蘇 亮,溫佳奇,游 穎,胡書(shū)蒙,劉夢(mèng)楊,馬 靜,王玉華

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

乳酸菌發(fā)酵蛋殼粉制備液態(tài)飼料添加劑的研究

蘇 亮,溫佳奇,游 穎,胡書(shū)蒙,劉夢(mèng)楊,馬 靜,王玉華

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

我國(guó)作為禽蛋生產(chǎn)大國(guó)，消費(fèi)者對(duì)蛋制品的需求量逐年上升，導(dǎo)致每年有大量的蛋殼產(chǎn)生，這些蛋殼在我國(guó)的利用率較低，大部分被廢棄，既造成資源的浪費(fèi)又污染環(huán)境。以蛋殼為原料，利用鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)發(fā)酵制備飼料添加劑，采用正交試驗(yàn)的方法對(duì)葡萄糖、玉米漿、接種量和蛋殼粉四種培養(yǎng)基的組分進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳添加量。利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和搖床速率進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵工藝。結(jié)果表明：葡萄糖添加量6%、玉米漿添加量5%、接種量7%、蛋殼粉添加量7%、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間40 h，搖床速率150 r/min，發(fā)酵液中L-乳酸鈣含量為89.68 g/L。

乳酸菌；蛋殼粉；L-乳酸鈣；飼料添加劑

我國(guó)蛋殼年產(chǎn)量已突破300萬(wàn)t。目前僅有少量蛋殼通過(guò)簡(jiǎn)單處理用作肥料、土壤調(diào)節(jié)劑和動(dòng)物飼料添加劑等[1]，產(chǎn)品附加值低。大部分蛋殼被廢棄，造成資源浪費(fèi)和嚴(yán)重的環(huán)境污染[2]。

蛋殼的主要成分是碳酸鈣，同時(shí)含有1%左右的碳酸鎂，3.2%的磷酸鈣和磷酸鎂及2.8%的有機(jī)物[3]。以蛋殼為原料制備的蛋殼粉含鈣36%～37%、磷0.15%，可以滿足畜禽對(duì)鈣磷的需要[4]，常被用作動(dòng)物飼料添加劑。Chang[5]發(fā)現(xiàn)：以碳酸鈣和蛋殼粉作為飼料添加劑添加到小鼠日糧中，對(duì)比小鼠的骨骼生長(zhǎng)和骨鈣含量等情況，發(fā)現(xiàn)蛋殼粉都要好于碳酸鈣。另外，在豬的日糧中添加2%的蛋殼粉，有利于鈣磷比例的調(diào)整和獲得必要的微量元素等[6]，羊、牛飼料中添加1%的蛋殼粉，可使體重快速增加并使產(chǎn)奶量增高。蛋殼粉添加到產(chǎn)蛋雞日糧中，可提高產(chǎn)蛋率，延長(zhǎng)產(chǎn)蛋期[7]。但是蛋殼中的碳酸鈣為無(wú)機(jī)鈣，不易被機(jī)體吸收利用，造成了鈣元素浪費(fèi)。因此，目前研究人員重點(diǎn)研究有機(jī)酸鈣制劑，如乳酸鈣、葡萄糖酸鈣、醋酸鈣等[8]。王繼華等[9]通過(guò)比較甲酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣及檸檬酸對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響，發(fā)現(xiàn)乳酸鈣對(duì)仔豬的促生長(zhǎng)作用最好。以蛋殼粉為原料制備有機(jī)酸鈣的方法主要有：微生物發(fā)酵法、高溫煅燒法和直接中和法[10]。微生物發(fā)酵法因其具有耗能低、節(jié)約成本、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，更適用于生產(chǎn)制備乳酸鈣[11]。常用的微生物是乳酸菌，乳酸菌可以利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，包括D-乳酸、L-乳酸及D,L-乳酸。其中L-乳酸可以在機(jī)體內(nèi)完全降解為CO2和水，不會(huì)造成酸中毒。鼠李糖乳桿菌代謝屬同型發(fā)酵，且其代謝產(chǎn)物為L(zhǎng)-乳酸,所以本研究采用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵蛋殼粉制備飼料添加劑。

