毛婭卿，王 嘉，吳 濤，王 哲，孔冬妮，李 嶺，李慧姣

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

雞痘鵪鶉化弱毒株種子批的建立及鑒定

毛婭卿，王 嘉，吳 濤，王 哲，孔冬妮，李 嶺，李慧姣*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

為保證制苗所用毒種質(zhì)量和穩(wěn)定性，在對雞痘鵪鶉化弱毒株病毒含量、病毒純凈性、特異性、免疫原性及安全性等研究的基礎(chǔ)上，建立了雞痘鵪鶉化弱毒株種子批。將雞痘鵪鶉化弱毒F278 E1(1966年6月3日凍干)通過鵪鶉連續(xù)傳至4代(F282 E1)后，再經(jīng)雞胚傳至14代(F282 E14)。傳代毒種的鑒定結(jié)果表明：抽檢的各代次的毒種均無細菌、支原體、外源病毒污染，且病毒含量檢測穩(wěn)定，均≥106.2EID50/0.2mL。將抽檢的各代次的毒種制成活疫苗，免疫適齡雞只后均能產(chǎn)生完全保護。因此，確定雞痘鵪鶉化弱毒株基礎(chǔ)種子代數(shù)為F282 E2-E6代，生產(chǎn)用毒種繼代應不超過3代。種子批的建立，為雞痘鵪鶉化弱毒株疫苗的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

雞痘鵪鶉化弱毒株；種子批；建立及鑒定

雞痘(Avian Pox)是雞的一種急性、接觸性傳染病，是危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的一種重要傳染病之一[1]。成雞發(fā)病后不造成死亡，但可使病禽生長遲緩，產(chǎn)蛋下降，種禽發(fā)病時孵化率降低等，若并發(fā)其他傳染病、寄生蟲病和衛(wèi)生條件、營養(yǎng)狀況不良時也可引起大批死亡，死亡率甚至高達40%～50%。雛雞發(fā)病死亡率較高，一般5%～30%不等。

雞痘鵪鶉化弱毒株是中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所于20世紀50-60年代開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品，經(jīng)過50多年來的大量實驗室試驗和田間實踐證明，該毒種毒力穩(wěn)定、安全、免疫原性好，是一株優(yōu)良的疫苗毒株[2]。為確保疫苗的有效性、純凈性和穩(wěn)定性，建立了雞痘鵪鶉化弱毒株毒種的種子批，為生產(chǎn)出合格的雞痘鵪鶉化弱毒株疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒種 分別取CVCC AV1003 F282 E2、E5、E9和E14代凍干毒種各2支，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所凍干、保存。

1.2 SPF雞及雞胚 11～12日齡雞胚、SPF雞由北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.3 診斷用抗原及抗體

1.3.1 瓊脂擴散(AGP)抗原和陽性血清 包括馬立克氏病病毒(MDV)、雞痘病毒(APV)、雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽呼腸孤病毒(REOV)等AGP抗原和陽性血清，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備。

1.3.2 血凝抑制(HI)抗原及標準陽性血清 H5、H7、H9亞型禽流感病毒(AIV)HI抗原及標準陽性血清，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。新城疫病毒(NDV)和減蛋綜合征病毒(EDSV)HI抗原及標準陽性血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備。

1.3.3 ELISA檢測試劑盒 包括禽白血病病毒(ALV)、禽腦脊髓炎病毒(AEV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)、雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽呼腸孤病毒(REOV)和雞傳染性貧血病毒(CAV)等ELISA檢測試劑盒，均購自IDEXX公司。

1.3.4 陰性血清 SPF雞血清，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備。

1.4 檢驗用培養(yǎng)基 硫乙醇酸鹽(T.G)、酪胨瓊脂(G.A)、葡萄糖蛋白胨湯(G.P)、改良Frey氏液體培養(yǎng)基、改良Frey氏固體培養(yǎng)基，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備。

1.5 毒種繁殖、凍干 將毒種用滅菌生理鹽水稀釋至10-2～10-3，經(jīng)雞胚絨毛尿囊膜上接種11～12日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，37 ℃繼續(xù)孵育至120 h。選接種后96～120 h死胚和120 h活胚，無菌采集有水腫或痘斑的絨毛尿囊膜，混合研磨后過濾，加入蔗糖脫脂奶保護劑后，進行冷凍真空干燥。

