extraction, MSPE），也稱為磁納米-微萃取技術(shù)，是以磁性或可磁化的材料作為吸附劑的一種分散固相萃取技術(shù)。在MSPE過程中，目標分析物隨吸附劑一起遷移，最終通過合適的溶劑洗脫待測物，從而與樣品的基質(zhì)分離開來。國明等[13]用MSPE提取環(huán)境水樣中6種痕量四環(huán)素類抗生素，考察并優(yōu)化了吸附和解吸條件，確定出最佳萃取條件，萃取后的目標化合物經(jīng)ZORBAX Eclipse Plus C18柱分離，用HPLC-MS/MS在多反應(yīng)監(jiān)測模式下進行檢測。在優(yōu)化條件下，樣品加標回收率為80.6%～90.0%，日內(nèi)和日間相對標準偏差（RSDs）分別為0.6%～2.5%和1.1%～7.1%。

1.6 基質(zhì)輔助固相分散萃取

基質(zhì)輔助固相分散萃?。∕atrix Assisted Solid Phase Dispersion Extraction, MSPD）是一種較新型的前處理方法，最常用于凈化液體或者黏稠樣品，對于脂類含量較高的基質(zhì)也適用。該法通過將樣品和填料混合研磨，使樣品在固定相顆粒表面均勻分散，從而獲得半固態(tài)樣品，隨后進行裝柱，并通過不同淋洗液進行洗脫而對目標物進行凈化。例如MSPD和HPLC-MS/MS用于分析污泥中10種典型抗生素（磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲氧噠嗪、恩諾沙星、沙拉沙星、達氟沙星和氧四環(huán)素），加標回收率為40.15%～114.73%，檢出限為0.02～0.28 μg/kg[14]。

總之，環(huán)境介質(zhì)中抗生素的預(yù)處理方法多種多樣，具有不同的適用范圍和各自的優(yōu)缺點（表1）， 應(yīng)根據(jù)實際情況選取適合的預(yù)處理方法，才能保證后續(xù)分析的準確性。

表1 環(huán)境樣品中抗生素前處理方法優(yōu)缺點

2 抗生素的檢測技術(shù)

抗生素在環(huán)境介質(zhì)中常以痕量存在（如ng/L、μg/kg級別），且受空間分布影響較大，這給抗生素的檢測帶來了很大難度。在眾多測定方法中，目前較常用的有高效液相色譜、超高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。

高效液相色譜（HPLC）以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器（如紫外、熒光檢測器）進行分析。例如，高效液相色譜-紫外檢測（HPLC-UV）檢測土壤中磺胺類、四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素，回收率分別為72.4％～83.6％，55.2％～65.8％和51.6％～57.9％[15]。賀南南等[16]用高效液相色譜-熒光分析法（HPLC-FLD）檢測沼液中4種氟喹諾酮類抗生素（FQs），采用乙腈和0.01 mol/L四丁基溴化銨作為流動相，外標法定量。4種FQs在0.002～5.000 mg/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，樣品平均回收率在80.4%～105.7%，相對標準偏差為1.0%～5.1%，方法檢出限為0.004～0.010 mg/L。HPLC-FLD也被用于檢測污泥中的FQs，液態(tài)和固態(tài)樣品中FQs的加標回收率分別達到82%～103%和71%～101%[17]。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)，由于其高靈敏度和定性能力，廣泛用于多種基質(zhì)中抗生素的分析。例如，邰義萍等[18]用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）測定了土壤中四環(huán)素、土霉素，金霉素、強力霉素的含量，抗生素濃度范圍為 0.11 μg/kg到48.45 μg/kg。Pan等[19]采用LC-MS方法，在豬糞中同時檢測5種磺胺類藥物、3種四環(huán)素類和1種大環(huán)內(nèi)酯，方法回收率為73.0%～110.6％。此外，還有研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）分析土壤、糞便和堆肥中的9種抗生素和1種激素，不同樣品中的檢出限分別為2～10 μg/kg、3～16 μg/kg和5～15 μg/kg，回收率范圍為63％～121％[20]。Zhu等[21]也采用HPLC- MS/MS測定了地下水及動物飼養(yǎng)廢水中3種四環(huán)素類抗生素。使用快速拆分液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（RRLC-MS/MS），Zhou等[22]在地表水、污水池進水和出水、沉積物、糞便等樣品中同時檢測11類抗生素，方法檢出限在ng/L或ng/g級別，回收率為50％～150％。