1 材料和方法

1.1材料

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、葡萄糖、玉米漿(含有可溶性蛋白、生長(zhǎng)素和一些前體物質(zhì))、MRS培養(yǎng)基、鈣指示劑、硫酸鎂(MgSO4)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)等。

1.2方法

1.2.1雞蛋殼預(yù)處理

將收集來(lái)的雞蛋殼，用粉碎機(jī)粉碎過(guò)篩后，馬弗爐900℃煅燒2 h，得到雞蛋殼粉末裝瓶備用。

1.2.2L-乳酸鈣含量的測(cè)定

1.2.2.1測(cè)定方法

取發(fā)酵液2 ml，滴加到250 ml錐形瓶中，加入50 ml蒸餾水、2 ml鎂溶液、5 ml 20%NaOH溶液、2 ml HCl溶液(1+4)和10 mg鈣指示劑，搖勻后，用EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，記錄EDTA消耗量。測(cè)定平行樣，取平均值。

1.2.2.2乳酸鈣含量計(jì)算

W=C1×V2×308.3/2，

式中，W為L(zhǎng)-乳酸鈣含量，g/L；C1為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V2為發(fā)酵液消耗EDTA溶液體積，ml；308.3為L(zhǎng)-乳酸鈣摩爾質(zhì)量，g/mol。

1.2.3發(fā)酵單因素試驗(yàn)

分別對(duì)葡萄糖添加量(A)、玉米漿添加量(B)、接種量(C)、蛋殼粉添加量(D)、發(fā)酵溫度(X1)、發(fā)酵時(shí)間(X2)、搖床速率(X3)7個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以L-乳酸鈣含量為指標(biāo)，選取試驗(yàn)最優(yōu)值。

1.2.3.1葡萄糖添加量單因素試驗(yàn)

以0.1 L蒸餾水為發(fā)酵體系，葡萄糖添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%、玉米漿添加量為7%、蛋殼粉添加量3%，滅菌后接入菌液3%、120 r/min，37℃下發(fā)酵48 h，EDTA法檢測(cè)L-乳酸鈣含量。

1.2.3.2玉米漿添加量單因素試驗(yàn)

以0.1 L蒸餾水為發(fā)酵體系，葡萄糖添加量6%、玉米漿添加量分別為1%、3%、5%、7%、9%、蛋殼粉添加量為3%，滅菌后接入菌液3%，120 r/min，37℃下發(fā)酵48 h，EDTA法檢測(cè)L-乳酸鈣含量。

1.2.3.3接菌量單因素試驗(yàn)

以0.1 L蒸餾水為發(fā)酵體系，葡萄糖添加量6%、玉米漿添加量5%、蛋殼粉添加量5%，滅菌后接入1%、3%、5%、7%、9%的菌液，120 r/min，37℃下發(fā)酵48 h，EDTA法檢測(cè)L-乳酸鈣含量。

1.2.3.4蛋殼粉添加量單因素試驗(yàn)

以0.1 L蒸餾水為發(fā)酵體系，葡萄糖添加量6%、玉米漿添加量5%、蛋殼粉添加量分別為1%、3%、5%、7%、9%，滅菌后接入菌液5%，120 r/min，37℃下發(fā)酵48 h，EDTA法檢測(cè)L-乳酸鈣含量。

1.2.3.5搖床速率單因素試驗(yàn)

以0.1 L蒸餾水為發(fā)酵體系，葡萄糖添加量6%、玉米漿添加量5%、蛋殼粉添加量5%，滅菌后接入5%的菌液，搖床速率分別為40、80、120、160、200 r/min，37℃下發(fā)酵48 h，EDTA法檢測(cè)L-乳酸鈣含量。

