反射式共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)毛囊蠕形螨感染的臨床應(yīng)用

陳 蕾 高 峰 于維恒 孫文啟 丁惠玲

·論著·

反射式共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)毛囊蠕形螨感染的臨床應(yīng)用

陳 蕾 高 峰 于維恒 孫文啟 丁惠玲

目的探討反射式共聚焦激光掃描顯微鏡(RCM)在毛囊蠕形螨檢測(cè)中的臨床應(yīng)用。方法對(duì)臨床52例酒渣鼻患者采用擠壓法、標(biāo)準(zhǔn)化皮膚表層取材法(SSSB)及RCM進(jìn)行毛囊蠕形螨檢測(cè)，并對(duì)其陽(yáng)性率、高螨密度檢出率(蠕形螨≥5個(gè)/cm2)及單位面積內(nèi)毛囊蠕形螨平均密度進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果擠壓法、標(biāo)準(zhǔn)化皮膚表層取材法(SSSB)及RCM法的陽(yáng)性率分別為69.23%、78.85%、100%。單位面積內(nèi)毛囊蠕形螨平均密度分別為8.21±6.45、16.22±13.12、410.8±203.2。結(jié)論RCM法在毛囊蠕形螨檢測(cè)中是一種更為敏感、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的方法。

反射式共聚焦激光掃描顯微鏡； 標(biāo)準(zhǔn)化皮膚表層取材法； 擠壓法； 毛囊蠕形螨

酒渣鼻(玫瑰痤瘡)是一種慢性炎癥性皮膚病，其特征性表現(xiàn)為面中部為主的一過(guò)性或持久性紅斑、毛細(xì)血管擴(kuò)張、可有丘疹或膿皰，嚴(yán)重者可以出現(xiàn)鼻贅或眼部損害。毛囊蠕形螨的大量繁殖是酒渣鼻發(fā)病的一個(gè)重要因素[1]。臨床用于檢測(cè)毛囊蠕形螨的方法主要是顯微鏡下鏡檢，取材方法包括透明膠帶法、擠壓法及標(biāo)準(zhǔn)化皮膚表層取材法(standardized skin surface biopsy，SSSB)，有研究表明SSSB法在高螨密度檢出率上優(yōu)于擠壓法[2]。反射式共聚焦激光掃描顯微鏡(Reflectance confocal microscopy，RCM)是一種實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、無(wú)創(chuàng)性皮膚檢測(cè)設(shè)備，目前已廣泛用于皮膚腫瘤[3-5]和色素性皮膚疾病[6,7]診療，顯示出較高臨床應(yīng)用價(jià)值。Sattler等發(fā)現(xiàn)可將FCM用于毛囊蠕形螨的檢測(cè)和計(jì)數(shù)[8]，但未與前述幾種方法進(jìn)行對(duì)照研究。為更好地探討RCM在毛囊蠕形螨檢測(cè)中的臨床應(yīng)用及意義，我們開(kāi)展了本項(xiàng)研究。

1 研究對(duì)象

2015年6月至2016年12月來(lái)我科就診的52例酒渣鼻患者，男28例，女24例；面部皮膚正常成年人50名，男25名，女25名。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，均經(jīng)患者知情同意。所有患者符合美國(guó)國(guó)家酒渣鼻協(xié)會(huì)專(zhuān)委會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)[9]，均有對(duì)稱(chēng)性面頰紅斑、丘疹，且1月內(nèi)未經(jīng)任何系統(tǒng)和局部治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：尋常痤瘡、脂溢性皮炎、糖皮質(zhì)激素依賴(lài)性皮炎、紅斑狼瘡；待檢皮損區(qū)有皮膚破損者；妊娠、哺乳者。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 取材 選取面頰部紅斑相對(duì)嚴(yán)重部位。①RCM法[2]：儀器設(shè)備為VivaScope 1500(VivaScope 1500，Lucid Inc，Rochester，NY，USA)，清潔待檢區(qū)域皮膚，礦物油做介質(zhì)，將皮損置于貼片中央位置，由淺至深進(jìn)行掃描，在觀(guān)察到毛囊蠕形螨的深度利用Vivablock進(jìn)行平掃，對(duì)1 cm2區(qū)域內(nèi)毛囊蠕形螨進(jìn)行計(jì)數(shù)；②在同一區(qū)域進(jìn)行SSSB法檢測(cè)[10]：在顯微鏡載玻片上用防水筆畫(huà)出1 cm2的標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域，內(nèi)滴1滴Dron alpha AA超能膠(珠海有限公司)，然后粘在待檢皮損上，待膠水干后(大約1 min)取下，在所取的樣品上滴加1～2滴浸潤(rùn)油使樣品透明化，蓋上蓋玻片；③擠壓法[11]：在類(lèi)似皮疹區(qū)域標(biāo)記1 cm2區(qū)域，在該區(qū)域使用擠壓環(huán)輕輕擠壓后再用刀片刮取皮膚表面皮屑及皮脂，涂于載玻片上，滴加1～2滴浸潤(rùn)油，加蓋蓋玻片。

