陳素昌 彭良玉 王喜連 周忠群 唐 杰 謝 斌

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1疼痛科；2麻醉科，衡陽 421001）

溶血磷脂酸對背根神經(jīng)髓鞘相關(guān)糖蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制的研究

陳素昌1△彭良玉2王喜連1周忠群1唐 杰1謝 斌1

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院1疼痛科；2麻醉科，衡陽 421001）

目的：探討單次鞘內(nèi)注射溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid, LPA)對背根神經(jīng)髓鞘相關(guān)糖蛋白(myeline-associated glycoprotein, MAG)表達(dá)的影響以及其作用機(jī)制；方法：實(shí)驗(yàn)1：C56雄性小鼠隨機(jī)分為人造腦脊液(arti fi cial cerebralspinal fl uid, aCSF)組和LPA組，在注射后24小時、3天和7天處死小鼠取其背根神經(jīng)（dorsal root, DR)，采用原位雜交(western blot, WB)方法測定DR中MAG的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)2：C56雄性小鼠隨機(jī)分為aCSF組，LPA組，鈣蛋白酶抑制劑X (calpain inhibitor X,CalX) + LPA組和aCSF + CalX組，在注射后0天、24小時、3天、7天和14天測定小鼠機(jī)械性閾值及熱閾值。實(shí)驗(yàn)3： C56雄性小鼠隨機(jī)分為aCSF組，aCSF+LPA組和CalX+LPA組，在注射后24小時處死小鼠取其背根神經(jīng)，采用WB和免疫熒光的方法觀察CalX對MAG的影響。結(jié)果：①與aCSF組對比，LPA注射后24小時MAG顯著降低，持續(xù)到第3天，第7天降低不明顯；②與aCSF組和aCSF + CalX組對比，LPA組在術(shù)后1～7天有明顯的熱痛敏和機(jī)械痛敏；與LPA組對比，CalX+LPA組熱痛敏和機(jī)械痛敏明顯減輕；③與aCSF組和aCSF+LPA組對比，CalX+LPA組WB結(jié)果顯示CalX能完全阻止LPA誘導(dǎo)DR中 MAG的下調(diào)，免疫熒光和WB結(jié)果是一致的。結(jié)論：單次鞘內(nèi)注射LPA可以誘導(dǎo)背根神經(jīng)MAG的下調(diào)，且是通過鈣蛋白酶激活介導(dǎo)的。

溶血磷脂酸；背根神經(jīng)；髓鞘相關(guān)糖蛋白；鈣蛋白酶抑制劑

LPA是一種重要的信號分子，其廣泛分布于血清、血漿、其它生物活性液體、組織以及腦[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，LPA啟動神經(jīng)病理性疼痛的其中一個機(jī)制是誘導(dǎo)外周神經(jīng)的脫髓鞘。髓鞘(myelin)分別是由少突膠質(zhì)細(xì)胞 (oligodendrocyte cells)和施旺細(xì)胞 (Schwann cells) 胞膜沿著中樞和外周神經(jīng)的軸突螺旋包裹而成的。組成髓鞘的相關(guān)蛋白包括髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)、髓鞘蛋白0 (myelin protein zero, MPZ)、外周髓鞘蛋白22 (peripheral myelin protein 22, PMP22)、蛋白脂質(zhì)蛋白(proteolipid protein, PLP)和髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein, MAG)等。Fujita[2]等證實(shí)在在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，LPA1受體的激活介導(dǎo)了髓鞘蛋白MBP、PMP22、和MPZ的下調(diào)。MAG是一種跨膜的糖蛋白，選擇性的固定于外周施旺細(xì)胞和中樞少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂鞘的軸突外周（結(jié)旁區(qū) paranode), 因此認(rèn)為其介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞和軸突之間的信號傳遞[3]。P?iv?l?inen[4]等人在離體實(shí)驗(yàn)當(dāng)中證實(shí)了MAG在髓鞘形成當(dāng)中的表達(dá)要早于MBP，因此MAG在髓鞘的形成和維持中發(fā)揮著重要的作用。鈣蛋白酶(calpain)是一種廣泛分布的鈣離子敏感性的蛋白酶。calpain的激活在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中對于神經(jīng)細(xì)胞的凋亡以及髓鞘蛋白、骨架蛋白的降解發(fā)揮了重要的上游通路調(diào)節(jié)作用[5,6]。本研究將探討LPA對背根神經(jīng)MAG表達(dá)的影響及機(jī)制來進(jìn)一步闡述神經(jīng)病理性疼痛脫髓鞘的外周機(jī)制。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)采用C56雄性小鼠（體重20～24 g），動物由南華大學(xué)動物中心提供。室溫保持在22±2℃和50%～60%的濕度，12～12 h 白天-黑夜循環(huán)照明。動物在安靜環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，能自由攝取食水。所有實(shí)驗(yàn)步驟都盡量減輕動物的痛苦并按照有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物的使用原則操作。實(shí)驗(yàn)1：將小鼠隨機(jī)分為對照組及LPA組，于LPA注射后不同時間點(diǎn)（24 h、3 d、7 d）處死小鼠，取其背根神經(jīng)采用western blot方法測定DR MAG的表達(dá)變化，每組3只。實(shí)驗(yàn)2：將小鼠隨機(jī)分為aCSF組，LPA組，CalX+LPA組及aCSF+CalX組，每組在不同時間點(diǎn)（注射后0 d、24 h、3 d、7 d、14 d）測定小鼠機(jī)械性閾值及熱閾值，每組8只。實(shí)驗(yàn)3：將小鼠隨機(jī)分為aCSF組，aCSF+LPA組和CalX+LPA組，在注射24 h后處死小鼠，取其背根神經(jīng)采用western blot和免疫熒光的方法測定DR MAG的表達(dá)變化，每組6只。

