趙曉冰 潘磊 柳威 林懋怡 李宏慶 劉忠

（1. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2. 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240）

華細(xì)辛實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇

趙曉冰1，2潘磊2柳威2林懋怡2李宏慶1劉忠2

（1. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241；2. 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240）

選擇合適的內(nèi)參基因是準(zhǔn)確分析目標(biāo)基因表達(dá)水平變化的重要條件。選取SAND-1、ACT、18SrRNA、CYP2、GAPDH、TUB 6個(gè)常用的內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT等軟件分析和評(píng)價(jià)6個(gè)候選內(nèi)參基因在華細(xì)辛營養(yǎng)生長期、花期和花后期等不同生長階段的根、根莖、葉片、葉柄等不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選適宜華細(xì)辛不同生長階段不同組織基因表達(dá)水平分析的內(nèi)參基因。結(jié)果表明，18S rRNA在華細(xì)辛所有樣品中表達(dá)最為穩(wěn)定，是進(jìn)行華細(xì)辛基因表達(dá)水平分析的適宜的內(nèi)參基因。研究結(jié)果可為華細(xì)辛重要活性成分生物合成途徑相關(guān)基因的功能分析，以及基因差異表達(dá)的研究提供有效的校正工具，確?；虮磉_(dá)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

華細(xì)辛；內(nèi)參基因；geNorm；NormFinder；BestKeeper；Delta CT

細(xì)辛（Asari Radix et Rhizoma）是常用解表類中藥，主治風(fēng)寒表證、痰飲咳嗽，兼具鎮(zhèn)痛消炎作用，被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床，來源于馬兜鈴科細(xì)辛屬（Asarum）植物北細(xì)辛A. heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum（Maxim.）Kitag.、 漢 城 細(xì) 辛 A.sieboldii Miq. var. seoulense Nakai.、華細(xì)辛A. sieboldii Miq.干燥的根和根莖［1］。除藥用外，細(xì)辛在其它方面也具有很大的應(yīng)用價(jià)值。近幾年的研究表明，細(xì)辛全草含有多糖、葉酸、多種微量元素和氨基酸，畜禽長期合理使用可提高機(jī)體代謝能力、促進(jìn)對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，是一種潛在的新型優(yōu)良飼料添加劑［2］；在植物源農(nóng)藥、香精香料、日用化工等方面也頗具開發(fā)價(jià)值［3］。然而，有關(guān)細(xì)辛生物學(xué)特性和資源學(xué)方面的基礎(chǔ)研究卻十分薄弱，對(duì)細(xì)辛次生代謝產(chǎn)物積累的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及其內(nèi)在機(jī)制缺乏了解，人工栽培仍停留在粗放的狀態(tài)，因而難以準(zhǔn)確掌控細(xì)辛藥材的質(zhì)量。植物代謝組的特征，包括化學(xué)成分的組成和比例，是植物個(gè)體和種群在各種內(nèi)外因素的綜合作用下，生物機(jī)體復(fù)雜的生理生化活動(dòng)過程的最終體現(xiàn)，具體而言，是次生代謝物在其生物合成過程中受到各項(xiàng)影響因素的作用，相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果。因此，闡明次生代謝途徑，分離相關(guān)基因，比較基因在不同發(fā)育階段、不同組織器官中的表達(dá)差異，對(duì)于理解藥用植物次生代謝物含量變化的規(guī)律是必不可少的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是基因表達(dá)分析的重要工具，該技術(shù)具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，有效解決了常規(guī)PCR假陽性率高等缺點(diǎn)［4-6］。但在數(shù)據(jù)處理過程中，qRT-PCR的結(jié)果容易受到不同因素的影響而缺少一致性，因此，選用穩(wěn)定表達(dá)的基因作為內(nèi)參基因，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的準(zhǔn)確性非常關(guān)鍵。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在所有組織和細(xì)胞類型中均能表達(dá)，且不受任何因素的影響，然而，任何基因的恒定表達(dá)都只是在一定類型的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)因素下有范圍的恒定，并非絕對(duì)地穩(wěn)定表達(dá)［7，8］。事實(shí)上，同一基因在不同種屬、同一植物不同組織和不同時(shí)期的表達(dá)豐度都存在變化［9］。因此，在對(duì)目的基因進(jìn)行差異表達(dá)分析時(shí)，首先需要篩選到可以作為內(nèi)參基因使用的合適的基因。

