吳劍平，張 婧，李丹妮，嚴(yán) 鳳，潘 娟

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法正負(fù)模式切換同時(shí)檢測(cè)飼料中10種硝基呋喃類化合物

吳劍平，張 婧，李丹妮*，嚴(yán) 鳳，潘 娟

(上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海 201103)

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法檢測(cè)飼料中的10種硝基呋喃類化合物的方法。飼料樣品經(jīng)0.1 mol/mL HCl∶乙腈=1∶1提取，高速離心后稀釋，經(jīng)酸性氧化鋁粉末凈化后進(jìn)樣分析。采用Thermo Hypersil Gold C18色譜柱(150 mm×2.1 mm， 1.9 μm)作為固定相，0.1%甲酸和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。質(zhì)譜采用正負(fù)離子切換同時(shí)掃描，SRM模式進(jìn)行分析。10種硝基呋喃類化合物在最優(yōu)化條件下分離良好，在定量范圍內(nèi)均線性良好(線性相關(guān)系數(shù)r≥0.99)，回收率也可達(dá)到63.2% ～ 89.7% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于9.3%。本方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于飼料中違法添加硝基呋喃類化合物的檢測(cè)。

10種硝基呋喃藥物；正負(fù)模式切換;串聯(lián)質(zhì)譜法

硝基呋喃類藥物是一類人工合成的具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，一度被廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)，其對(duì)于革蘭氏菌、真菌和一些原蟲引起的疾病具有顯著療效[1]。但是有研究表明，硝基呋喃類化合物及其代謝產(chǎn)物具有致畸等副作用，且能誘發(fā)癌癥[2-3]。1993年，美國(guó)禁止呋喃唑酮作為獸藥使用在食品動(dòng)物[4]。1995年，歐盟全面禁止使用呋喃類抗菌藥，規(guī)定呋喃類殘留物在動(dòng)物源性食品中不得檢出[5]。2004年，美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)公布了禁止在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中使用的11種藥物名單，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮[6]。中國(guó)農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告已明令禁止在食用動(dòng)物上使用呋喃唑酮、硝呋烯腙等硝基呋喃類藥物。常見(jiàn)的硝基呋喃類藥物包括呋喃唑酮(Furazolidone，F(xiàn)ZD)、呋喃西林(Nitrofurazone，NFZ)、呋喃妥因(Nitrofurantion，NFT)、呋喃它酮(Furaltadone，F(xiàn)TD)、硝呋齊特(Nifuroxazide，NFX)、硝呋吡醇(Nifurprinol，NFP)、硝呋索爾(Nifursol，NFS)、硝呋烯腙(Nitrovin，NTV)和二硝托胺(Dinitolmide，DTM)等。

串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀具有檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[6]，其優(yōu)秀的定性與定量分析能力目前已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、中藥安全控制、代謝組學(xué)、和食品安全領(lǐng)域中小分子和大分子的研究[7-10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，有使用高效液相色譜法檢測(cè)飼料中多種硝基呋喃類藥物，其定量限達(dá)到0.5 mg/kg；動(dòng)物性食品中則主要使用串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)4種硝基呋喃代謝物的殘留量，而利用串聯(lián)質(zhì)譜的正負(fù)切換功能同時(shí)定性定量測(cè)定飼料中10種違法添加的硝基呋喃類抗菌藥物的方法未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的高靈敏度和定性能力，實(shí)現(xiàn)了飼料中10種非法添加的硝基呋喃類化學(xué)藥物快速定性與定量測(cè)定。本方法具有前處理過(guò)程簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以用于飼料中非法添加的硝基呋喃類藥物的篩查與定量。

1 材料與方法

1.1 儀器 Ultimate 3000雙三元超高效液相色譜、Excalibur控制軟件、串聯(lián)四極桿質(zhì)譜帶HESI電離噴霧源(TSQ Quantiva)、Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER)；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(B-490，BUCHI)；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，上海安譜公司)。