2.動物行為學(xué)測試

（1）機(jī)械性閾值測定

機(jī)械痛敏測試裝置為透明的有機(jī)玻璃箱，無底，箱底為金屬網(wǎng)制成（網(wǎng)格為6 mm×6 mm）。為了消除心理因素，首先把小鼠放入有機(jī)玻璃箱適應(yīng)一個小時，直至小鼠洗臉、搔抓、行走等活動完全停止，處于安靜狀態(tài)時止。用傳感器指針（美國IITC電子 Von Frey測痛儀 1601）通過網(wǎng)格垂直刺激小鼠右后肢的足心部。引起小鼠右后肢回縮的壓力值即定義為疼痛的機(jī)械性閾值。設(shè)定20 g的壓力值為分界點(diǎn)，避免組織損傷。以10 min的間隔對右后肢重復(fù)測量3次，3次的均值用于最后的統(tǒng)計學(xué)分析。

（2）熱閾值測定

熱痛敏的測試裝置為有機(jī)玻璃箱，無底，箱底為可以加熱的玻璃平板。為了消除心理因素，首先把小鼠放入有機(jī)玻璃箱適應(yīng)一個小時，直至小鼠洗臉、搔抓、行走等活動完全停止，處于安靜狀態(tài)時止。用熱刺激器（美國IITC）放在玻璃平板的下面，投射光源的焦點(diǎn)正對著小鼠的右后肢的足心部。通過熱刺激器上的鏡子可以看到小鼠的腳底面。設(shè)定20 s為界點(diǎn)，避免組織損傷。以10 min的間隔對右后肢重復(fù)測量3次，3次的均值用于最后的統(tǒng)計學(xué)分析。

3.給藥方法

LPA和CalX由人工腦脊液(arti fi cial CSF aCSF;125 mM NaCl, 3.8 mM KCl, 1.2 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM glucose, pH 7.4).溶解。鞘內(nèi)注射是采用Hylden和Wilcox[7]等人描述的方法。以左掌壓住鼠身，拇、中指按住腰骶部兩側(cè)固定，食指按在雙側(cè)骶骨前緣連線正中點(diǎn)（可觸及L5棘突）指示進(jìn)針點(diǎn), 以微量注射器自L5和L6之間的間隙進(jìn)針。CalX在LPA鞘內(nèi)注射30分鐘之前注射。

4.標(biāo)本檢測

（1）Western印跡法測定MAG蛋白表達(dá)

