PGC-1α過表達逆轉(zhuǎn)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體功能降低和凋亡*

耿慧霞, 李鶯歌， 石貞玉， 厲永強， 王 來△

(河南大學(xué) 1護理與健康學(xué)院， 2生命科學(xué)學(xué)院， 河南 開封 475001)

PGC-1α過表達逆轉(zhuǎn)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體功能降低和凋亡*

耿慧霞1, 李鶯歌2， 石貞玉1， 厲永強1， 王 來2△

(河南大學(xué)1護理與健康學(xué)院，2生命科學(xué)學(xué)院， 河南 開封 475001)

目的探討過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α(PGC-1α)基因過表達對氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體功能及細胞凋亡的影響。方法采用RT-PCR的方法從C57BL/6乳鼠大腦皮層獲取PGC-1α的全基因序列，并克隆到真核表達載體pEGFP-N1上，經(jīng)PCR初步鑒定后轉(zhuǎn)染原代皮層神經(jīng)元，Western blot鑒定PGC-1α的表達情況，成功構(gòu)建PGC-1α真核表達載體pEGFP-N1-PGC-1α。分別將轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和pEGFP-N1-PGC-1α載體的皮層神經(jīng)元進行OGD/R處理，分別采用MitoTracker Red染色、流式細胞術(shù)、ATP代謝檢測試劑盒和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測線粒體質(zhì)量分數(shù)、活性氧簇(ROS)和ATP生成、細胞凋亡以及caspase-3激活的變化。結(jié)果PGC-1α過表達可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體生成能力的降低和ROS的生成(P<0.05)，增強ATP的合成能力(P<0.01)，抑制神經(jīng)元的凋亡(P<0.01)并降低caspase-3的激活(P<0.05)。結(jié)論PGC-1α過表達可通過促進線粒體生成、抑制ROS的產(chǎn)生和維護線粒體功能而抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。PGC-1α可以作為開發(fā)腦缺血再灌注損傷藥物的靶標之一。

過表達； 皮層神經(jīng)元； 氧糖剝奪/復(fù)氧； 細胞凋亡； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α

腦卒中是心腦血管疾病中最嚴重的疾病類型，占心腦血管疾病死亡患者的三分之一，嚴重威脅著人類的身體健康。然而，目前對腦卒中患者神經(jīng)元損傷和凋亡的機制研究表明，興奮性毒性、Ca2+超載、氧自由基形成和炎癥損傷等都不能完全闡明該病理過程，因此在臨床上對該疾病的治療缺少有效的治療藥物。最近的研究表明，腦缺血再灌注后，神經(jīng)元內(nèi)線粒體生成能力降低、超微結(jié)構(gòu)破壞和動力學(xué)內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂等引起的線粒體功能降低，導(dǎo)致能量枯竭，以及線粒體凋亡途徑的激活可能是腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷和凋亡的重要機制之一[1-5]。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)，作為細胞內(nèi)重要的共轉(zhuǎn)錄因子，參與多種生理和病理過程，在能量代謝、炎癥、糖尿病以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用[6-9]。研究表明，PGC-1α是促進線粒體基因轉(zhuǎn)錄和表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，同時可促進細胞內(nèi)線粒體的生成[10]。研究表明，缺血再灌注后，神經(jīng)元內(nèi)線粒體動力學(xué)過程紊亂，生成能力降低，PGC-1α表達下降，ATP生成能力降低，導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡[11-12]。pEGFP-N1是一類增強型的真核生物表達載體，已成功在肝細胞、神經(jīng)細胞系、原代神經(jīng)元和大腦內(nèi)過表達外源基因[13-15]。因此，本文構(gòu)建PGC-1α的pEGFP-N1真核表達載體并轉(zhuǎn)染原代皮層神經(jīng)元，觀察PGC-1α過表達對氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation， OGD/R)誘導(dǎo)神經(jīng)元線粒體質(zhì)量分數(shù)、功能和細胞凋亡的影響，為開發(fā)以維護線粒體功能為靶標的治療藥物提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料和試劑

真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1和大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。原代皮層神經(jīng)元來源于C57BL/6乳鼠(出生后24 h內(nèi))的大腦皮層。