2.2 鏡檢及計(jì)數(shù) 直接于光鏡下計(jì)數(shù)SSSB法及擠壓法所獲毛囊蠕形螨數(shù)量(個(gè)數(shù)/cm2)，發(fā)現(xiàn)成蟲(chóng)或蟲(chóng)卵記為陽(yáng)性，≥5個(gè)/cm2為高螨密度。RCM法可直接于所獲圖像上進(jìn)行計(jì)數(shù)。同時(shí)，對(duì)50名年齡、性別與實(shí)驗(yàn)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的正常人用RCM法進(jìn)行面部毛囊蠕形螨的檢測(cè)。待檢區(qū)域統(tǒng)一選擇右側(cè)面頰部1 cm2區(qū)域。分別對(duì)10 mm2面積內(nèi)毛囊蠕形螨平均密度、單個(gè)受累毛囊內(nèi)蠕形螨數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)，并與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)照。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，三種方法毛囊蠕形螨陽(yáng)性率和高螨密度檢出率比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)；毛囊蠕形螨數(shù)量比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

本研究實(shí)驗(yàn)組涉及酒渣鼻患者52例(男28，女24)，對(duì)照組為面部正常皮膚人群50名(男25，女25)，患者組平均年齡為(40.5±11.6)歲，對(duì)照組為(40.7±10.5)歲，兩組在年齡與性別上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。擠壓法光鏡下毛囊蠕形螨體細(xì)長(zhǎng)呈蠕蟲(chóng)狀，乳白色，半透明，顎體寬，肢細(xì)，足粗短(圖1)；SSSB法鏡下毛囊蠕形螨表現(xiàn)為毛囊內(nèi)單個(gè)或簇集的透明、紡錘形結(jié)構(gòu)(圖2)；RCM下毛囊蠕形螨縱切面為蠕蟲(chóng)狀，頭部閃亮，體部暗(圖3a)，當(dāng)RCM平面垂直毛囊時(shí)，毛囊蠕形螨表現(xiàn)為膨大的毛囊內(nèi)簇集的、閃亮的、圓形或錐形灰色結(jié)構(gòu)，周?chē)型该鳝h(huán)，直徑大約4～8 μm(圖3b)。據(jù)我們觀(guān)察，在距表皮10～90 μm的深度掃描均能獲得較為滿(mǎn)意的不同深度毛囊蠕形螨圖像。單個(gè)毛囊內(nèi)毛囊蟲(chóng)數(shù)量最多可達(dá)10條(圖3c)。

圖1 擠壓法光鏡下毛囊蠕形螨體細(xì)長(zhǎng)呈蠕蟲(chóng)狀，乳白色，半透明，顎體寬，肢細(xì)，足粗短

圖2 SSSB法鏡下毛囊蠕形螨表現(xiàn)為毛囊內(nèi)單個(gè)或簇集的透明、紡錘形結(jié)構(gòu)

3a:RCM下毛囊蠕形螨縱切面為蠕蟲(chóng)狀，頭部閃亮，體部暗；3b:RCM下毛囊蠕形螨橫切面表現(xiàn)為膨大的毛囊內(nèi)簇集的、閃亮的、圓形或錐形灰色結(jié)構(gòu)，周?chē)型该鳝h(huán)，直徑大約4～8 μm；3c:單個(gè)毛囊內(nèi)毛囊蟲(chóng)數(shù)量最多可達(dá)10條