取出不同時段或不同藥物處理后的小鼠L4-5雙側(cè)的DR,切割成四等份,分別按重量加入Tris裂解緩沖液（50mM Tris-Hcl,PH6.8; 2%SDS; 10%甘油；ddH2O。使用前要加蛋白酶抑制劑）, 低溫勻漿，超聲破碎，15 000 rpm低溫離心,取上清液。用Micro-BCA（Micro BCA Protein Assay Kit pierce）法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品（20 μg）加入2μl上樣緩沖液,混勻后，沸水煮沸10 min。取煮沸后的等量蛋白樣品約30 μl，加入SDS-PAGE膠孔中，于80 V恒壓，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電泳60 min，再100 V恒壓，分離膠電泳90 min。將完整的凝膠取下，轉(zhuǎn)移到鋪著海綿和濾紙轉(zhuǎn)移夾中組成“三明治”結(jié)構(gòu)，將事先在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡10 min的PVDF膜(Millpore Japan)緊貼其上，排除氣泡，在轉(zhuǎn)移緩沖液中380 mA恒流轉(zhuǎn)移90 min。取出PVDF膜，在TBS中輕搖5 min，用封閉液（TBST, 5%w/v脫脂奶粉） 25℃封閉2 h在10 ml一抗anti-MAG (Chemicon USA) 1:500稀釋液中(TBST, 5%w/v BSA)把PVDF膜和一抗共同輕搖孵育，4度過夜。次日，用TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min。然后用10 ml過氧化物酶標(biāo)記的二抗anti-MAG (Chemicon USA) 1:500孵育，25℃2個小時。用TBST清洗PVDF膜，洗脫3次， 每次10 min，后用1ml ECL (Pierce chemical, USA)室溫孵育3 min。排出過量液體，在暗室中使其與X光片(Kodak, Rochester, NY)緊密接觸，使X光片感光數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影，定影，沖洗，晾干，掃描并進(jìn)行計算機(jī)圖象分析。PVDF膜用strip液50℃洗脫30 min后重新封閉及加一抗二抗，以β-tubulin,rabbit anti-?-tubulin polyclonal antibody (Santa cruz USA) 1:500作為內(nèi)參確認(rèn)上樣量基本相同。

（2）免疫熒光法測定MAG的表達(dá)

用異戊巴比妥鈉（50 mg/kg, i.p.）深麻醉小鼠，暴露心臟，灌流針插入左心室，剪開右心房，先快速灌注4℃的K+-free PBS (NaCl; NaH2PO4;Na2HPO4; CaCl2;MgCl2 PH7.4)，然后用4%的多聚甲醛灌注，解剖小鼠并取L4-5背根神經(jīng)，4%的多聚甲醛后固定3 h后，轉(zhuǎn)入25%蔗糖中脫水4℃過夜，然后包埋進(jìn)行冰凍切片（leica CM3050，德國），切片厚度為10 μm，收集切片于放有0.01 M K+-freePBS的24孔板內(nèi)，4℃短暫保存。免疫熒光組織化學(xué)操作按照J(rèn)i[8]等人報道的方法進(jìn)行。本研究中所使用的是間接法的免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)。即先用特異性抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的抗體，再用熒光素標(biāo)記的抗特異性抗體（間接熒光抗體）與特異性抗體相結(jié)合，形成抗原一特異性抗體一間接熒光抗體的復(fù)合物。本實(shí)驗(yàn)用的熒光素為Alexa Fluor 488。Alexa Fluor 488激發(fā)光源為藍(lán)色，呈綠色熒光。收集的DRG冰凍切片立即用0.01 M K+-free PBS洗3次，洗片時動作輕柔，避免損傷切片。每次5 min，然后在室溫下用配好的封閉液（脫脂牛奶/BSA溶于TBST中，配成5%）作用于切片,一般每孔用200 μl配置好的封閉液，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。1 h 后吸去封閉液并加入小鼠 anti-MAG antibody(Chemicon USA)(1:300)，搖床一個小時后放在4℃冰箱過夜，吸去一抗，用PBST 洗3次，加入標(biāo)記Alexa Fluor 488的anti-mouse IgG二抗(1:300)，避光室溫下作用1 h，再用PBST洗3次，隨機(jī)挑選切片貼于載玻片上，立即于自動熒光顯微鏡(Bio-Zero Japan)下觀察并拍照。背根神經(jīng)免疫染色結(jié)果的定量，參照J(rèn)i[9]等人的方法通過計數(shù)每張切片上的免疫陽性細(xì)胞而獲得。隨機(jī)挑取4張實(shí)驗(yàn)小鼠的脊髓切片，在熒光顯微鏡下計數(shù)每張切片上的陽性細(xì)胞的百分比，從而可得到每只小鼠的陽性細(xì)胞百分比的均數(shù)。每個實(shí)驗(yàn)組至少4 只，最后計算出每組陽性細(xì)胞百分比的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)。背根神經(jīng)則用計算機(jī)軟件(ImageJ)統(tǒng)計陽性面積比例。結(jié)果陽性面積百分比也用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)記錄。

