視黃醇對(duì)大腸桿菌誘發(fā)的急性乳腺炎大鼠氧化應(yīng)激的作用研究

顧蓓蓓 馬 卉 盧 煒 劉 靜 盧勁曄*

（1.泰州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

視黃醇對(duì)大腸桿菌誘發(fā)的急性乳腺炎大鼠氧化應(yīng)激的作用研究

顧蓓蓓1馬 卉1盧 煒2劉 靜2盧勁曄2*

（1.泰州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

本文探討視黃醇對(duì)大鼠大腸桿菌乳腺炎氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用。選用72只清潔級(jí)SD大鼠，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（n=36）。懷孕后10d起，灌胃視黃醇（溶劑為大豆油）8000I.U/kg·d，連續(xù)灌注10d；對(duì)照組灌胃等體積的大豆油。產(chǎn)后72h，經(jīng)乳頭管灌注LPS 10μɡ/側(cè)到第四對(duì)乳腺內(nèi)。分別于灌注前（0h）及灌注后2、4、8、16和24h（n=6）頸靜脈放血處死大鼠后采樣。髓過(guò)氧化物酶活力檢測(cè)結(jié)果與組織病理學(xué)觀察顯示，視黃醇降低了LPS誘發(fā)炎癥過(guò)程中中性粒細(xì)胞在組織中的積聚與持續(xù)激活，有效控制了細(xì)胞損傷，并加快了組織修復(fù)；同時(shí)，視黃醇處理顯著降低LPS灌注后IL-8及外周血PMN活性氧的釋放。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃視黃醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性乳腺炎大鼠PMN引起的氧化應(yīng)激具有一定的保護(hù)作用。

視黃醇；中性粒細(xì)胞；活性氧；乳腺炎；大鼠

乳腺炎是導(dǎo)致奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一。由于乳腺炎是由多種非特異病原微生物引起的，目前尚無(wú)有效的疫苗進(jìn)行防治；抗生素和糖皮質(zhì)激素雖然對(duì)乳腺炎有一定的治療作用，但是乳汁中的藥物殘留會(huì)危害人的健康[1]。盡管乳腺組織中存在多種抗菌物質(zhì)，如溶菌酶、乳鐵蛋白等，嗜中性粒細(xì)胞（PMN）仍然是乳腺抵御外源病原微生物最主要的效應(yīng)細(xì)胞[2]。

當(dāng)乳腺遭受病原微生物或外源性致熱源侵襲時(shí)，PMN首先被動(dòng)員，從毛細(xì)血管經(jīng)乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)入感染部位，識(shí)別和吞噬入侵病原?；罨腜MN通過(guò)釋放活性氧殺滅病原微生物，但PMN的持續(xù)過(guò)度激活，所產(chǎn)生氧化劑（次氯酸、酪氨?；龋┥蛇^(guò)量，超過(guò)局部抗氧化劑的防御反應(yīng)時(shí)，能降解蛋白多糖，減少細(xì)胞外基質(zhì)與乳腺上皮的粘附性，引起乳腺上皮細(xì)胞的死亡從而促進(jìn)乳腺上皮的脫落和泌乳功能的損傷[3]。體外研究表明活化的PMN釋放的活性氧自由基對(duì)培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性作用[4]。

視黃醇是一類(lèi)天然或人工合成的維生素A及其衍生物，能調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、PMN的功能）[5]。研究表明視黃醇通過(guò)提高機(jī)體的抗氧化水平，抑制機(jī)體超氧化物的產(chǎn)生保護(hù)乳腺組織[6]。本實(shí)驗(yàn)研究了灌喂一定劑量的視黃醇對(duì)LPS誘發(fā)乳腺炎癥引起的中性粒細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用，深入闡明視黃醇對(duì)乳腺組織的保護(hù)機(jī)理。