1.2.3.6發(fā)酵溫度單因素試驗(yàn)

以0.1 L蒸餾水為發(fā)酵體系，葡萄糖添加量6%、玉米漿添加量5%、蛋殼粉添加量5%，滅菌后接入5%的菌液，搖床速率120 r/min，分別在31、33、35、37、39℃下發(fā)酵48 h，EDTA法檢測(cè)L-乳酸鈣含量。

1.2.3.7發(fā)酵時(shí)間單因素試驗(yàn)

以0.1 L蒸餾水為發(fā)酵體系，葡萄糖添加量6%、玉米漿添加量5%、蛋殼粉添加量5%，滅菌后接入5%的菌液，搖床速率120 r/min，37℃下分別發(fā)酵16、24、32、40、48 h，EDTA法檢測(cè)L-乳酸鈣含量。

1.2.4正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、玉米漿、接種量和蛋殼粉四種組分進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

表1 L9(34)正交因素水平表

1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件

培養(yǎng)基組分優(yōu)化后，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、搖床速率三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

發(fā)酵單因素試驗(yàn)以L-乳酸鈣的含量為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分結(jié)果與分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果為葡萄糖添加量6%、玉米漿添加量5%、接種量5%、蛋殼粉添加量5%,采用正交的方法按照表1設(shè)計(jì)對(duì)四種組分進(jìn)行優(yōu)化，搖床速率、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別為120 r/min、37℃和40 h，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知，影響乳酸鈣含量的因素的主次順序?yàn)椋篈gt;Cgt;Dgt;B。通過(guò)極差分析得到的最佳工藝條件為：A2B2C3D3，即：葡萄糖添加量6%、玉米漿添加量5%、接種量7%、蛋殼粉添加量7%，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得出該培養(yǎng)基組分發(fā)酵時(shí)L-乳酸鈣的含量為88.35 g/L。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件結(jié)果與分析

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及二次模型方差分析

根據(jù)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和搖床速率單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法對(duì)這三個(gè)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 響應(yīng)面二次模型方差分析

注：Plt;0.05，影響顯著；Plt;0.01,影響極顯著。

2.3.2響應(yīng)面交互作用結(jié)果與分析

由圖2～圖4可知，L-乳酸鈣的含量隨著各因素水平的增大呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，但減少量較少。由圖2～圖4及表5可知，發(fā)酵時(shí)間和搖床速率兩項(xiàng)交互作用顯著。搖床速率對(duì)L-乳酸鈣含量影響的等高線較密集，發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)L-乳酸鈣含量影響的等高線較稀疏，說(shuō)明搖床速率的影響更為顯著，與模型方差分析得出的結(jié)論一致。

圖2 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)L-乳酸鈣含量影響的響應(yīng)面圖

圖3 發(fā)酵溫度和搖床速率對(duì)L-乳酸鈣含量影響的響應(yīng)面圖

圖4 發(fā)酵時(shí)間和搖床速率對(duì)L-乳酸鈣含量影響的響應(yīng)面圖

2.3.3最佳工藝條件確定及模型驗(yàn)證

通過(guò)模型分析確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵溫度37.25℃、發(fā)酵時(shí)間40.44 h、搖床速率152.17 r/min，L-乳酸鈣的理論含量為89.55 g/L。從實(shí)際生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)方面考慮，將工藝條件修改為發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間40 h、搖床速率150 r/min，重復(fù)試驗(yàn)后得出L-乳酸鈣的實(shí)際含量為89.68 g/L，與理論值相差0.13 g/L。