根據(jù)已有的研究報(bào)道，植物基因表達(dá)分析中作為內(nèi)參基因的有很多，本研究選取常用的SAND-1、ACT、18S rRNA、CYP-2、GAPDH、TUB作為候選內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物，以華細(xì)辛在營養(yǎng)生長期、花期和花后期等不同生長時(shí)期的根、根莖、葉片、葉柄、花等不同組織部位的材料為樣品進(jìn)行相對(duì)定量PCR檢測(cè)，并用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，力圖篩選出華細(xì)辛中表達(dá)穩(wěn)定性較強(qiáng)的內(nèi)參基因，為研究華細(xì)辛基因差異表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究材料 實(shí)驗(yàn)所用研究材料為華細(xì)辛。分別取華細(xì)辛營養(yǎng)生長期的根（Root A）、根莖（Rhizoma A）、葉（Leaf A）、葉柄（Petiole A），花期的根（Root B）、根莖（Rhizoma B）、葉（Leaf B）、葉柄（Petiole B），花（Flower），花后期的根（Root C）、根莖（Rhizoma C）、葉（Leaf C）、葉柄（Petiole C），將它們清洗干凈并在液氮中研磨成粉，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit（Tiangen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 FastQuant RT Kit（With gDNase）（Tiangen公司）、熒光定量PCR 試 劑 盒 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（Tiangen公司）。其余試劑若未說明均為國產(chǎn)分析純。引物由上海英駿公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)Tiangen RNA-prep Pure Plant Kit說明書進(jìn)行總RNA的提取，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確保各樣品28S與18S電泳條帶亮度之比約為2∶1，且無基因組DNA殘留。根據(jù)Tiangen FastQuantRTKit（With gDNase）說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成的cDNA作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板。

1.2.2 候選內(nèi)參基因的選擇及引物設(shè)計(jì) 本研究共選取6個(gè)候選內(nèi)參基因，分別為SAND-1、ACT、18SrRNA、CYP-2、GAPDH和TUB，引物序列見表1。在qRT-PCR中，可通過熔解曲線判斷引物的特異性。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 本實(shí)驗(yàn)在Applied Biosystems StepOne PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系（20 μL）如下：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 2 μL，cDNA 模板（100 ng）0.1 μL，上游引物（10 μmol/L）0.6 μL，下游引物（10 μmol/L）0.6 μL，RNase-free ddH2O 6.7 μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，在延伸階段檢測(cè)熒光強(qiáng)度，收集信號(hào)，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 s。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并以ddH2O代替模板設(shè)置陰性對(duì)照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 在對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)之前，須構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，即將cDNA模板進(jìn)行5倍的梯度稀釋，根據(jù)1.2.3的程序進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，將所得結(jié)果（Ct值）運(yùn)用Excel計(jì)算內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)（R2），然后根據(jù)公式lg（1+E）=R2計(jì)算出擴(kuò)增效率（E）［10］。目前認(rèn)為只有擴(kuò)增效率在一定的范圍（90%-105%）時(shí)，才能進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。

根據(jù)公式 Q=EΔCT，其中，ΔCT= Ctmin-Ct樣品，E為基因擴(kuò)增效率（當(dāng)擴(kuò)增效率接近100%時(shí)，E默認(rèn)為2），利用Excel計(jì)算出每個(gè)擴(kuò)增樣品的表達(dá)量 Q［11］。在上述基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用 geNorm［12］、NormFinder［7］、BestKeeper［13］、Delta CT 軟件［14］對(duì)各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，總RNA中28S和18S兩條主帶清晰，且28S條帶大約為18S條帶亮度的兩倍，說明總RNA有良好的完整性。紫外分光光度法測(cè)得的A260/A280為1.8-2.0，表明總RNA純度高，濃度適宜（表2）。所提總RNA符合下一步實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 引物擴(kuò)增效率及Ct分析

圖1華細(xì)辛不同生長時(shí)期不同組織總RNA電泳圖

表2 華細(xì)辛不同時(shí)期不同組織總RNA提取質(zhì)量比較

通過梯度稀釋cDNA樣本作為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增后，繪制每個(gè)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到引物相關(guān)參數(shù)（表3）。從表中可以看到6個(gè)內(nèi)參基因的斜率均在-3.6--3.2內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2均高于定量PCR反應(yīng)要求的0.98，說明其線性關(guān)系很好，擴(kuò)增效率為92%-102%，且熔解曲線均只有單一峰，不存在非特異性擴(kuò)增。上述結(jié)果表明各內(nèi)參基因均符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)擴(kuò)增效率的要求，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 6個(gè)內(nèi)參基因特異性引物參數(shù)