1 材料與方法

108只清潔級(jí)健康SD大鼠，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，其中雌鼠72只，體重260～300g，均未孕；雄鼠36只，體重350～400g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將雌鼠與雄鼠按2：1同籠飼養(yǎng)，使之交配受孕。大鼠自懷孕第10d起，灌喂8000I.U/kg·d視黃醇（溶解于大豆油），對(duì)照組大鼠灌喂等量的大豆油，連續(xù)灌喂10d。大鼠產(chǎn)后72h經(jīng)乳頭管注入內(nèi)毒素10μg/側(cè)到大鼠第四對(duì)乳腺（雙側(cè)）內(nèi)，正常對(duì)照組注入等量滅菌的生理鹽水。分別于灌注前（定義為0h）及灌注后2、4、8、16和24h（n=6）頸靜脈放血處死動(dòng)物，收集血清及肝素抗凝血500μL，采集乳腺組織，部分中性甲醛液固定，部分置于液氮后轉(zhuǎn)存于-70℃中用于后續(xù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺組織的病理組織學(xué)觀察

圖1 灌注大腸桿菌內(nèi)毒素后乳腺組織PMN的動(dòng)態(tài)變化（H.E.200×）C、T分別為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組灌注LPS前0h，灌注后2、4、8、16、24h乳腺組織PMN的變化

組織病理學(xué)觀察顯示：LPS灌注前對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腺泡結(jié)構(gòu)均清晰可見(jiàn)，腺泡腔內(nèi)乳汁充盈（腺泡內(nèi)均勻分布的紅色區(qū)域?yàn)橹橹?；灌注LPS后，對(duì)照組第4h起腺泡中開(kāi)始出現(xiàn)較多的PMN，同時(shí)，組織損傷開(kāi)始出現(xiàn)，乳汁分泌量明顯減少；組織病理變化第8h最為嚴(yán)重，此時(shí)腺泡腔內(nèi)充滿PMN，致使腺泡結(jié)構(gòu)模糊難辨；第24h結(jié)果顯示乳腺組織損傷有所修復(fù)。與對(duì)照組相比，視黃醇處理加快了PMN向腺泡內(nèi)遷徙及炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，降低了組織損傷的程度；實(shí)驗(yàn)組病理變化最嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)同樣出現(xiàn)在LPS灌注后第8h，但病變程度要明顯輕于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組在第16 h腺泡內(nèi)的PMN數(shù)量已經(jīng)明顯減少，乳腺的泌乳功能也有所恢復(fù)。

2.2 灌注LPS后乳腺組織與血清中MPO的活性變化

圖2 灌注LPS后大鼠乳腺組織和血清中MPO活性的變化

乳腺組織中（圖2 A）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MPO活性均先上升后下降。對(duì)照組灌注LPS后，MPO活性迅速上升，最高峰值出現(xiàn)在第8h（P＜0.01），第16h該酶的活力仍顯著高于0h（P ＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組在第8h達(dá)到峰值（P ＜0.05）后迅速下降，第16h已恢復(fù)至正常水平；血清中（圖2B）的變化規(guī)律與組織中相反，MPO活性無(wú)論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組同0h相比均先降后升，最低點(diǎn)同樣出現(xiàn)在LPS灌注后的第8h，到24h有所恢復(fù)。

2.3 灌注LPS后乳腺組織與血清中IL-8的活性變化

圖3 灌注LPS后大鼠乳腺組織和血清中IL-8的變化

如圖3所示，與0h相比，LPS灌注后第8 h對(duì)照組乳腺組織中IL-8含量極顯著升高8h乳腺組織中IL-8的活性（P ＜0.01），而實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著變化。與相應(yīng)的0h相比，對(duì)照組第8h（P ＜0.01），實(shí)驗(yàn)組第4h（P ＜0.05）、8h（P ＜0.01）血清中IL-8含量顯著升高；與對(duì)照組相比視黃醇處理的實(shí)驗(yàn)組顯著下調(diào)第8hIL-8的含量（P ＜0.05）。

2.4 外周血中性粒細(xì)胞活性氧釋放的動(dòng)態(tài)變化

圖4 LPS灌注后外周血中性粒細(xì)胞活性氧釋放的動(dòng)態(tài)變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖5），LPS灌注乳腺組織后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血PMN活性氧釋放均顯著升高；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，LPS灌注后第16h外周血PMN活性氧的釋放極顯著降低（P ＜0.01）。