圖3 RCM下不同切面毛囊蠕形螨圖像

分別用三種方法對(duì)52例酒渣鼻患者進(jìn)行毛囊蠕形螨檢測(cè)，RCM法陽(yáng)性52例(100%)，SSSB法陽(yáng)性41例(78.85%)，擠壓法陽(yáng)性36例(69.23%)，三種方法陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。RCM法的高螨密度檢出率為100%(52例)，SSSB法76.92%(40例)，擠壓法55.77%(29例)，三種方法兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.001)。RCM法檢測(cè)的單位面積內(nèi)毛囊蠕形螨平均密度為410.8±203.2，SSSB法16.22±13.12，擠壓法8.21±6.45，三種方法兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.001)。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)將50名面部正常皮膚人群作為對(duì)照組，用FCM法進(jìn)行了毛囊蠕形螨檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 mm2面積內(nèi)實(shí)驗(yàn)組蠕形螨均數(shù)為41.1±20.3，對(duì)照組為5.12±5.40(Plt;0.001)；實(shí)驗(yàn)組單個(gè)受累毛囊內(nèi)蠕形螨平均數(shù)量3.85±0.62，對(duì)照組0.79±0.82(Plt;0.001)。實(shí)驗(yàn)組單個(gè)受累毛囊蠕形螨數(shù)量一般1～4條，而對(duì)照組lt;2條。

4 討論

寄生于人體皮膚的蠕形螨有兩種，毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨，它們寄生于毛囊皮脂腺單位，以皮脂腺分泌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為生。毛囊蠕形螨一般寄生于毛囊漏斗部，而皮脂蠕形螨寄生于皮脂腺或者毛囊的深部。正常中年人或者老年人蠕形螨的寄生率幾乎為100%，當(dāng)然，螨密度很低。當(dāng)蠕形螨移居至皮膚表面或者數(shù)量明顯增多時(shí)就可成為致病因素。已知與毛囊蠕形螨感染相關(guān)的疾病，見(jiàn)表1[12，13]。

表1 蠕形螨感染相關(guān)疾病

雖然毛囊蠕形螨與多種皮膚病相關(guān)，但其具體病理機(jī)制尚不完全清楚。1971年，Marks和Dawber首次描述了皮膚表層取材法用于檢測(cè)毛囊蠕形螨[14]，后來(lái)由Forton和Seys進(jìn)一步發(fā)展，該技術(shù)是使用氰基丙烯酸酯凝膠獲取角質(zhì)層及毛囊內(nèi)容物以進(jìn)行鏡檢。Forton等推薦螨密度≥5個(gè)/cm2作為蠕形螨相關(guān)疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并認(rèn)為本方法是檢測(cè)蠕形螨密度最有效的方法[15]。國(guó)內(nèi)臨床檢查毛囊蠕形螨主要采用擠壓法直接鏡檢，是一種無(wú)創(chuàng)、方便、有效的方法。在鏡檢陽(yáng)性率上，擠壓法與SSSB法無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在高螨密度檢出率上，后者優(yōu)于前者[2]。而螨密度是決定其是否為致病因素的重要標(biāo)準(zhǔn)，故SSSB法較之?dāng)D壓法更為敏感和準(zhǔn)確。

RCM可以實(shí)現(xiàn)表皮和真皮淺層細(xì)胞水平的實(shí)時(shí)成像，為皮膚科臨床提供了一種在體無(wú)創(chuàng)檢查手段，其在黑素細(xì)胞腫瘤及色素性皮膚病的檢查中具有特殊意義，且隨著RCM技術(shù)的開(kāi)展，其應(yīng)用亦越來(lái)越廣泛。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外大量研究也表明，諸如銀屑病、扁平苔蘚、急性接觸性皮炎和脂溢性皮炎等炎癥性皮膚病均具有一些獨(dú)特的RCM圖像特征，可在一定程度上替代組織病理學(xué)檢查，用于這類(lèi)疾病的鑒別診斷和療效觀(guān)察[16-19]。酒渣鼻是臨床常見(jiàn)的一種慢性炎癥性皮膚病，毛囊蠕形螨與其發(fā)病密切相關(guān)。Longo和Slutsky用VivaScope1500對(duì)毛囊蠕形螨進(jìn)行了檢測(cè)，近期有研究對(duì)酒渣鼻患者毛囊蠕性感染情況用此法進(jìn)行了檢測(cè)評(píng)估[20，21]。本研究以此為基礎(chǔ)，對(duì)上述三種毛囊蠕形螨的檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比分析。

本研究中，RCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的單位面積(1 cm2)內(nèi)毛囊蠕形螨平均密度為410.8±203.2，與以往有關(guān)研究報(bào)道的數(shù)據(jù)略有差異[8，22]，不排除與實(shí)驗(yàn)對(duì)象病種的選擇及疾病不同時(shí)期有關(guān)。如前所述，原發(fā)性毛囊蠕形螨病與繼發(fā)性毛囊蠕形螨病在蠕形螨檢出率及數(shù)量上會(huì)存在一定差異。Forton用SSSB法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蠕形螨病與丘疹膿皰期酒渣鼻患者的蠕形螨個(gè)數(shù)分別為61/cm2和36/cm2[23]，這也解釋了本研究與既往研究所報(bào)道的結(jié)果差異。