5. 統(tǒng)計學(xué)方法

行為學(xué)測試結(jié)果均采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±SD)表示，P＜ 0.05 認(rèn)為差異有顯著性。四組之間的分析采用單因素方差分析，然后用Tukey post hoc test檢測組間差異。免疫熒光染色結(jié)果先用單因素方差分析處理數(shù)據(jù)，然后用Tukey post hoc test檢測組間差異。統(tǒng)計學(xué)分析通過SPSS進(jìn)行，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SME)表示，P＜ 0.05 認(rèn)為差異有顯著。Western-blotting的結(jié)果：膠片用計算機(jī)輔助圖像處理系統(tǒng)(Germany,KONTRON IBAS 2.0)進(jìn)行條帶密度分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示，不同時間點(diǎn)條帶密度的差異用Student's t-test進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜ 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. LPA單次鞘內(nèi)注射背根神經(jīng)MAG蛋白的表達(dá)變化

在單次鞘內(nèi)注射LPA (10 nmol) 24 h之后，我們觀察到背根神經(jīng)MAG的表達(dá)明顯下降，第3天的時候還是下降，但是第7天的時候與Vehicle組比未有明顯變化。與LPA組比，Vehicle組背根神經(jīng)的MAG表達(dá)未變化（n= 3，見圖1）。

圖1 A：用?-tubulin標(biāo)準(zhǔn)化和表示為Vehicle處理組的百分比之后的統(tǒng)計圖； B：MAG不同時段western blot的標(biāo)準(zhǔn)圖；*P ＜ 0.05，與 Vehicle組比Fig.1 A: Diagram of percentage of Vehicle group standardized by ?tubulin; B: The level of MAG receptor protein at different time points. *P ＜ 0.05, compared with Vehicle group

2.小鼠機(jī)械性閾值及熱閾值的變化

鞘內(nèi)注射LPA組注射后第1天，立即出現(xiàn)了機(jī)械性痛敏和熱痛敏，一直持續(xù)到術(shù)后第7天，第14天時恢復(fù)到正常，但在預(yù)先給予CalX組（n=5），機(jī)械刺激撤足閾值和熱縮足潛伏期均明顯的升高，但沒有完全逆轉(zhuǎn)。而在2個對照組Vehicle-aCSF和CalX-aCSF未出現(xiàn)機(jī)械性痛敏和熱痛敏（n=8,見圖2）。

圖2 A：比較不同組之間的熱縮足潛伏期的變化；B：是比較不同組之間的機(jī)械刺激撤足閾值的變化*P ＜ 0.05，與Vehicle-aCSF組對比；#P ＜ 0.05，與Vehicle-LPA組對比Fig.2 A: The alterations of paw withdrawal thermal latency in different groups; B: The alterations of paw withdrawal mechanical threshold in different groups*P ＜ 0.05, compared with Vehicle-aCSF group; #P ＜ 0.05, compared with Vehicle-LPA group.

3. CalX注射后LPA誘導(dǎo)的背根神經(jīng)MAG表達(dá)的變化

預(yù)先鞘內(nèi)給予鈣蛋白酶抑制劑X CalX，然后鞘內(nèi)注射LPA（10 nmol)，western blot結(jié)果顯示背根神經(jīng)MAG的表達(dá)與Vehicle + LPA組比是升高的，完全能阻止其下降；免疫熒光染色結(jié)果顯示，背根神經(jīng)MAG的表達(dá)比Vehicle + LPA組也是上調(diào)的。但在Vehicle組背根神經(jīng)MAG的表達(dá)未有明顯變化（n=3,見圖 3、4）。

討 論

神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括解剖結(jié)構(gòu)改變和功能受損，常由多種機(jī)制引起。包括外周敏化、中樞敏化[10]。在外周的機(jī)制當(dāng)中，背根神經(jīng)的脫髓鞘發(fā)揮著非常重要的作用。前期研究顯示，LPA受體1 (LPA1)對于外周神經(jīng)受損引起的神經(jīng)病理性疼痛的啟動是關(guān)鍵的[11]。單次鞘內(nèi)注射LPA可以模擬神經(jīng)神經(jīng)病理性疼痛。而LPA發(fā)揮這樣的作用，部分是因?yàn)長PA介導(dǎo)的背根神經(jīng)脫髓鞘的作用[12]，鞘內(nèi)注射LPA (1 nmol), 24小時內(nèi)可以引起背根神經(jīng)的脫髓鞘，這與在坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型中觀察到的結(jié)果一樣，但是預(yù)先給予鞘內(nèi)BoTN/C3可以阻止其發(fā)生。同時在離體培養(yǎng)背根神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，已經(jīng)證實(shí)給予LPA之后可以通過破壞施旺細(xì)胞引起A纖維的脫髓鞘，這樣就導(dǎo)致A纖維直接與Remark纖維束中的C纖維接觸[13]。在鞘內(nèi)注射LPA和部分坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎小鼠中只有背根神經(jīng)脫髓鞘，而脊神經(jīng)沒有，說明在體內(nèi)脫髓鞘只特定的發(fā)生在背根，靠近入髓地方。另外，在在體損傷模型和離體培養(yǎng)中，LPA1受體的激活介導(dǎo)了髓鞘蛋白的下調(diào)，比如MBP、PMP 22、和MPZ[13]但關(guān)于LPA誘導(dǎo)脫髓鞘的與MAG的關(guān)系不清楚。本研究從LPA對MAG這樣的蛋白來更進(jìn)一步研究LPA誘導(dǎo)的背根神經(jīng)脫髓鞘的機(jī)制。