1.2 材料、藥品與試劑 C18分析柱(Hypersil gold C18 150×3.0mm 3.0 μm，Thermo Fisher，美國(guó))；高速冷凍離心機(jī)(Allegra X-22R，BECKMAN COULTER，美國(guó))；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，Anpel)。呋喃唑酮(Furazolidone，F(xiàn)ZD)、呋喃西林(Nitrofurazone，NFZ)、呋喃妥因(Nitrofurantion，NFT)、呋喃它酮(Furaltadone，F(xiàn)TD)、硝呋齊特(Nifuroxazide，NFXD)、硝呋吡醇(Nifurprinol，NFP)、硝呋索爾(Nifursol，NFS)、硝呋烯腙(Nitrovin，NTV)、硝呋醛肟(Nifuroxime，NFXM)和二硝托胺(Dinitolamide，DTM)(≥99.0%，Dr Ehrenstofer GmbH，德國(guó))；乙腈、甲酸(色譜純，Merk，德國(guó))；去離子水(自制，電阻率≥18 MΩ·cm)；高純氮、高純氬(純度均為99.999%，上海佳杰特種氣體公司)。

1.3 反相色譜條件 色譜柱：Hypersil gold C18 (150×2.1 mm 1.9 μm)，柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL/min,進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相：A為0.1%甲酸，B為乙腈，采用梯度洗脫程序如表1，所得典型特征離子質(zhì)量色譜圖如圖1。

表1 反相色譜法梯度洗脫程序Tab 1 Procedure of reverse-phase chromatography

圖1 定量限濃度典型SRM圖Fig 1 Typical SRM chromatogram of LOQ

1.4 質(zhì)譜條件 使用Thermo Fisher公司的TSQ Quantiva串聯(lián)四極桿質(zhì)譜帶HESI電離噴霧源質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)1 μg/mL的10種硝基呋喃類藥物單標(biāo)溶液進(jìn)行優(yōu)化， 兼顧各目標(biāo)化合物優(yōu)化后的質(zhì)譜條件為：選擇正負(fù)離子切換模式，正電壓3900 V，負(fù)電壓3200V，鞘氣(Sheath gas)壓力344 kPa，輔助氣(Aux gas)流速5 L/min，吹掃氣(Sweep gas)流速0.3 L/min，離子傳輸管(Ion transfer tube)溫度350 ℃，霧化器(Vapourizer)溫度400 ℃，檢測(cè)模式為選擇反應(yīng)監(jiān)控(Selected reaction monitor，SRM)，碰撞氣壓力0.2 Pa，Q1段分辨率設(shè)為半峰寬0.7，Q2段分辨率設(shè)為半峰寬0.7，10種硝基呋喃類藥物的定性與定量離子對(duì)以及對(duì)應(yīng)的撞擊能量見(jiàn)表2。

表2 硝基呋喃類藥物定性與定量離子對(duì)Tab 2 Qualitative and quantitative ion pair of nitrofurans

*為定量離子

1.5 前處理?xiàng)l件 取樣品2.00 g，置50 mL離心管中，加入20 mL的0.1 mol/mL HCl∶乙腈=1∶1溶液后30 ℃水浴超聲提取10 min，然后經(jīng)9000 RPM高速離心后取上清液0.20 mL，用0.1 mol/L甲酸水溶液稀釋至1.00 mL，加入酸性氧化鋁粉末0.20 g渦旋振蕩1 min，經(jīng)14000 RPM離心后取上清液過(guò)0.22 μm尼龍濾膜后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 線性定量范圍的確定 將10種硝基呋喃類化合物對(duì)照品分別用甲醇溶解，制成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，取適量該貯備液用0.1 mol/L甲酸溶液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作溶液，將該系列溶液依次按1.3、1.4和1.5的檢測(cè)方法進(jìn)樣檢測(cè)，將所得定量通道色譜圖積分后面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值以Y表示，進(jìn)樣濃度以X表示，所得回歸曲線結(jié)果如下表3所示，其線性相關(guān)系數(shù)r都大于等于0.995。實(shí)驗(yàn)表明，該方法同時(shí)檢測(cè)10種硝基呋喃類化合物在各自濃度范圍內(nèi)線性良好。

表3 10種硝基呋喃類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 3 Standard curve of 10 nitrofurans