另外，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組單位面積內(nèi)蠕形螨均數(shù)為41.1±20.3，對(duì)照組為5.12±5.40(Plt;0.001)。既往SSSB法指出，毛囊蠕形螨數(shù)量≥5個(gè)/cm2為高螨密度，可參考作為致病因素，但由于RCM能更精準(zhǔn)的對(duì)毛囊蠕形螨數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，其敏感性強(qiáng)于SSSB法，故當(dāng)應(yīng)用RCM法進(jìn)行毛囊蠕形螨的檢測(cè)時(shí)，究竟何種密度可作為致病因素參考，尚需進(jìn)一步大量本研究。

本研究綜合三種毛囊蠕形螨的檢測(cè)方法，對(duì)其陽(yáng)性率、高螨密度檢出率及蠕形螨數(shù)量進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RCM法在毛囊蠕形螨檢測(cè)中是一種更為敏感、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的方法。其一，RCM實(shí)時(shí)光學(xué)截面每層厚度小于5 μm，最大穿透深度250～300 μm，涵蓋表皮層、真皮乳頭層及淺表血管叢，基本覆蓋毛囊蠕形螨生存的解剖深度；水平分辨率為0.5～1 μm，故橫向掃描全面；而擠壓法及SSSB法不能避免取材不盡的人為誤差，且如果皮疹區(qū)角化過(guò)度、毛囊較深，就會(huì)因取樣層次表淺而致結(jié)果受影響。其二，RCM法不需要像擠壓法及SSSB法一樣有輕度擠壓或黏貼的不適、需要枯燥的取樣等待時(shí)間，完全避免了氰基丙烯酸酯凝膠基質(zhì)過(guò)敏的可能性及創(chuàng)傷的痛苦，且具有檢查的可重復(fù)性，極大提高舒適度及準(zhǔn)確性。再者，擠壓法及SSSB法檢測(cè)毛囊蠕形螨或多或少都對(duì)檢測(cè)區(qū)域皮膚有所改變，而RCM可以做到在真實(shí)的生存環(huán)境下對(duì)毛囊蠕形螨進(jìn)行觀(guān)察。

當(dāng)然，RCM法只能觀(guān)察毛囊蠕形螨，皮脂腺蠕形螨一般寄居在皮脂腺附近，由于掃描深度限制通過(guò)RCM較難發(fā)現(xiàn)；RCM目前還不能檢測(cè)評(píng)估毛囊蠕形螨生活階段不同所呈現(xiàn)的形態(tài)差異。隨著技術(shù)改進(jìn)及發(fā)展，相信RCM的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。

[1] Holmes AD. Potential role of microorganisms in the pathogenesis of rosacea[J]. J Am Acad Dermatol,2013,69(6):1025-1032.

[2] 李婷，陳向明，張海清，等.標(biāo)準(zhǔn)化皮膚表層取材法用于酒渣鼻患者皮膚毛囊蠕形螨鏡檢[J].中華皮膚科雜志，2015,48(7):503-504.

[3] Pellacani G, Scope A, Farnetani F, et al. Towards an in vivomorphologic classification of melanocytic nevi[J]. J Eur Acad Dermatol Venereol,2013,10:422-424.

[4] Prodinger C, Tatarski R, Laimer M, et al. Large congenital nevusspilus-improved follow-up through the use of in vivo reflectanceconfocal microsacopy[J]. Dermatol Pract Concept,2013,3:55-58.

[5] Longo C, Lallas A, Kyrgidis A, et al. Classifying distinct basal cell carcinoma subtype by means of dermatoscopy and reflectance confocal microscopy[J]. J Am Acad Dermatol,2014,71(4):716-724.

[6] 劉華緒，林燕，陳學(xué)超，等.白癜風(fēng)及其它色素減退性皮膚病的RCM圖像特點(diǎn)[J].中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2012,28(3)：192-196.

[7] Liu H, Lin Y, Nie X, et al. Histological classification of melasmawith reflectance confocal microscopy: a pilot study in chinesepatients[J]. Skin Research Technology,2011,17(4):398-403.

