白藜蘆醇減輕LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷并抑制TLR4/NF-κB活化

呼海燕 劉彩宏

白藜蘆醇減輕LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷并抑制TLR4/NF-κB活化

呼海燕 劉彩宏

目的探究白藜蘆醇(RES)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)損傷的保護(hù)作用。方法體外培養(yǎng)并鑒定hPDLCs，將培養(yǎng)的hPDLCs隨機(jī)分為5組：對照組、LPS(10 μg/ml)+RES(0、 30、 60、 90 μmol/L)組，MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力，ELISA檢測各組細(xì)胞分泌TNF-α/IL-6水平，PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果分離培養(yǎng)的hPDLCs抗波絲蛋白表達(dá)陽性，抗角蛋白表達(dá)陰性。與對照組比，LPS處理后細(xì)胞增殖能力明顯降低，細(xì)胞分泌TNF-α/IL-6水平和TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加； 30～90 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理后，細(xì)胞增殖能力增加(Plt;0.05)，細(xì)胞分泌TNF-α/IL-6水平、TLR4/NF-κB mRNA以及蛋白表達(dá)則下調(diào)(Plt;0.05)，均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。結(jié)論白藜蘆醇可抑制TLR4/NF-κB活化并減輕LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷。

白藜蘆醇； LPS； 人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)； TLR4； NF-κB

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌的致病因子，它能誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，進(jìn)而導(dǎo)致牙周疾病的發(fā)生[1]。白藜蘆醇(resveratrol，RES)是一種天然抗氧化劑，具有抗腫瘤、抗炎等活性[2]，但其在牙周疾病免疫炎癥中的報(bào)道相對較少，因此，本研究選擇人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs)進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，分別通過MTT、ELISA、PCR、Western blot等方法，檢測細(xì)胞增殖能力，炎性因子分泌和TLR4/NF-κB表達(dá)等變化，以探究RES對LPS誘導(dǎo)的hPDLCs損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Gemini)；兔抗人Toll樣受體4(Toll like receptors 4，TLR4)多克隆抗體，兔抗人NF-κB p65多克隆抗體(Sigma)；ELISA試劑盒(TNF-α，IL-6)、抗細(xì)胞波絲蛋白多克隆抗體、抗細(xì)胞角蛋白多克隆抗體、免疫組化染色試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hPDLCs的原代培養(yǎng) 取延安大學(xué)附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科10～15 歲因正畸需要拔除的10 顆健康牙齒，已征得患者本人和家屬的同意。牙離體之后，迅速用含有雙抗的磷酸緩沖溶液PBS沖洗，置于DMEM培養(yǎng)液(含雙抗、10% FBS)中，用雙抗液漂洗后，經(jīng)不含血清的完全培養(yǎng)液的潤濕，用手術(shù)刀刮取牙根中1/3的牙周膜。將牙周膜組織剪成1 mm×1 mm×1 mm，均勻鋪在25 ml的培養(yǎng)瓶中，加入DMEM 培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2下培養(yǎng)4 h后翻瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液，取3～6 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定hPDLCs 取第3代hPDLCs爬片培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋至60%左右時(shí)，用4%甲醛溶液固定，角蛋白與波形絲蛋白染色，光鏡下觀察。

1.2.3 繪制hPDLCs生長曲線 取第3 代對數(shù)生長期的hPDLCs，接種至96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后使其貼壁，在培養(yǎng)1～7 d之后分別檢測其細(xì)胞活性。每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，孵育4 h，吸去上清，加入100 μl DMSO，振蕩后，酶標(biāo)儀檢測吸光度值(A490)，記錄結(jié)果，并繪制生長曲線。

1.2.4 MTT檢測細(xì)胞增殖活性 取第3代對數(shù)生長期的hPDLCs，接種至96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，加入不同處理的培養(yǎng)基，各濃度設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，分為對照組、LPS組、LPS(10 μg/ml)+RES組(0、 30、 60、 90 μmol/L)，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h，棄上清液，加入100 μl DMSO，振蕩并檢測吸光度值(A490)。

1.2.5 ELISA檢測細(xì)胞TNF-α/IL-6分泌水平 取第4代對數(shù)生長期的hPDLCs，接種于24 孔培養(yǎng)板，按上述分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書檢測各組中TNF-α和IL-6的水平。