2.2 檢測(cè)限與定量限的確定 選擇20個(gè)空白樣品，按優(yōu)化條件進(jìn)行處理后上機(jī)測(cè)定，取與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜中相同保留時(shí)間的噪音信號(hào)平均值，以信噪比S/N≥3為檢出限(LOD)，S/N≥10為定量下限(LOQ)，確定該方法對(duì)的檢出限與定量限，見(jiàn)表4。經(jīng)過(guò)實(shí)際進(jìn)樣檢測(cè)后，檢測(cè)定量限附近峰型良好，實(shí)際樣品定量限處SRM圖譜見(jiàn)圖1。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察 為驗(yàn)證方法基質(zhì)效應(yīng)，選取預(yù)混料、濃縮料和配合料各6批，按1.5前處理方法進(jìn)行操作，將其空白溶液中分別加入1倍定量限的10種硝基呋喃類化合物，其回收率結(jié)果在80%～100%之間，RSDlt;10%，證明該前處理方法的基質(zhì)效應(yīng)影響不大。

2.4 方法準(zhǔn)確度與精密度實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證方法精密度與準(zhǔn)確度，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法使用6批不同飼料，

表4 10種硝基呋喃類化合物檢測(cè)限和定量限Tab 4 LOD and LOQ of 10 nirtofurans

每批稱取等量6份，5份一組分三組，分別加入1倍定量限、2倍定量限、4倍定量限的10種硝基呋喃類化合物，所得結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)飼料中10種硝基呋喃類化合物時(shí)回收率結(jié)果在63.2%～89.7%之間，RSDlt;10%，證明該方法具有較高的準(zhǔn)確度與精密度。

表5 飼料中檢測(cè)10種硝基呋喃類化合物的準(zhǔn)確度和精密度Tab 5 Accuracy and precision of 10 nirtofurans in feed

2.5 方法選擇性的驗(yàn)證 選擇20個(gè)空白樣品，按優(yōu)化條件進(jìn)行處理后上機(jī)測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)有假陽(yáng)性結(jié)果，表明該方法的選擇性良好。

3 討論與小結(jié)

3.1 固定相的選擇 方法涉及的目標(biāo)化合物較多，而且還涉及到不同電離極性的切換，因此使目標(biāo)化合物獲得充分的保留與分離就十分有必要。通過(guò)選擇具有更好保留性和選擇性的色譜柱優(yōu)化色譜條件，既可以避免強(qiáng)極性的保留雜質(zhì)與目標(biāo)化合物分子爭(zhēng)奪電荷抑制響應(yīng)信號(hào)，也可以將分子量接近的化合物盡可能分開避免互相干擾。本實(shí)驗(yàn)嘗試了親水合相色譜(HILIC)和傳統(tǒng)的反相色譜(RP)兩種思路的方法，目標(biāo)化合物大多呈中弱極性，在HILIC色譜上的保留普遍較弱，且峰型展寬嚴(yán)重，在RP色譜柱上有較好的保留，因此選擇傳統(tǒng)的反相色譜作為主要分離手段。嘗試了同為Thermo公司裝填的三款反相色譜柱：Accucore RP-MS (150 mm×2.1 mm,2.6 μm)，Syncronis C18 (150 mm×2.1 mm, 3.0 μm)和Hypersil Gold C18 (150 mm×2.1 mm,1.9 μm)。結(jié)果表明，使用Accucore RP-MS色譜柱的目標(biāo)物峰普遍具有保留時(shí)間不足，峰型對(duì)稱性不高的特點(diǎn)，推測(cè)其原因?yàn)樗褂玫木酆衔镄再|(zhì)填料含碳量接近10%，雖然通過(guò)殼層技術(shù)增加了填料的比表面積，但并不能提供很好的保留；Syncronis C18色譜柱的硅膠鍵合填料含碳量接近17%，因此為目標(biāo)化合物提供了足夠的保留，但是其中有多個(gè)目標(biāo)化合物的色譜峰出現(xiàn)了較大的拖尾，其中硝呋索爾和硝呋吡醇尤為嚴(yán)重，推測(cè)是因?yàn)樯V柱的硅膠鍵合相具有較多的硅羥基，容易和化合物的相應(yīng)位點(diǎn)形成氫鍵效應(yīng)而造成色譜峰的展寬和拖尾；Hypersil Gold C18色譜柱所使用的硅膠載體經(jīng)過(guò)了純化工藝和末端封尾，大大降低了硅羥基的數(shù)目，雖然擔(dān)體含碳量不及Syncronis C18高，但是1.9 μm的填料粒徑為其提供了比3.0 μm多2倍以上的比表面積，因此對(duì)大多數(shù)目標(biāo)化合物既能獲得較滿意的保留時(shí)間，也能確保色譜峰的展寬和拖尾在令人滿意的程度。