3 討論

蛋殼中的鈣含量豐富，是天然綠色鈣源，加大蛋殼中鈣的利用，是一種有效提高蛋殼資源利用率、創(chuàng)造社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益、減少環(huán)境污染的有效措施。發(fā)酵飼料所用的傳統(tǒng)菌種為干酪乳桿菌、植物乳桿菌等。韋剛等[12]利用植物乳桿菌LP199發(fā)酵馬蹄渣、馬蹄淀粉廢水制備飼料添加劑，產(chǎn)酸量達(dá)(0.91～1.10) g/(100 g)。Missotten等[13]利用植物乳桿菌發(fā)酵家禽飼料48 h,得到濕飼料飼喂肉雞，提高了飼料利用率，使雞空腸中段和回腸的絨毛高度分別提高了22.6%和16%。縣怡涵等[14]使用植物乳桿菌和干酪乳桿菌菌液與去離子水對(duì)照灌胃7日齡仔豬，結(jié)果表明乳桿菌菌液可提高仔豬的進(jìn)食量、降低料重比、提高仔豬的抗腹瀉功能。尹淑帥[15]研究發(fā)現(xiàn)，將干酪乳桿菌ATCC393加入到雛雞的飲用水中，可提高雛雞腸道內(nèi)乳酸菌的含量，并提高雛雞的免疫機(jī)能，可以產(chǎn)生抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有害菌生長(zhǎng)的物質(zhì)。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌能夠有效的減緩斷奶仔豬的腹瀉，使腸道中IGA分泌物增加，TNF-Α的分泌減少。本研究的鼠李糖乳桿菌，具有產(chǎn)L-乳酸量大，腸道黏著率高，且降低膽固醇含量，促進(jìn)細(xì)胞分裂，調(diào)節(jié)腸道菌群、排除毒素、提高機(jī)體免疫力等重要的生理功能。以往生產(chǎn)乳酸鈣往往采用MRS為發(fā)酵底物，成本較高。本研究采用生產(chǎn)玉米淀粉的副產(chǎn)物玉米漿為碳源，蛋殼粉為鈣源發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸鈣飼料添加劑，不僅提高了資源的利用率，同時(shí)降低了生產(chǎn)成本，為蛋殼資源在飼料中的應(yīng)用做出了相應(yīng)的貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

以L-乳酸鈣含量為指標(biāo)，利用單因素和正交試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵制備高鈣飼料添加劑的的培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，確定最佳培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件為葡萄糖添加量6%、玉米漿添加量5%、接種量7%、蛋殼粉添加量7%、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間40 h、搖床速率150 r/min，發(fā)酵液中L-乳酸鈣含量89.68 g/L。

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(責(zé)任編輯：舒蓮梅)

PreparationofliquidfeedadditivefromeggshellpowderfermentedbyLactobacillus

SU Liang，WEN Jia-qi，YOU Ying，HU Shu-meng，LIU Meng-yang，MA Jing，WANG Yu-hua

(College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)

China, a great output of egg products country, the consumer demand of egg products is increasing progressively with years, while a large quantity of eggshells are discarded and the low utilization rate has caused the resources wasted and environment polluted. Feed additives were prepared by fermentation ofLactobacillusrhamnosususing eggshell as raw material. The components of four kinds of medium, glucose, corn steep liquor, inoculation amount and eggshell powder were optimized by orthogonal test, and the optimum dosage was obtained. The fermentation temperature, fermentation time and shaker rate were optimized by Box-Behnken test design, and the optimum fermentation process was obtained by response surface methodology. The results showed that the addition of glucose was 6%, the dosage of corn steep was 5%, the inoculation amount was 7%, the dosage of eggshell powder was 7%, the fermentation temperature was 37℃, the fermentation time was 40 h, the shaking rate was 150 r / min, the content ofL-calcium lactate was 89.68 g/L.

Lactobacillus; eggshell powder; L-calcium lactate; feed additive

2017-09-01；

2017-10-21

蘇 亮(1993-)，男，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與功能性食品。

王玉華(1972-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称飞镏圃旒肮δ苄允称贰?/p>

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.11.014

S816.6;S816.71

A

1003-6202(2017)11-0059-05