1.2.6 PCR檢測TLR4/NF-κB mRNA表達(dá) 取第4代對數(shù)生長期的hPDLCs，接種于6孔培養(yǎng)板，按上述分組處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并檢測其純度以及完整性。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，并進(jìn)行PCR檢測，2%～3%瓊脂糖凝膠上電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.7 Western blot檢測TLR4/NF-κB蛋白表達(dá) 選取第4代對數(shù)生長期細(xì)胞，參照上述實(shí)驗(yàn)處理細(xì)胞，24 h后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TLR4 (1∶500)、NF-κB p65 (1∶400)、β-actin (1∶1 000)等一抗， 4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3 次，二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3 次，暗室曝光和壓片等步驟，檢測TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hPDLCs原代培養(yǎng)及鑒定

組織塊法培養(yǎng)5～8 d之后可見細(xì)胞游出，hPDLCs原代細(xì)胞呈現(xiàn)星形或長梭形，胞突細(xì)長，胞體豐滿，核為圓形或橢圓形，傳代培養(yǎng)后細(xì)胞生長迅速(圖 1A)。將第3 代hPDLCs細(xì)胞在96 孔板中培養(yǎng)1～7 d， MTT法檢測其在4～5 d細(xì)胞快速增殖，并在第7 天后速度開始減緩，其生長曲線呈“S”形(圖 1B)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定表明，抗波絲蛋白染色呈陽性(圖1C)，抗角蛋白染色呈陰性(圖 1D)，證明細(xì)胞來源于中胚層，且無上皮來源細(xì)胞混雜。

2.2 RES抑制LPS誘導(dǎo)的hPDLCs活性降低

與對照組比較，LPS處理下，hPDLCs細(xì)胞活性明顯降低。而隨著RES濃度增加，細(xì)胞活性逐漸增強(qiáng)(Plt;0.05)(圖 2)。

A: 第4 代細(xì)胞形態(tài)(×200)； B: 生長曲線; C: 波絲蛋白表達(dá)(×100)； D: 角蛋白表達(dá)(×100)

圖 2 LPS和不同濃度RES對細(xì)胞增殖活性的影響

Fig 2 Proliferation of hPDLCs treated by LPS and RES(#:vscontrol,Plt;0.05; *vsLPS group,Plt;0.05)

2.3 RES抑制LPS誘導(dǎo)的hPDLCs TNF-α/IL-6分泌增加

ELISA結(jié)果顯示，LPS明顯促進(jìn)細(xì)胞炎性因子TNF-α和IL-6分泌，而RES對hPDLCs細(xì)胞TNF-α/IL-6分泌具有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴效應(yīng)(Plt;0.05)(圖 3)。

圖 3 LPS和RES對細(xì)胞TNF-α/IL-6分泌水平的影響

Fig 3 TNF-α and IL-6 levels of hPDLCs treated by LPS and RES(#:vscontrol,Plt;0.05; *:vsLPS group,Plt;0.05)

圖 4 LPS和RES對細(xì)胞TLR4/NF-κB mRNA表達(dá)的影響

Fig 4 TLR4/NF-κB mRNA expression of hPDLCs treated by LPS and RES(#:vscontrol,Plt;0.05; *:vsLPS group,Plt;0.05)

2.4 RES抑制LPS誘導(dǎo)的hPDLCs中TLR4/NF-κB表達(dá)上調(diào)

PCR結(jié)果顯示，引物特異性良好。LPS作用下，細(xì)胞TLR4與NF-κB mRNA水平均明顯增加，而不同濃度RES預(yù)處理下，TLR4與NF-κB mRNA的水平均顯著降低(Plt;0.05)(圖 4～5)。

Western blot結(jié)果顯示，LPS作用下，細(xì)胞TLR4與NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高(Plt;0.01)，而不同濃度RES預(yù)處理下，TLR4和NF-κB p65蛋白的表達(dá)均顯著下降，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(Plt;0.05)。

圖 5 LPS和RES對細(xì)胞TLR4/NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

Fig 5 TLR4/NF-κB expression of hPDLCs treated by LPS and RES(#:vscontrol,Plt;0.05; *:vsLPS group,Plt;0.05)