通過對(duì)目的基因在mRNA 水平上的表達(dá)量進(jìn)行定量測(cè)定，計(jì)算每個(gè)基因Ct值。Ct值大小反映了對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)豐度高低，Ct值越小，表達(dá)豐度越高。圖2可以看出，這6個(gè)基因的Ct值為21-35，其中18S rRNA 豐度最高（Ct＜25）。

圖2 六個(gè)內(nèi)參基因的Ct值分析

2.3 不同內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

2.3.1 geNorm分析 利用geNorm程序?qū)Ω骱蜻x內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。通過計(jì)算基因的表達(dá)穩(wěn)定值（M）并對(duì)其進(jìn)行排序，M 越小，基因穩(wěn)定性越高。分析結(jié)果（圖3）顯示，不同樣品間各候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值M大小順序?yàn)?8S rRNA＜GAPDH＜ACT＜CYP-2＜SAND-1＜TUB，18S rRNA的M最小，表達(dá)最穩(wěn)定，TUB穩(wěn)定性最差。

圖3 候選基因在華細(xì)辛不同樣品中表達(dá)穩(wěn)定性的geNorm分析

2.3.2 BestKeeper分析 BestKeeper程序主要通過比較Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)來選擇表達(dá)最穩(wěn)定的基因，標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小，穩(wěn)定性越好；反之，穩(wěn)定性越差。分析結(jié)果（表4）顯示，在所有樣品中，ACT、GAPDH、SAND-1、18SrRNA、CYP2、TUB的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.78、1.22、2.09、1.11、1.63、3.54，18S rRNA最小，為1.11，表達(dá)最穩(wěn)定，TUB表達(dá)穩(wěn)定性最差。變異系數(shù)的大小順序?yàn)?18S rRNA＜GAPDH＜CYP-2 ＜ACT＜SAND-1＜TUB，18S rRNA表達(dá)最穩(wěn)定，TUB表達(dá)穩(wěn)定性最差，與標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果一致。綜上，18S rRNA在各個(gè)樣品中表達(dá)最穩(wěn)定。

表4 Bestkeeper分析候選內(nèi)參基因在不同華細(xì)辛樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性

2.3.3 Delta CT法 ΔCt法是通過比較候選內(nèi)參基因之間的ΔCt值來篩選表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因的分析方法，即通過計(jì)算各基因的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD值），對(duì)基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序，平均標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，基因穩(wěn)定性越高。

結(jié)果（表 5）表明，在 Root A、Root C、Rhizoma A、Rhizoma C、Leaf A、Petiole A、Petiole C、Flower共8個(gè)樣品中，18S rRNA均具有最小的SD值（在表格中已用下劃線標(biāo)出），表明在此樣品中穩(wěn)定性最強(qiáng)；在樣品Rhizoma B與Petiole B中，CYP-2表達(dá)穩(wěn)定性最強(qiáng)；而在樣品Leaf B與Leaf C中，GAPDH具有最強(qiáng)的表達(dá)穩(wěn)定性；Root B中，SD值為GAPDH＞TUB＞CYP-2=18S rRNA＞ACT＞SAND-1，即SAND-1表達(dá)穩(wěn)定性最強(qiáng)。而圖4也直觀地表明候選內(nèi)參基因18S rRNA在華細(xì)辛大多數(shù)樣品中具有較小的SD值，且各樣品間SD值相對(duì)其它候選內(nèi)參基因差距較小，是相對(duì)表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。雖說有5個(gè)樣品中表達(dá)最穩(wěn)定的并不是18S rRNA，但是篩選內(nèi)參基因主要篩選在大多數(shù)樣品中都具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的內(nèi)參基因，綜合來看，在華細(xì)辛中適合作為基因差異表達(dá)的內(nèi)參基因?yàn)?8S rRNA。

2.3.4 NormFinder分析 利用NormFinder程序分析6個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，穩(wěn)定值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定。分析結(jié)果（圖5）顯示，各樣品中候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性依次為18S rRNA＞GAPDH＞ ACT＞ SAND-1＞ CYP-2＞ TUB，18S rRNA表達(dá)最穩(wěn)定。這與geNorm、BestKeeper、Delta CT法分析的結(jié)果一致。

表5 ΔCt法分析候選基因在華細(xì)辛不同樣品中表達(dá)穩(wěn)定性

圖4 ΔCt法分析候選基因在華細(xì)辛不同樣品中表達(dá)穩(wěn)定性

3 討論

熒光定量PCR是定量檢測(cè)基因表達(dá)水平最重要的方法，為了獲得準(zhǔn)確、可靠的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)合理，引物設(shè)計(jì)合適，RNA提取質(zhì)量高、聚合酶擴(kuò)增效率高、cDNA的合成以及PCR準(zhǔn)備過程中的準(zhǔn)確操作和防止污染等實(shí)驗(yàn)過程的每一步操作都很重要［12］。此外，選擇合適的內(nèi)參基因也是準(zhǔn)確分析目標(biāo)基因表達(dá)變化的重要條件。