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、BCA蛋白定量試劑盒、高糖和無糖DMEM培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27和MitoTracker Red等試劑購自Life Techno-logies；限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ、BamHⅠ以及T4 DNA 連接酶購自NEB；活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)測定熒光探針購自碧云天生物技術(shù)有限公司，鼠抗PGC-1α抗體、鼠抗caspase-3抗體和兔抗β-actin抗體購自Santa；ATP代謝檢測試劑盒(CellTiter-Glo? 2.0 Assay)購自Promega；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠純化試劑盒購自TransGen Biotech；RIPA裂解液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol提取液購自康為世紀生物科技有限公司；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；其它試劑均為分析純。

2方法

2.1載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 根據(jù)GenBank中的小鼠PGC-1α基因序列(NM_008904)，采用Primer 5軟件設(shè)計引物，上游引物為5’-CGCCTCGAGCCACCATGGCTTGGGACATGT-3’，下游引物為5’-CGCGGATCCTTACCTGCGCAAGCTTCTCTG-3’，分別在引物的5’端添加XhoⅠ和BamHⅠ的酶切位點，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。根據(jù)Trizol提取液說明書，提取乳鼠大腦皮層總mRNA，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明步驟以O(shè)ligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA為模板，添加上、下游引物。反應(yīng)條件為： 96 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)； 72 ℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物凝膠回收后，與真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1分別進行XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，T4 DNA 連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-PGC-1α，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，PCR初步鑒定。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代皮層神經(jīng)元，Western blot檢測PGC-1α的表達情況。

2.2原代神經(jīng)元培養(yǎng) 在培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元前，以0.5%多聚賴氨酸鋪板，37 ℃過夜。次日取出以超純水沖洗3次，超凈臺內(nèi)晾干備用。乳鼠用乙醚麻醉，快速取腦，解剖顯微鏡下分出兩側(cè)皮層并仔細剝除腦膜和血管等纖維成分，用眼科剪剪切至約1 mm×1 mm×1 mm的小塊。以0.25%的胰蛋白酶(1∶250)溶液，37 ℃水浴消化15 min后，含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。加入適量脫氧核糖核酸酶(DNase， 1×105U/L)，反復(fù)吹打成細胞懸液。200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾后，濾液以1 000 r/min離心5 min，棄去上清。以DMEM培養(yǎng)基重懸細胞后計數(shù)，以1×109/L的密度接種于培養(yǎng)板中。細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種4 h后更換為神經(jīng)元培養(yǎng)液(Neurobasal+10% B27)。此后每3 d以神經(jīng)元培養(yǎng)液半量換液。在體外培養(yǎng)6 d時進行pEGFP-N1和pEGFP-N1-PGC-1α質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。

2.3構(gòu)建氧糖剝奪/復(fù)氧模型 將分別轉(zhuǎn)染有pEGFP-N1和pEGFP-N1-PGC-1α質(zhì)粒的皮層神經(jīng)元，采用氧糖剝奪/復(fù)氧方法造模[4,11]，用預(yù)溫不含鈣離子的D-Hanks液沖洗2次后，加入無糖DMEM培養(yǎng)基，置于缺氧罐內(nèi)，以95% N2和5% CO2混合氣置換缺氧罐內(nèi)氧氣，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行2 h氧糖剝奪。氧糖剝奪后，添加神經(jīng)元培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h模擬復(fù)氧過程。

2.4線粒體質(zhì)量分數(shù)檢測 將OGD/R處理后的神經(jīng)元棄上清，緩慢用預(yù)溫PBS沖洗3遍。添加含30 nmol/L MitoTracker Red的神經(jīng)元培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)30 min。PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS沖洗3遍，用含DAPI的65%磷酸甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態(tài)。

2.5ROS及ATP含量的檢測 OGD/R處理后的原代皮層神經(jīng)元棄上清，添加含10 μmol/L超氧陰離子探針的培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)30 min，棄上清，預(yù)溫PBS重新3次，0.25%胰蛋白酶消化，離心，重懸于PBS溶液，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS的生成情況。根據(jù)CellTiter-Glo? 2.0 Assay試劑盒樣品操作說明書，將處理的樣品用96微孔板發(fā)光檢測儀(Microplate Luminometer)檢測神經(jīng)元內(nèi)ATP的相對含量。

2.6TUNEL檢測細胞凋亡 原代神經(jīng)元爬片、轉(zhuǎn)染，經(jīng)OGD/R處理后，棄培養(yǎng)基。4%多聚甲醛室溫固定細胞爬片20 min，PBS清洗3次，每次5 min。根據(jù)一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書依次添加相應(yīng)試劑。熒光顯微鏡下拍照。