1.6 病毒含量及對雞胚的最小感染量測定 將E2、E5、E9和E14代毒種分別用生理鹽水進行10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7三個稀釋度，經(jīng)絨毛尿囊膜接種12日齡SPF雞胚，每個稀釋度接種雞胚5個，每胚0.2 mL，置37 ℃繼續(xù)孵育至120 h，雞胚絨毛尿囊膜水腫增厚或出現(xiàn)痘斑判為感染，計算EID50和對雞胚的最小感染量[3-4]。

1.7 純凈性 對E2、E5、E9和E14代種毒進行了純凈性檢驗，按照現(xiàn)行的 《中華人民共和國獸藥典》有關(guān)規(guī)定[5]，對種毒進行細菌、霉菌、支原體和外源病毒污染檢驗，其中外源病毒污染檢驗采用雞胚法。

1.8 免疫原性試驗 將E2、E5、E9和E14代毒種分別用滅菌生理鹽水稀釋至103.0EID50/0.1mL(含1羽份)。將50只14日齡的SPF雞分為5組，每組10只。第1、2、3、4組，翅內(nèi)側(cè)皮下分別注射E2、E5、E9和E14代病毒液0.1 mL/只(含1羽份)；第5組，不注射疫苗，作為對照組。免疫接種3周后，將所有雞用APV 102株強毒攻擊(含100個最小發(fā)痘量)，記錄雞群每日的發(fā)病與死亡情況。

1.9 最小發(fā)痘量 將E2、E5、E9和E14代毒種分別用生理鹽水按裝量復原后，稀釋至10-4，每代次用3月齡SPF雞3只，將雞大腿部毛拔掉約3 cm2，取0.2 mL毒液涂抹毛囊，觀察3周，記錄發(fā)痘情況。

1.10 對雞的安全性 將E2、E5、E9和E14代毒種用滅菌生理鹽水稀釋至104.0EID50/0.1mL(10羽份)，經(jīng)肌肉接種10只7日齡SPF雞，每只10羽份，同時加5只對照雞。觀察14 d的臨床癥狀，并記錄結(jié)果。

1.11 最小免疫劑量測定 將50只21日齡的SPF雞分為5組，第1組-第4組為接種組，第5組為對照組。接種組每只翅內(nèi)側(cè)皮下注射0.1 mL稀釋的E5代病毒液。其中第1組，接種劑量為每只雞40 EID50；第2組，接種劑量為每只雞20 EID50；第3組，接種劑量為每只雞10 EID50；第4組，接種劑量為每只雞5 EID50；第5組，不注射疫苗，作為對照組。免疫接種3周后，將所有雞用APV 102株攻擊(含100個最小發(fā)痘量)，記錄雞群每日的發(fā)病與死亡情況。

1.12 毒種保存期試驗 抽檢 1990年7月(E2代)、1993年1月(E5代)、1996年4月(E9代)三個代次的毒種，測定病毒含量測定和對雞胚的最小感染量。

1.13 剩余水分測定 按照現(xiàn)行的《中國獸藥典》附錄進行。

1.14 真空度測定 按照現(xiàn)行的《中國獸藥典》附錄進行。

2 結(jié) 果

2.1 病毒含量及對雞胚的最小感染量 E2、E5、E9和E14代凍干毒種的病毒含量及對雞胚最小感染量測定結(jié)果見表1，病毒含量在106.4～106.5EID50/0.2mL，對雞胚的最小感染量在10-5/0.2mL～10-6/0.2mL。試驗結(jié)果見表1。

表1 毒種病毒含量及對雞胚的最小感染量Tab 1 The virus content and the minimum infective dose of chick embryo

2.2 純凈性 雞痘鵪鶉化弱毒株毒種E2、E5、E9和E14代純凈，未受細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。試驗結(jié)果見表2。

2.3 免疫原性 第1、2、3、4組雞接種后14 d，對雞痘強毒攻擊均能產(chǎn)生完全保護作用，而第5組未免疫對照雞攻毒后，10/10發(fā)病。雞痘鵪鶉化弱毒株毒種E2、E5、E9和E14代免疫原性沒有明顯差異，均具有良好的免疫原性，免疫后攻毒均獲得保護。2.4 最小發(fā)痘量 雞痘鵪鶉化弱毒株E2、E5、E9和E14代涂沫毛囊后，試驗雞均出現(xiàn)局部毛囊紅腫、結(jié)痂，涂沫皮膚有輕微水腫，10 d左右結(jié)痂開始脫落，2～3周時康復，不引起全身痘及其他反應。最小發(fā)痘量均為≤10-4/0.2mL。