圖3 A：用?-tubulin標(biāo)化和表示為Vehicle處理組的百分比之后的統(tǒng)計圖；B：MAG的western blot結(jié)果 *P ＜ 0.05，與Vehicle組對比；#P ＜ 0.05，與Vehicle+LPA處理組對比Fig.3 A: Diagram of percentage of Vehicle group standardized by ?tubulin；B: The level of MAG receptor protein at different groups.*P ＜ 0.05, compared with Vehicle group; #P ＜ 0.05, compared with Vehicle+LPA group.

圖4 A, B, C：MAG的免疫熒光染色結(jié)果A：aCSF對照組；B：單純LPA對照組，MAG的表達(dá)下降；C：預(yù)先給予CaIX完全阻止了MAG的表達(dá)減少；D圖是用內(nèi)參?-tubulin標(biāo)化和表示為Vehicle處理組的百分比之后的統(tǒng)計圖 *P ＜ 0.05，與Vehicle組對比；#P ＜ 0.05，與Vehicle+LPA組對比 Scale bar =20 μm.Fig.4 A, B, C：immuno fl uorescence staining in different groups A：aCSF group; B：LPA group, the expression of MAG decreased; C：The decrease of MAG totally inhibited by CaIX pretreatment;D：Diagram of percentage of Vehicle group standardized by ?-tubulin. *P ＜ 0.05, compared with Vehicle group; #P ＜ 0.05, compared with Vehicle+LPA group. Scale bar = 20 μm.

在本研究中，單次鞘內(nèi)注射LPA24小時后背根神經(jīng)MAG明顯的下降，一直持續(xù)到第3天，這說明MAG的降解參與了LPA1受體誘導(dǎo)的背根神經(jīng)脫髓鞘。而且，我們的研究中MAG下調(diào)的結(jié)果與Fujita[2]等人在背根神經(jīng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)的LPA誘導(dǎo)髓鞘蛋白MBP下調(diào)的結(jié)果在時間點(diǎn)上存在明顯的相似性。除此之外，MAG只是髓鞘蛋白中的一種，髓鞘蛋白還包括MBP、PMP22和MPZ等，這些蛋白對于髓鞘的形成和維持髓鞘的完整性都很重要[14]，但是它們的作用又不盡相同。MBP、PMP22和MPZ主要是位于致密髓鞘，而MAG主要是位于非致密髓鞘（比如說結(jié)旁區(qū)）和施旺細(xì)胞胞膜外周軸突，在髓鞘上的位置不同使MAG可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞與軸突的相互作用[3]。因此LPA誘導(dǎo)背根神經(jīng)MAG的下調(diào)從結(jié)構(gòu)和功能上減少了髓鞘的完整性而導(dǎo)致長期的背根神經(jīng)脫髓鞘。另一方面，MAG通過與Nogo受體、神經(jīng)節(jié)苷脂和配對的免疫球蛋白受體B相互作用被認(rèn)為是一種神經(jīng)生長的抑制劑[15-18]。因此LPA誘導(dǎo)的MAG的下調(diào)可能導(dǎo)致軸突牙生，而產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛的時候不同神經(jīng)纖維之間的交叉相互作用，這樣可能導(dǎo)致傳導(dǎo)正常觸覺的纖維而產(chǎn)生疼痛（觸覺誘發(fā)痛）和中樞神經(jīng)的敏化。我們的研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)預(yù)先30分鐘鞘內(nèi)注射calpain抑制劑CalX能阻止LPA誘導(dǎo)的MAG的下調(diào)和明顯減輕LPA模擬的神經(jīng)病理性疼痛癥狀。