3 討 論

LPS作為革蘭陰性厭氧菌中的一種致病物質(zhì)，對牙周組織細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒性作用[3]，被認(rèn)為是牙周炎癥的重要病因之一。研究表明，LPS對hPDLCs具有細(xì)胞毒性作用。本研究顯示，LPS作用下，hPDLCs活性明顯下降。

RES是一種多酚類化合物，作為腫瘤的化學(xué)預(yù)防劑，它也是預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病的活性物質(zhì)。近年來，國內(nèi)外關(guān)于白藜蘆醇在一些疾病中抗炎活性也有報(bào)道[4-5]。有研究顯示，RES(50 μmol/L)時(shí)能促進(jìn)人軟骨細(xì)胞的增殖[4]。本研究表明，在LPS誘導(dǎo)損傷的hPDLCs中加入RES處理后，其細(xì)胞活性明顯增加，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

研究表明，TLR4是模式識(shí)別受體的一種，在機(jī)體免疫與炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能激活細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路[6]。NF-κB作為TLR4信號(hào)通路的下游因子，調(diào)控著多種細(xì)胞因子的表達(dá)，在炎癥損傷和細(xì)胞再生方面均有重要作用[7]。TLR4下游因子NF-κB被激活之后，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6的釋放[8]。TNF-α是促進(jìn)牙周炎發(fā)生的重要炎性因子，它能限制牙周組織的修復(fù)[9]。研究表明，在牙周膜細(xì)胞中，RES有效抑制了損傷細(xì)胞中炎性因子IL-1β，IL-6和TNF-α的表達(dá)[10]。本研究顯示，RES可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α與IL-6水平升高。

Murakami等[11]研究表明，RES有較強(qiáng)的抗自由基活性，并能抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NF-κB的活化。臨床研究顯示，慢性牙周炎患者的牙齦組織中TLR4的表達(dá)高于健康人[12]，這提示我們TLR4/NF-κB通路可能與牙周炎癥密切相關(guān)。本研究亦證實(shí)，RES可顯著降低LPS誘導(dǎo)的hPDLCs TLR4/NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)。

綜上所述，本文通過LPS和不同濃度RES作用，檢測了hPDLCs增殖活性，炎性因子TNF-α/IL-6的分泌和TLR4/NF-κB的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過抑制TLR4/NF-κB活化減輕LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞損傷。此外，牙周膜細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)是受很多機(jī)制調(diào)控的，多條信號(hào)通路都可能參與其中，各信號(hào)通路之間還可能存在相互作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，TLR4/NF-κB 信號(hào)通路參與了白藜蘆醇抑制脂多糖誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的過程，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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(收稿： 2016-06-04 修回： 2016-10-19)

ResveratrolattenuatesLPS-inducedcellinjuryandTLR4/NF-κBactivationinhumanperiodontalligamentcells

HUHaiyan,LIUCaihong.

716000,RepairDepartmentofStomatology,YananUniversityAffiliatedHosptial,China

Objective: To investigate the protective effect of resveratrol on lipopolysaccharide (LPS)-induced cell injury in human periodontal ligament cells(hPDLCs).MethodshPDLCs were cultured and identified. The cultured hPDLCs were divided into 5 groups: control group and LPS(10 μg/ml)+RES(0/30, 60 and 90 μmol/L respectively) groups. The cell proliferation was detected by MTT assay. The secretion of TNF-α and IL-6 of hPDLCs was detected by ELISA kit. The expression of TLR4/NF-κB mRNA and protein was determined by PCR and Western blot analyses, respectively.ResultsThe cultured cells were negative for cytokeratin and positive for vimentin staining. Compared with the control group, cell proliferation was decreased, the secretion of TNF-α/IL-6 levels and the expression of TLR4/NF-κB mRNA and protein were increased after treatment with LPS. Whereas, with 30-90 μmol/L resveratrol pretreatment, the proliferation ability of hPDLCs was enhanced(Plt;0.05), the secretion levels of TNF-α and IL-6 and the expression of TLR4/ NF-κB mRNA and protein were reduced(Plt;0.01) in a dose-dependent manner.ConclusionResveratrol may attenuate LPS-induced cell injury by inhibiting TLR4/NF-κB pathway in hPDLCs.

Resveratrol；LPS;Humanperiodontalligamentcells(hPDLCs);TLR4;NF-κB

716000， 延安大學(xué)附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科

呼海燕 E-mail: shidasda@163.com

R781.4, R282.71

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.019