2.5 對雞的安全性 所有接種雞均健活，除接種局部出現(xiàn)紅腫、結(jié)痂，均無其他全身不良反應，精神食欲不受影響。由此證明雞痘鵪鶉化弱毒株對1周齡以上雛雞是安全的，可用于1周齡以上雛雞的免疫。試驗結(jié)果見表3。

2.6 最小免疫劑量測定 以含40 EID50、20 EID50、10 EID50的E5代種毒接種的21日齡SPF雞，攻毒保護率均為10/10，而以含5 EID50的E5代種毒接種的21日齡SPF雞，攻毒保護率為6/10，即最小免疫量為10 EID50。試驗結(jié)果見表3。

表2 毒種外源病毒血清學檢測結(jié)果Tab 2 Serological test of exogenous virus

“-”表示陰性，“+”表示陽性

"-"means negative, "+" means positive

表3 不同接種劑量免疫攻毒保護結(jié)果Tab 3 Results of attack protection against different doses of vaccination

2.7 保存期試驗 雞痘鵪鶉化弱毒株分別在-70 ℃以下保存22年、20年和17年進行病毒含量測定，結(jié)果病毒含量幾乎沒有變化，對雞胚最小感染量≤10-5/0.2mL，均符合《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇年版)規(guī)定。試驗結(jié)果見表4。

表4 保存前后病毒含量測定結(jié)果和對雞胚最小感染量Tab 4 The virus content before and after preservation and the minimum infective dose of chick embryo

2.8 剩余水分測定和真空度測定 四個代次的雞痘鵪鶉化弱毒凍干毒種剩余水分測定均小于3%，真空度測定均發(fā)出紫色輝光，檢驗結(jié)果符合規(guī)定。試驗結(jié)果見表5。

表5 毒種剩余水分與真空度測定結(jié)果Tab 5 Determination of residual water and vacuum of virus

3 小 結(jié)

本研究通過選用中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所雞痘鵪鶉化弱毒株CVCC AV1003 F282凍干毒種制備活疫苗，通過本動物免疫攻毒試驗表明，毒種E2、E5、E9和E14代免疫原性沒有明顯差異，均具有良好的免疫原性，免疫后攻毒均能夠產(chǎn)生完全的攻毒保護，以此為依據(jù)，建立了毒種的種子批，可以確定雞痘鵪鶉化弱毒株基礎(chǔ)種子代數(shù)為F282 E2～E6代，生產(chǎn)用毒種繼代應不超過3代[6-11]。

為保證各代次毒種質(zhì)量，本研究對E2、E5、E9和E14代次毒種分別進行安全性試驗。所有接種雞均健活，除接種局部出現(xiàn)紅腫、結(jié)痂，均無其他全身不良反應，精神食欲不受影響。由此證明雞痘鵪鶉化弱毒株對1周齡以上雛雞是安全的，可用于1周齡以上雛雞的免疫。

通過對雞痘鵪鶉化弱毒株各代次凍干種毒抽檢病毒含量測定、純凈性、特異性、免疫原性和安全性等，證明各代次病毒傳代穩(wěn)定；純凈性檢驗均無細菌、霉菌、支原體和外源病毒污染；雞痘鵪鶉化弱毒株凍干毒種在-70 ℃及以下保存，至少可達17年。本試驗種子批的建立可為雞痘鵪鶉化弱毒株疫苗的研制，以及將來的規(guī)?；a(chǎn)提供穩(wěn)定、可靠的生產(chǎn)用種毒。

[1] Y M Saif，A M Fadly.禽病學[M].蘇敬良，高 褔，索 勛，主譯.第 12 版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.

Y M Saif，A M Fadly.Diseases of poultryM].Su J L, Gao F, Suo X, main translation. Twelfth Edition. Beijing: China Agricultural Press, 2012.

[2] 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心.中國獸醫(yī)菌種目錄[M].2008年版. 北京：中國科學技術(shù)出版社，2008.

China Institute of Veterinary Drug Control, China Veterinary Culture Collection Center. Chinese veterinary species list[M]. 2008 Edition, Beijing: China Science and Technology Press, 2008.

[3] 農(nóng)業(yè)部獸藥審評中心.獸用生物制品試驗研究技術(shù)指導原則[M].北京. 2006年版.

Center for Veterinary Drug Ealuation, MOA. Technical guidelines for veterinary biological products test and research[M]. Beijing, 2006 Edition.