圖5 NormFinder分析候選內(nèi)參基因在華細(xì)辛不同樣品中的表達(dá)

在qRT-PCR分析中，內(nèi)參基因的使用被認(rèn)為是最適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)化方法，使用不理想的內(nèi)參基因?qū)?duì)數(shù)據(jù)的分析造成偏差［15，16］。在植物中，常用的內(nèi)參基因有肌動(dòng)蛋白基因（ACT）、18S核糖體RNA（18S rRNA）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管和β微管蛋白基因（TUA、TUB）以及親環(huán)蛋白基因（CYP）等［17］。但是內(nèi)參基因常常表現(xiàn)為在某些實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)較穩(wěn)定，而在另一些條件下欠穩(wěn)定。因此，研究目標(biāo)基因的表達(dá)情況時(shí)，研究者需要結(jié)合各自的實(shí)驗(yàn)條件和樣品類型，根據(jù)物種、基因家族等的不同，選擇合適而穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，才能有助于得到可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。到目前為止，很多植物在不同條件下的合適的內(nèi)參基因已經(jīng)被篩選出來，如孫美蓮等［18］指出，比較茶樹不同組織中的基因表達(dá)差異時(shí)，β-ACT作為校正內(nèi)參基因最合適。Iskandar等［19］研究表明，在β-ACT、β-TUB、GAPDH與25S rRNA四個(gè)候選基因中，25S rRNA在甘蔗各組織中表達(dá)始終一致，是理想的內(nèi)參基因；而GAPDH在成熟莖節(jié)間表達(dá)也較穩(wěn)定，亦可作為研究甘蔗表達(dá)量的合適內(nèi)參基因。Mascia等［20］分析了番茄的8個(gè)內(nèi)參基因在5種不同植物病毒侵染條件下的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明，UBI和GAPDH在所有樣品中表達(dá)都相對(duì)穩(wěn)定，而ACT在侵染樣品中表達(dá)穩(wěn)定性最好。因此，選擇合適的內(nèi)參基因是實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的前提條件。

4 結(jié)論

本研究選取SAND-1、ACT、18S rRNA、CYP2、GAPDH、TUB為候選內(nèi)參基因，分析其在華細(xì)辛不同樣品中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在geNorm、BestKeeper、Delta CT、NormFinder四種不同的軟件分析中，表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因均趨向18S rRNA，而4個(gè)軟件是基于不完全相同的算法來對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行衡量的?？梢姡谘芯咳A細(xì)辛不同時(shí)期不同組織中相關(guān)基因的表達(dá)時(shí)，18S rRNA作為內(nèi)參基因是較為合適可靠的。

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Screening of Reference Genes for Quantitative Real-time PCR Analysis in Asarum sieboldii

ZHAO Xiao-bing1，2PAN Lei2LIU Wei2LIN Mao-yi2LI Hong-qing1LIU Zhong2
（1. School of Life Science，East China Normal University，Shanghai 200241 ；2. School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240）

Selecting appropriate reference gene is key step for the accurate analysis of the expression variations of target genes. Using several common-used reference genes of SAND-1，ACT，18S rRNA，CYP2，GAPDH and TUB as candidate genes and quantitative realtime PCR analysis of gene expression，the expression stabilities of these 6 candidate genes in various samples from roots，rhizomes，leaves，petioles and flowers in different growth stages of nutrition growth，flowering and post-flowering were assessed，with a set of approaches such as geNorm，NormFinder，BestKeeper and Delta CT，representatively. It is for screening the appropriate reference genes in analysing gene expressions of Asarum sieboldii Miq. in varied tissues at different growth stage. The results demonstrated that 18S rRNA was the optimal object to act as a proper reference gene in this species because it displayed the most stable expression in almost all samples. This study will provide a feasible and valid calibrate not only for gene function characterization concerning chemical compound biosynthesis but also for gene differential expression analysis in A. sieboldii，ensuring the accuracy and reliability of results.

Asarum sieboldii；reference gene；GeNorm；NormFinder；BestKeeper；Delta CT

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0352

2017-05-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373962，31570325）

趙曉冰，女，碩士研究生，研究方向：生物學(xué)，E-mail：1194089861@qq.com；潘磊同為本文第一作者

劉忠，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生藥學(xué)；E-mail：liuzhong@sjtu.edu.cn李宏慶，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物學(xué)；E-mail：hqli@bio.ecnu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李楠）