2.7Western blot實驗 RIPA法提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。12% SDS-PAGE分離目的蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃過夜孵育 I 抗，TBST沖洗3遍，添加辣根過氧化物酶標記的 II 抗，室溫1 h，TBST沖洗3遍，ECL試劑盒顯影曝片。Quantity One 4.62圖像分析軟件進行條帶灰度分析。

3統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理

用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較時采用t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1PGC-1α過表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取陽性克隆進行PCR初步檢測，在2 300 bp處具有目的片段，見圖1A。提取陽性質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染原代皮層神經(jīng)元，48 h后提取神經(jīng)元總蛋白，Western blot檢測PGC-1α的表達情況，與轉(zhuǎn)染pEGFP-N1組相比較，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-PGC-1α組中PGC-1α的表達顯著增高(P<0.01)，見圖1B。

2PGC-1α過表達對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體質(zhì)量和功能的影響

MitoTracker Red檢測結(jié)果顯示，OGD/R處理后，pEGFP-N1-PGC-1α組神經(jīng)元的線粒體質(zhì)量分數(shù)高于pEGFP-N1組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A；神經(jīng)元內(nèi)超氧化物的檢測結(jié)果顯示，PGC-1α的過表達降低OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元ROS的產(chǎn)生，見圖2B；線粒體生成ATP能力的檢測結(jié)果顯示，OGD/R處理后，pEGFP-N1-PGC-1α組神經(jīng)元ATP的生成能力大于pEGFP-N1組(P<0.01)，見圖2C。

Figure 1. Construction of recombinant plasmid pEGFP-N1-PGC-1α. A： recombinant plasmid pEGFP-N1-PGC-1α was identified by PCR; B: recombinant plasmid pEGFP-N1-PGC-1α was identified by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vspEGFP-N1 group.

圖1PGC-1α過表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建

3PGC-1α過表達對OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的影響

OGD/R處理后，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的神經(jīng)元凋亡個數(shù)明顯增加，而pEGFP-N1-PGC-1α質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染抑制了神經(jīng)元的凋亡(P<0.01)，見圖3。

4PGC-1α過表達對凋亡執(zhí)行蛋白表達的影響

提取皮層神經(jīng)元總蛋白，對細胞凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的檢測結(jié)果顯示，OGD/R誘導(dǎo)原代皮層神經(jīng)元caspase-3的激活形式增加，而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-PGC-1α質(zhì)粒的皮層神經(jīng)元抑制了caspase-3激活形式的增加，表明PGC-1α的過表達抑制OGD/R誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)元caspase-3的激活，見圖4。

討 論

腦缺血再灌注損傷是腦卒中患者神經(jīng)損傷的主要病理過程，興奮性毒性、Ca2+超載、氧自由基形成和炎癥反應(yīng)等理論并不能詳細闡明該機制，最近的研究表明，線粒體生成能力降低和動力學(xué)紊亂等導(dǎo)致的線粒體功能降低可能是該病理過程的重要機制[16-18]。線粒體作為細胞內(nèi)的重要細胞器，主要通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP給細胞供能，因此，代謝活躍且能量需求較高的細胞或組織內(nèi)線粒體的含量較高，如心肌細胞和神經(jīng)元，研究表明，這兩類細胞內(nèi)線粒體總體積分數(shù)約占細胞體積的30%[19-20]。因此，這些組織的細胞內(nèi)線粒體生成能力破壞導(dǎo)致線粒體數(shù)量減少，能量產(chǎn)生能力降低，最終導(dǎo)致細胞凋亡。本研究顯示，氧糖剝奪/復(fù)氧處理原代皮層神經(jīng)元后，確實發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元內(nèi)線粒體的質(zhì)量分數(shù)降低、活性氧生成增加、功能損傷， ATP生成能力降低等，該結(jié)果與前期的研究一致[11]。

Figure 2. The effect ofPGC-1αover-expression on mitochondrial mass and function in cortical neurons induced by OGD/R. A: mitochondrial mass was stained by MitoTracker Red; B: ROS was detected by flow cytometry； C: ATP level was detecfed by ATP metabolic assay kit. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vspEGFP-N1 group.

圖2PGC-1α過表達對OGD/R誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元線粒體質(zhì)量和功能的影響

Figure 3. The effect ofPGC-1αover-expression on TUNEL positive cells in cortical neurons induced by OGD/R. Mean±SD.n=3.**P<0.01vspEGFP-N1 group.