隨著技術(shù)的發(fā)展，一些研究采用了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）來分析抗生素，與傳統(tǒng)HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度更高，分析時間短，節(jié)省溶劑，降低了分析成本。但造價較高，且運行時儀器內(nèi)部壓力過大，易產(chǎn)生相應(yīng)問題。吳曉鳳等[23]采用UPLC-MS/MS同時檢測復(fù)雜基質(zhì)中（由豬糞和蘑菇渣混合而成的堆肥原料）3種四環(huán)素類抗生素（四環(huán)素、土霉素和金霉素）及其代謝產(chǎn)物，以乙腈和0.1%的甲酸水溶液為流動相，在電噴霧正離子模式下，用四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀進行定性和定量分析。抗生素及其代謝產(chǎn)物在7 min內(nèi)完成分離。在0～6 mg/kg DW（Dry weight）濃度范圍內(nèi)，抗生素及其代謝產(chǎn)物的標準曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)2均大于0.996 0，重現(xiàn)性較好（＝11，相對標準偏差均小于15%）。檢出限和定量限分別在1.668～17.270 μg/kg和5.561～45.918 μg/kg范圍內(nèi)，表明該方法具有較高的靈敏度。Zheng等[24]也使用該方法分析豬糞施肥的土壤中的四環(huán)素，方法檢出限為0.6～2.5 μg/kg，回收率為23.3％～159.2％。

3 結(jié)論與展望

環(huán)境樣品中抗生素的檢測難題在于抗生素種類繁多且濃度常處于痕量水平，環(huán)境基質(zhì)復(fù)雜，前處理方法繁瑣，檢測方法靈敏性低等。理想的樣品前處理方法是不破壞待測組分的形態(tài)，減少污染，而且能使待測組分與基質(zhì)有效分離。同時，高靈敏度、高準確性、低成本的檢測手段是保證抗生素殘留檢測的關(guān)鍵。在實際分析中，應(yīng)根據(jù)環(huán)境基質(zhì)、目標抗生素以及實驗條件的不同，選擇合適的預(yù)處理和檢測。此外，建立快速、可靠、廉價的抗生素提取和分析方法，以及開發(fā)小型的、高效的自動分離及檢測裝置也是未來研究的熱點之一。

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責任編輯：楊霞

Pretreatment and Detection Methods of Antibiotics in Environmental Samples

JIN Lu1a, CHEN Pin-pin1a, WANG Xiao1a, ZHAO Yu-kun1a, LI De-kang1a, JI Xin-ning1b, WU Nan1a Corresponding Author

（1. Tianjin Agricultural University, a. College of Engineering and Technology, b. College of Horticulture and Landscape, Tianjin 300384, China）

The environmental problems caused by the extensive use of antibiotics are becoming increasingly serious, and it is urgent to establish effective methods for antibiotics analysis. However, due to the complex compositions of environmental samples and trace levels of antibiotics, the samples usually need to go through the complex extraction, purification, concentration and other pretreatment processes before analysis. The principles, applications, advantages and disadvantages of various pretreatment and detection methods of antibiotics in environmental samples are systematically elaborated and future prospects are proposed as well.

environmental samples; antibiotics; pretreatment methods; detection methods

1008-5394（2017）03-0092-05

P641.131；S152.72

A

2017－02－23

天津市大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目“豬場周邊土壤中四環(huán)素類和磺胺類抗性基因的多樣性研究”（201610061014）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃一般項目“天津農(nóng)村土壤中抗生素和抗性基因污染物特征的研究”（14JCYBJC43700）；國家自然科學基金項目“豬糞中抗生素耐藥性在好氧堆肥過程中的消長機制”（21607114）；教育部留學回國人員科研啟動基金“高溫堆肥對豬糞中四環(huán)素類和磺胺類抗生素及抗性基因的去除”（（2015）1098）

金璐（1994－），女，遼寧興城人，本科在讀，主要從事環(huán)境與新能源方面的研究。E-mail：740696566@qq.com。

吳楠（1984－），女，天津市人，講師，博士，主要從事環(huán)境污染物方面的研究。E-mail：nwu@tjau.edu.cn。