Calpain是一種細(xì)胞質(zhì)的半胱氨酸蛋白酶，在神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理情況下都發(fā)揮重要的作用[19,20]。calpain激活的時候能夠與許多的底物相互作用，包括MBP和MAG[21,22]。在實(shí)驗(yàn)過敏性的腦脊髓炎（脫髓鞘疾病多發(fā)性硬化的一種動物模型)模型中，鈣蛋白酶可以介導(dǎo)MBP、PLP和MAG等蛋白的降解。而且，在多發(fā)性硬化疾病中中炎癥因子比如腫瘤壞死α（TNF-α)和INF-γ 的激活可以增強(qiáng)calpain的表達(dá)和活性[23,24]。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LPA誘導(dǎo)的MAG下調(diào)是Calpain的激活介導(dǎo)的。然而，對于LPA是怎么樣誘導(dǎo)calpain的激活還需要進(jìn)一步的研究?；赾alpain在病理性神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛作用，因此calpain抑制劑對于脫髓鞘的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病是一個重要的新的治療靶點(diǎn)。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對于單次鞘內(nèi)注射LPA誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛行為，calpain抑制劑CalX能明顯的減輕，但是不能完全逆轉(zhuǎn)。這說明在LPA誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)病理性疼痛行為中還存在LPA誘導(dǎo)的其他機(jī)制。在慢性坐骨神經(jīng)壓迫性損傷模型中，calpain可以介導(dǎo)神經(jīng)受損以后背根神經(jīng)早期的細(xì)胞因子，包括TNF-α和白介素1β（IL-β）的表達(dá)[25]，而這些前炎癥因子對于神經(jīng)病理性疼痛的行為是非常重要的。因此我們得到的結(jié)論是：LPA可以誘導(dǎo)背根神經(jīng)MAG的下調(diào)且是通過calpain激活介導(dǎo)的。這可以為進(jìn)一步明確calpain抑制劑的鎮(zhèn)痛機(jī)制提供依據(jù)。

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THE STUDY OF EFFECT AND MECHANISM OF LYSOPHOSPHATIDIC ACID ON EXPRESSION OF MYELINE-ASSOCIATED GLYCOPROTEIN IN DORSAL ROOT

CHEN Su-Chang1, PENG Liang-Yu2, WANG Xi-Lian1, ZHOU Zhong-Qun1, TANG Jie1, XIE Bin1
(1Department of Pain Management；2Department of Anesthesiology, The First Af fi liated Hospital of Nanhua University, Hengyang 421001, China)

Objectives: To investigate the effects and mechanism of lysophosphatidic acid (LPA) on expression of myeline-associated glycoprotein (MAG) in dorsal root (DR). Methods: Experiment 1: Male C56 mice were randomly divided into artificial cerebralspinal fluid (aCSF) group and LPA group. Western blot was used to observe the MAG expression in the DR at different time points (on post-injection 24 hours, day 3, day 7). Experiment 2: Male C56 mice were randomly divided into aCSF group, LPA group, calpain inhibitor X(CaIX) + LPA group and aCSF + CalX group. We tested mechanical hyperalgesia and thermal hyperalgesia at different time points (post-injection day 1, day 3, day 7, day 14) by using Von Frey fi lament test and thermal test. Experiment 3: Male C56 mice were randomly divided into aCSF group，aCSF+LPA group and CalX+LPA group. Immuno fl uorescence technique and western blot were used to test the effect of CalXafter post-injection 24 hours. Results:①Compared with aCSF group, we found that intrathecal injection of LPA down-regulates MAG in the DR. The most obvious reduction in MAG levels occurred at 24 hour post-injection and it also decreased on day 3, but it was not signi fi cant on day 7; ②Compared with aCSF group and aCSF+CalX group,it showed that LPA induced thermal hyperalgesia and mechanical allodynia during post-injection day 1 to day 7. Compared with LPA group, it showed a significant inhibition of LPA-induced thermal hyperalgesia and mechanical allodynia in CalX+LPA group during post-injection day 1 to day 7. ③Compared with aCSF group and aCSF + LPA group, it could completely blocked MAG decreased and similar results were obtained with immuno fl uorescence in CalX + LPA group. Conclusion: The expression of MAG in DR was decreased after the treatment of LPA , and it was mediated by the activation of calpain.

Lysophosphatidic acid; Dorsal root; Myeline-associated glycoprotein; Calpain inhibitor

△通訊作者 cscbruce@163.com

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.05.005