圖3PGC-1α過表達對OGD/R誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元TUNEL陽性細胞數(shù)的影響

PGC-1α、核呼吸因子(nuclear respiratory factor，NRF)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)是參與細胞內(nèi)線粒體生成的重要調(diào)控因子，三者之間彼此具有上下游的線性關(guān)系，如PGC-1α調(diào)控NRF1的表達，以及輔助NRF1調(diào)控TFAM的轉(zhuǎn)錄和表達，由此可見， PGC-1α是調(diào)控線粒體生成的關(guān)鍵因子[21]。本研究構(gòu)建PGC-1α的真核表達載體，轉(zhuǎn)染皮層神經(jīng)元，觀察氧糖剝奪/復(fù)氧對神經(jīng)元線粒體質(zhì)量分數(shù)和功能以及神經(jīng)元凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGC-1α過表達抑制OGD/R誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元線粒體質(zhì)量分數(shù)降低，逆轉(zhuǎn)氧糖剝奪復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體生成的降低。對線粒體功能的研究表明，OGD/R增加轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的神經(jīng)元內(nèi)ROS的生成，降低神經(jīng)元內(nèi)ATP的生成，PGC-1α過表達逆轉(zhuǎn)該過程，抑制神經(jīng)元內(nèi)超氧化物的升高，增強ATP的生成能力。TUNEL結(jié)果顯示，OGD/R增強轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的皮層神經(jīng)元的凋亡，促進caspase-3的激活，PGC-1α過表達抑制OGD/R誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡的增加，抑制caspase-3的激活，說明pEGFP-N1-PGC-1α質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染增加神經(jīng)元內(nèi)PGC-1α的過表達，增加線粒體的生成，抑制神經(jīng)元內(nèi)超氧化物的增加，維護線粒體的功能，從而降低氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。

Figure 4. The effect ofPGC-1αover-expression on the protein levels of caspase-3 in cortical neurons induced by OGD/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspEGFP-N1 group.

圖4PGC-1α過表達對OGD/R誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元caspase-3的影響

綜上所述，神經(jīng)元過表達PGC-1α可以促進線粒體生成、降低超氧化物的產(chǎn)生并增強線粒體的功能，最后抑制氧糖剝奪復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。這提示PGC-1α可以作為開發(fā)治療腦缺血再灌注損傷藥物的靶標之一。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Over-expression of PGC-1α reverses mitochondrial function reduction and apoptosis in OGD/R-induced neurons

GENG Hui-xia1, LI Ying-ge2, SHI Zhen-yu1, LI Yong-qiang1, WANG Lai2

(1SchoolofNursingandHealthSciences，2SchoolofLifeScience,HenanUniversity,Kaifeng475001,China.E-mail:wanglai@henu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of over-expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α (PGC-1α) on mitochondrial morphology and cell apoptosis in the cortical neurons with oxygen glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R).METHODSThe whole gene sequence ofPGC-1αwas obtained from the cerebral cortex of C57BL/6 mice by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1. The pEGFP-N1-PGC-1α was identified by PCR, and transfected into cortical neurons. The level of PGC-1α expression was identified by Western blot. The cortical neurons transfected with pEGFP-N1 and pEGFP-N1-PGC-1α vectors were treated with OGD/R. The mitochondrial mass, reactive oxygen species (ROS) and ATP production, cell apoptosis and changes of cleaved caspase-3 were detected by MitoTracker Red staining, flow cytometry, ATP metabolic assay kit and TUNEL.RESULTSOver-expression ofPGC-1αinhibited the decrease in mitochondrial biogenesis capacity and the ROS formation of OGD/R neurons (P<0.05), enhanced the ability of ATP synthesis (P<0.01), inhibited neuronal apoptosis (P<0.01) and decreased the activation of caspase-3 (P<0.01).CONCLUSIONPGC-1αover-expression inhibits neuronal apoptosis with OGD/R treatment by promoting mitochondrial biogenesis, inhibiting the production of ROS and maintaining mitochondrial function. PGC-1α may be used as a target for the development of cerebral ischemia/reperfusion injury drugs.

Over-expression; Cortical neurons; Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation; Apoptosis; Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α

1000- 4718(2017)11- 2078- 06

2017- 05- 02

2017- 07- 20

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(No. 162300410102)；河南省博士后科研資助項目(No. 2015051)；河南省高等學(xué)校重點科研項目(No. 15A180031)

△通訊作者 Tel: 0371-23880292; E-mail: wanglai@henu.edu.cn

R743； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.025