黃小霏，林業(yè)輝，江潤(rùn)昌，周 杏，李國(guó)偉，高豆豆

重癥肺炎支原體肺炎患兒支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ水平及臨床意義

黃小霏，林業(yè)輝，江潤(rùn)昌，周 杏，李國(guó)偉，高豆豆

重癥肺炎支原體肺炎；肺泡灌洗液；細(xì)胞因子；兒童

肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）感染作為小兒下呼吸道感染的一個(gè)不可忽視的問(wèn)題，已受到臨床越來(lái)越多的重視。MP感染可引起重癥肺炎，如壞死性肺炎，肺大葉實(shí)變，中至大量胸腔積液，合并閉塞性支氣管炎等表現(xiàn)［1］。目前認(rèn)為，MP 感染除了對(duì)機(jī)體細(xì)胞直接產(chǎn)生損害外，其所引起的免疫反應(yīng)在肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。該研究通過(guò)檢測(cè)重癥MPP患者支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的白細(xì)胞介素-4（IL-4）及干擾素-γ（IFN-γ），研究Th1/Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答的狀況及其臨床意義，以期為MPP的診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 觀察組 （重癥MPP組）：2014年8月—2016年6月筆者所在醫(yī)院住院治療的重癥MPP患者 30例，年齡 1～11歲，平均 4.4歲；男 11例，女19例；均符合《諸福堂實(shí)用兒科學(xué)》MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］并符合以下 1 條或以上［1］：（1）壞死性肺炎改變；（2）肺大葉實(shí)變伴中至大量胸腔積液；（3）影響呼吸功能或合并其他系統(tǒng)功能障礙；（4）合并閉塞性支氣管炎；（5）合并全身炎癥反應(yīng)綜合征；（6）起病急、癥狀重、肺大葉實(shí)變，對(duì)單一大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療反應(yīng)不佳。以非MPP和支氣管異物患者作為對(duì)照組：（1）非MPP組。30例均符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，影像學(xué)提示有肺大葉實(shí)變，但病原學(xué)為非肺炎支原體；年齡10月至9歲，平均4.25歲；男17例，女13例。（2）支氣管異物組。同期收治的確診為支氣管異物患者20例；年齡1.1～8歲，平均3.6歲；男 11例，女9例；病程在2 d以內(nèi)；無(wú)發(fā)熱，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及C反應(yīng)蛋白均正常，并排除過(guò)敏性疾病及免疫相關(guān)性疾病。重癥MPP組與非MPP組及支氣管異物組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有患者均未使用過(guò)腎上腺皮質(zhì)激素及人血免疫球蛋白、胸腺素等免疫抑制藥和免疫調(diào)節(jié)藥?；颊呒覍倬橥猓?bào)該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2 ．1 標(biāo)本的采集 （1）BALF的采集。所有患者行纖維支氣管鏡檢查（治療）。支氣管肺泡灌洗按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（草案）［3］中操作方法進(jìn)行。用37℃滅菌生理鹽水10～15 ml分3次灌洗患側(cè)支氣管肺段（觀察組、對(duì)照組）或一側(cè)支氣管（對(duì)照組），收集肺泡灌洗液5 ml，將回收的灌洗液立即用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾除去黏液，后裝入塑料離心管內(nèi)，在4℃下以1200 r/min離心10 min，取上清液－70℃儲(chǔ)存，用作可溶性成分的檢測(cè)。（2）血樣的采集。所有病例均于入院第2天清晨采取空腹靜脈血2 ml；重癥MPP組及非MPP組患者于住院第7天清晨再次采血2 ml，以2500 r/min的速度離心5 min取血清，置－30℃保存待測(cè)。

1．2．2 IL－4 及 IFN－γ 的測(cè)定 采用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)患者BALF和血清中IL－4及IFN－γ的濃度。人細(xì)胞因子ELISA試劑盒由美國(guó)ADL公司生產(chǎn)，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒中的說(shuō)明書進(jìn)行。根據(jù)吸光度 （A）值及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出IL－4和IFN－γ的含量。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用方差分析 （兩兩比較采用LSD），獨(dú)立樣本兩組均數(shù)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，用直線相關(guān)分析計(jì)算相關(guān)系數(shù)，判定各測(cè)定值之間的相關(guān)程度，p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 重癥MPP組、非MMP組和支氣管異物組BALF中IL-4及IFN-γ濃度比較 重癥MPP及非MMP組患者BALF中IL－4和IFN－γ濃度及IL－4/IFN－γ比值明顯高于支氣管異物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．01 或 0．05）。 重癥 MPP 組與非 MMP 組患者 BALF中 IL－4和 IFN－γ濃度及 IL－4/IFN－γ比值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。 見(jiàn)表1。

2．2 三組急性期血清中IL-4及IFN-γ濃度比較急性期重癥MPP及非MMP組患者血清中 IL－4和IFN－γ濃度明顯高于支氣管異物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （p＜0．01 或 0．05）； 重癥 MPP 血清中 IL－4 和IFN－γ濃度及IL－4/IFN－γ比值與非MPP組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。 見(jiàn)表2。

2.3 三組恢復(fù)期血清中IL-4及IFN-γ濃度比較恢復(fù)期重癥MPP組患者血清中IL－4明顯高于非MMP組及支氣管異物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （p＜0．01 或 0．05）；重癥 MPP 組患者血清中 IFN－γ 濃度及IL－4/IFN－γ比值與非MPP組及支氣管異物組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。 見(jiàn)表3。