3 討論

乳腺炎包括乳腺感染、乳腺炎癥、微循環(huán)和免疫障礙等的綜合癥，是制約奶牛業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。大量循環(huán)血液中的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺組織遷徙，是乳腺炎發(fā)生時(shí)的重要特征[7]。在本研究中，病理切片結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在灌注LPS前乳腺腺泡結(jié)構(gòu)清晰，腺泡腔內(nèi)乳汁充盈，灌注LPS后2h腺泡腔內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)PMN并在第8h達(dá)到浸潤(rùn)高峰，乳腺組織損傷嚴(yán)重，此后PMN浸潤(rùn)程度減輕，第24h基本恢復(fù)至正常水平。MPO是PMN的標(biāo)志酶，組織中MPO活性的高低反映了PMN在組織中的潴留和活化程度[8]，與病理切片結(jié)果一致，灌注LPS后，乳腺組織中MPO活性升高，同樣在第8h達(dá)到峰值，血清中的變化趨勢(shì)則與組織中相反，先降低而后升高，灌注后第8hMPO活性最低，動(dòng)態(tài)反映了循環(huán)血液中PMN向乳腺組織遷徙的過(guò)程。

吞噬細(xì)胞，主要是嗜中性粒細(xì)胞是機(jī)體抵抗感染的主要非特異性防御細(xì)胞，任何PMN功能的障礙均會(huì)影響乳用家畜的生產(chǎn)性能[2]。PMN吞噬病原微生物主要是通過(guò)釋放活性氧自由基（ROS）實(shí)現(xiàn)的，但是ROS的產(chǎn)生在殺滅病原微生物的同時(shí)，對(duì)宿主細(xì)胞和吞噬細(xì)胞本身也會(huì)造成損傷[3]。本研究中，LPS灌注后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，ROS釋放均顯著升高，視黃醇處理極顯著的下調(diào)了LPS灌注后第16h ROS的釋放。該結(jié)果與先前的報(bào)道（第一章）視黃醇能提高機(jī)體的抗氧化能力一致，這可能是視黃醇保護(hù)乳腺組織的重要機(jī)制之一。

LPS是重要的免疫細(xì)胞激活劑，通過(guò)激活NFκB/AP-1刺激單核、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子[9]。白細(xì)胞介素（IL）-8是炎癥發(fā)生時(shí)一種重要的趨化因子，對(duì)PMN有激活作用，可以誘導(dǎo)其變形、趨化、脫顆粒、合成生物活性脂類(lèi)、整合素上調(diào)以及呼吸爆發(fā)等。研究表明視黃醇可以抑制NFκB/AP-1活性從而下調(diào)相關(guān)炎癥因子的基因表達(dá)。在本研究中，LPS灌注后對(duì)照組血清中IL-8顯著升高并在第8 h達(dá)到峰值，視黃醇處理則顯著降低了該時(shí)間點(diǎn)IL-8釋放，表明視黃醇通過(guò)下調(diào)IL-8水平降低PMN活性氧的釋放，從而保護(hù)乳腺組織。

4 小結(jié)

PMN是乳腺發(fā)生感染時(shí)的主要效應(yīng)細(xì)胞，PMN通過(guò)釋放大量高毒性的活性氧在消滅病原微生物的同時(shí)亦會(huì)引起乳腺組織的損傷。孕鼠灌胃視黃醇促進(jìn)PMN迅速遷徙、粘附，發(fā)揮吞噬活性，同時(shí)視黃醇抑制PMN持續(xù)激活，降低活性氧的過(guò)度釋放，減輕PMN對(duì)乳腺組織的損傷。

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江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科研課題（編號(hào)：NSF201609）；江蘇省現(xiàn)代畜牧與新獸藥工程技術(shù)中心開(kāi)放課題（編號(hào)：TGC2XKF1402）；江蘇高校品牌專(zhuān)業(yè)建設(shè)工程項(xiàng)目（PPZY2015C230）。

顧蓓蓓（1983—），江蘇興化人，博士，研究方向：乳腺炎的營(yíng)養(yǎng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究。

盧勁曄（1983—），江蘇邗江人，博士。