3.2 正負(fù)電離模式切換研究 隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)檢測(cè)過(guò)程的時(shí)效性也提出了更高的要求，色譜質(zhì)譜聯(lián)用法為藥物殘留檢測(cè)提供了一條同時(shí)兼顧準(zhǔn)確定性與精確定量的途徑。目前串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀的掃描精度和掃描速度相較過(guò)去有了長(zhǎng)足進(jìn)步，同時(shí)前端源區(qū)通過(guò)一些先進(jìn)技術(shù)也大大提高了檢測(cè)靈敏度，這就為單針進(jìn)樣檢測(cè)更多的化合物提供了硬件基礎(chǔ)，由于質(zhì)譜內(nèi)電場(chǎng)極性的切換可以在萬(wàn)分之一秒內(nèi)完成，因此這就為正負(fù)極性快速切換檢測(cè)提供了可能性。本方法內(nèi)涉及的多個(gè)藥物在正負(fù)電離模式下都可以獲得帶電分子離子如硝呋醛肟和二硝托胺，其負(fù)電離模式下所獲得的響應(yīng)信號(hào)更高，推測(cè)可能是其分子結(jié)構(gòu)更容易失去質(zhì)子而帶負(fù)電核，而呋喃妥因則是在正電離模式下幾乎沒(méi)有響應(yīng)，可能其分子結(jié)構(gòu)很難通過(guò)獲得質(zhì)子而帶正電荷。利用Quantivia質(zhì)譜儀可以高速切換電場(chǎng)和掃描頻率的特點(diǎn)，將10種硝基呋喃類化合物通過(guò)正負(fù)電離模式的快速切換可以實(shí)現(xiàn)在單針內(nèi)的快速檢測(cè)。結(jié)果表明，這種正負(fù)電離模式的切換在本方法中是可行的，可以大大提高檢測(cè)的時(shí)效性。

3.3 小結(jié) 利用串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜具有可以快速切換電場(chǎng)極性和高速掃描的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了單針同時(shí)檢測(cè)10種硝基呋喃類化合物的方法，前處理采用簡(jiǎn)單的酸性乙腈提取，酸性氧化鋁粉末凈化后稀釋進(jìn)樣，反相色譜法進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10種硝基呋喃化合物在各自線性定量范圍內(nèi)回收率也可達(dá)到63.2%～89.7% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于9.3%，方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于飼料中違法添加硝基呋喃類化合物的檢測(cè)。

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(編輯：陳希)

Determinationof10NitrofuransinFeedbyHighPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometrywithPositiveandNegativeSwitching

WU Jian-ping, ZHANG Jing, LI Dan-ni*, YAN Feng, PAN Juan

(ShanghaiMunicipalSupervisoryInstituteVeterinaryDrugsandFeedstaff,Shanghai201103,China)

LIDan-ni,E-mail:yure@sina.com

To determine the illegal added 10 nitrofuranes in feed, a high performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry method was established. Feed was extracted by 0.1 mol/mL HCl∶acetonitrile=1∶1. The extraction was high speed centrifuged and purified by acid then diluted to inject. Thermo Hypersil Gold C18 column (150 mm×2.1 mm, 1.9 μm) was chosen to be the solid phase and 0.1% formic acid combined with acetonitrile were chosen to be the liquid phase to achieve the grad elution. The mass spectrometer was operated using positive and negative switching under SRM mode. Under the optimal conditions, 10 nitrofuranes were separated well. Good linearity was obtained in their respective quantitative range (correlation coefficientsr≥0.99). The average recoveries were in the range of 63.2%～89.7% and the relative standard deviations (RSD) were lower than 9.3%. The method was proved to be convenient, economical, sensitive and accurate. The research was proved to be effective for the detemination of the illegal added 10 nitrofuranes in feed.

10 nitrofurans; positive and negative switching; tandem mass spectrometry

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.08

2017-02-07

A

1002-1280 (2017) 11-0051-08

S859.84

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[滬農(nóng)科攻字(2016)第4-5號(hào)]；上海市市級(jí)農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長(zhǎng)計(jì)劃[滬農(nóng)青字(2016) 第2-5號(hào)]

吳劍平，碩士，畜牧師，從事獸藥殘留分析與研究。

李丹妮。E-mail: yure@sina.com