表1 三組BALF中IL-4及IFN-γ濃度比較（x±s）

表2 三組急性期血清中IL-4及IFN-γ濃度比較（x±s）

表3 三組恢復(fù)期血清中IL-4及IFN-γ濃度比較（x±s）

2.4 重癥MPP患者BALF和血清中IL-4及IFN-γ濃度比較 重癥MPP患者BALF中IL-4和IFN-γ水平高于血清標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。 見(jiàn)表4。

表4 重癥MPP患者BALF和血清中IL-4及IFN-γ濃度比較（x±s）

2.5 重癥MPP患者BALF和血清中各檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性分析 BALF與血清中IL-4和IFN-γ檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)，r分別為 0．56、0.61（p＜0．01）。

3 討論

目前認(rèn)為免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制在MPP中起著重要作用，并以適應(yīng)性免疫為主導(dǎo)。適應(yīng)性免疫反應(yīng)的擾亂即表現(xiàn)為免疫失衡，可能與疾病嚴(yán)重程度和肺外癥狀相關(guān)［4］。

IL-4和IFN-γ是多效的細(xì)胞因子，在細(xì)胞的固有免疫和適應(yīng)性免疫方面具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)功能。IFN-γ主要由活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生，其主要功能是激活巨噬細(xì)胞，抗病毒，促進(jìn)MHC分子表達(dá)和抗原提呈，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞分化［5，6］。 IL-4 由 Th2 細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等產(chǎn)生，它能刺激B細(xì)胞增殖，參與Th2細(xì)胞分化，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞發(fā)育，促進(jìn)IgE生成。有研究顯示MPP患者血清中IL-4水平明顯升高，間接證實(shí)在兒童肺炎支原體肺炎急性期，存在Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的情況［7］。由于Th1型細(xì)胞因子主要為炎癥性細(xì)胞因子，而Th2型細(xì)胞因子則具有抗炎效應(yīng)，Th0細(xì)胞極化Th2細(xì)胞并產(chǎn)生Th2類細(xì)胞因子具有保護(hù)作用。因此這種改變?cè)谝欢ǔ潭壬峡赡転闄C(jī)體的自身防御反應(yīng)，以減輕MP所致的炎癥反應(yīng)，有利于機(jī)體清除抗原。但也有研究表明［8］MPP急性期患者血液IFN-γ表達(dá)水平明顯升高，而IL-4水平無(wú)明顯變化，表明MPP急性期免疫反應(yīng)以Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主。研究結(jié)果不同，可能是試驗(yàn)方法導(dǎo)致不同，或者是樣本數(shù)量偏小導(dǎo)致不同，這都有待進(jìn)一步深入研究。

該研究顯示急性期重癥MPP患者BALF和血清中IL-4及IFN-γ水平較支氣管異物組明顯增高，提示有較強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答；而IL-4/IFN-γ比值＞1，提示存在Th1/Th2失衡，以Th2反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)。韓曉華等［9］認(rèn)為在重癥MPP患者誘導(dǎo)痰中IL-4含量及IL-4/IFN-γ比值高于輕癥MPP組，病情越重，增高越明顯，提示MPP患者存在Thl/Th2失衡，Th2反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)。Woolard等［10］研究發(fā)現(xiàn)敲除IFN-γ的小鼠感染MP后發(fā)生嚴(yán)重肺損傷，進(jìn)一步表明機(jī)體從Th1/Th2免疫應(yīng)答平衡發(fā)展為Th2應(yīng)答優(yōu)勢(shì)而導(dǎo)致肺損害加重。該研究顯示非MPP組患者BALF和血清中IL-4和IFN-γ濃度也明顯高于支氣管異物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與感染病例相對(duì)于非感染病例整體上有較強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答有關(guān)。在恢復(fù)期，重癥MPP組及非MPP組患者血清中IL-4和IFN-γ濃度較急性期均有下降，但重癥MPP組患者血清中IL-4水平仍明顯高于非MMP組及支氣管異物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示肺炎支原體感染機(jī)體后導(dǎo)致的以Th2反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)的免疫失衡，需要更長(zhǎng)時(shí)間才得以恢復(fù)。

以上結(jié)論提示，在治療MPP時(shí)，適當(dāng)使用免疫調(diào)節(jié)劑，如IFN-γ、抗IL-4單抗等進(jìn)行干預(yù)，可能為促進(jìn)疾病恢復(fù)起到積極作用。

該研究發(fā)現(xiàn)重癥MPP患者BALF與血清中IL-4及IFN-γ水平呈正相關(guān)，且BALF中濃度高于血清，提示BALF中細(xì)胞因子的檢測(cè)更為敏感，更能反映局部免疫失衡的變化。既往的研究大多局限于對(duì)MPP患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)［11］，對(duì)BALF中細(xì)胞因子等的研究國(guó)內(nèi)報(bào)道很少。BALF由于直接來(lái)自下呼吸道，能直觀地反映肺局部的生理及病理生理信息，因此，對(duì)重癥MPP患者 BALF成分的檢測(cè)，有助于理解疾病的發(fā)生機(jī)制、預(yù)測(cè)疾病的發(fā)展，并對(duì)今后的治療提供新的手段和理論依據(jù)。

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R725.6

B

10.14172/j.issn1671-4008.2017.09.012

528000廣東佛山，佛山市婦幼保健院兒科（黃小霏，林業(yè)輝，周杏，李國(guó)偉，高豆豆），檢驗(yàn)科（江潤(rùn)昌）

［2017－01－22 收稿，2017－02－20 修回］ ［本文編輯：吳 蓉］