[8] Sattler EC, Maier T, Hoffmann VS, et al. Noninvasive in vivo detection and quantification of demodex mites by confocal laser scanning microscopy[J]. Br J Dermatol,2012,167:1042-1047.

[9] Wilkin J,Dahl M, Detmar M,et al. Standard grading system for rosacea: report of the national rosacea society expert committee on the classification and staging of roascea[J]. J Am Acad Dermatol,2004,50(6):907-912.

[10] Forton F,Seys B, Marchal JL,et al. Demodex folliculorum and topical treatment: acaricidal action evaluated by standardized skin surface biopsy[J]. Br J Deematol,1998,138(3):461-466.

[11] 商繼科，許淑珍，姜桂艷，等.1103例健康人群及面部皮膚疾病患者蠕形螨調(diào)查分析[J].實(shí)用皮膚病學(xué)雜志，2010，3(1)：13-15.

[12] Moravvej H, Dehghan-Mangabadi M,Abbsian MR, et al. Association of rosaceae with demodicosis[J]. Arch Iran Med,2007,10(2):199-203.

[13] Hsu CK, Hsu MML, Lee JYY. Demodicosis: a clinicopathological study[J]. J Am Acad Dermatol,2009,60(3):453-462.

[14] Marks R, Dawber RP. Skin surfacebiopsy: an improved technique for the examination of the horny layer[J]. Br J Dermatol,1971,84:117-123.

[15] Askin U, Seckin D. Comparison of the two techniques for measurement of the density of demodex folliculorum: standardized skin surface biopsy and direct microscopic examination[J]. Br J Dermatol,2010,162:1124-1126.

[16] Zhong LS, Wei ZP, Liu YQ. Sensitivity and specificity of munro microabscess detected by reflectance confocal microscopy in the diagnosis of psoriasis vulgaris[J]. J Dermatol,2012,39(3):282-283.

[17] 權(quán)晟，魏志平，劉彥群,等.扁平苔蘚的共聚焦激光掃描顯微鏡影像特征[J].臨床皮膚科雜志，2012,41(8):461-462.

[18] Meinke MC, Richter H, Kleemann A, et al. Characterization of atopic skin and the effect of a hyperforin-rich cream by laser scanning microsaopy[J]. J Biomed Opt,2015,20(5):051013.

[19] 江文才，袁超.反射式共聚焦顯微鏡在炎癥性皮膚病診療中的作用[J].中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2017,33(5):312-316.

[20] Longo C, Pellacani G, Ricci C, et al. In vivo detection of demodex folliculorum by means of confocal microscopy[J]. Br J Dermatol,2012,166:690-692.

[21] Slutsky JB, Rabinovitz H, Grichnik JM, et al. Reflectance confocal microscopic features of dermatophytes, scabies, and demodex[J]. Arch Dermatol,2011,147:1008.

[22] Turgut Erdemir A, Gurel MS, Koku Aksu AE, et al. Reflectance confocal microscopy vs. standardized skin surface biopsy for measuring the density of demodex mites[J]. Skin Res Technol,2014,20(4):435-439.

[23] Forton F, Germaux MA, Brasseur T, et al. Demodicosis and rosacea: epidemiology and significance in daily dermatologic practice[J]. J Am Acad Dermatol,2005,52(1):74-87.

(收稿：2017-07-03 修回：2017-08-17)

Clinicalapplicationofreflectanceconfocalmicroscopyformonitoringthedensityofdemodexmites

CHENLei,GAOFeng,YUWeiheng,SUNWenqi,DINGHuiling.

WeifangInstitudeofDermatology,ShandongWeifang261061,China

CHENLei,E-mail:cl_cp@126.com

Objective: To determine the role of reflectance confocal microscopy (RCM) for monitoring the density of demodex mites.MethodsThe positivity rate, high number of mites (≥5 mites /cm2) and mean number of mites per 10 mm2of demodex mites in 52 patients with rosacea were detected by extrusion method, standardized skin surface biopsy (SSSB) and RCM respectively.ResultsThe positivity rates of extrusion method, SSSB and RCM were 69.23%, 78.85% and 100% and the mean number of mites per 10 mm2was 8.21±6.45, 16.22±13.12 and 410.8±203.2.ConclusionRCM is more sensitive and simple for the detection of demodex mites in the patients with rosacea.

reflectance confocal microscopy; standardized skin surface biopsy; extrusion method; demodex mites

濰坊市皮膚病防治所，山東濰坊，261061

陳蕾，E-mail：cl_cp@126.com