[4] 馬興樹. 禽傳染病實驗診斷技術(shù)[M]. 北京:化學工業(yè)出版社, 2006:170-176.

Ma X S. Avian infectious diseases laboratory diagnosis technology[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2006:170-176.

[5] 中國獸藥典委員會.中國人民共和國獸藥典[M].2010 年版.三部.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

Chinese Pharmacopoeia Committee. People's Republic of China Veterinary Pharmacopoeia [M]. 2010 edition. Third Volume. Beijing: China Agriculture Press, 2010.

[6] 范書才，李 虹，朱良全，等.鴨瘟滅活疫苗種毒篩選及生產(chǎn)用種毒種子批的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2009，31(6)：458-461.

Fan S C, Li H, Zhu L Q,etal. Establishment of master stocks for preparation of inactivated vaccine against duck plague [J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2009, 31 (6): 458-461.

[7] 王新衛(wèi)，賈文科，王澤霖，等.傳染性支氣管炎病毒M41株種子批的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(9)：3663-3664，3729.

Wang X V, Jia WK, Wang Z L,etal. Establishment of seed batches of strain M41 of infectious bronchitis virus [J]. Anhui Agricultural Sciences, 2008, 36 (9):3663-3664, 3729.

[8] 黃宇翔，劉力威，王志強，等.鵝細小病毒滅活疫苗種子批建立[J].中國獸藥雜志，2016，50( 4) ：11-15.

Huang Y X, Liu LW, Wang Z Q,etal. The seed lots built of goose parvovirus inactivated vaccine candidate [J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2016, 50 (4):11-15.

[9] 王永錄,張永光,方玉珍,等. 口蹄疫A型滅活疫苗毒種和種子批的研究[J]. 中國獸醫(yī)科學, 2006, 36(5): 371-375.

Wang Y L, Zhang Y G, Fang Y Z,etal. Studies on the virus seeds and seed batches of inactivated vaccine against foot-and-mouth disease virus type A[J]. Veterinary Science in China, 2006, 36 (5): 371-375.

[10] 公殿力, 李開軍, 王艦兵, 等. 長47株麻疹減毒活疫苗純化毒種三級種子批的建立及疫苗的臨床觀察[J]. 吉林醫(yī)學, 2005, 26(4): 407.

Gong D L, Li K J, Wang X B,etal. Establishment of three-tier virus seed library of 47 species of purified measles vaccine live and clinical observation of vaccine[J]. Jilin Medical University, 2005, 26 (4): 407.

[11] 李萍萍, 楊曉明, 張愛華, 等. SARS病毒NS-1株三級毒種庫的建立[J]. 中國生物制品學雜志, 2005, 18(3): 227-228.

Li P P, Yang X M, Zhang A H,etal. Construction of three-tier virus seed library of SARS virus NS-1 strain [J]. Chinese Journal of Biologicals, 2005, 18 (3): 227-228.

(編輯：李文平)

TheSeedLotsEstablishmentandIdentificationofAvianPoxVirus(QuailAdaptedStrain)

MAO Ya-qing，WANG Jia，WU Tao，WANG Zhe，KONG Dong-ni，LI Ling，LI HUI-Jiao*

(ChinainstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

LIHUI-Jiao,E-mail:lihuijiao@ivdc.org.cn

In order to ensure the vaccine virus seed quality and stability, avian pox virus quail adapted strain vaccine virus seed lots were established on the research basis of virus seed content, purity, specific, immunogenicity, safety and expanding propagation generations.The avian pox virus quail adapted strain attenuated F278 E1 (June 3, 1966 gelsiccation) by quail 4 passages (F282 E1), followed by chicken embryo passaged for 14 generations (F282 E14). The passaged identification results showed that the each generation of the virus had no bacteria, mycoplasma and exogenous virus pollution. The virus content was stable, no less than 106.2EID50/0.2 mL. The various generations of the virus was made live vaccine, the chickens after immunization can produce complete protection. Therefore, we ultimately determined that the master seed was F282 E2-E6 generation, the production virus following the generation should not exceed 3 generations. The establishment of the seed lot laid the foundation for avian pox virus quail adapted strain vaccine production.

avian pox virus quail adapted strain; seed lots; establishment and identification

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.02

2016-12-13

A

1002-1280 (2017) 11-0009-06

S852.65

毛婭卿，博士，從事獸用生物制品檢測工作。

李慧姣。E-mail:lihuijiao@ivdc.org.cn