一個可區(qū)分銀鯽F系和A+系BAC序列的特征、染色體定位和SCAR標記篩選

洪 瑋 李熙銀 周 莉 汪 洋 李 志 桂建芳

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

一個可區(qū)分銀鯽F系和A+系BAC序列的特征、染色體定位和SCAR標記篩選

洪 瑋1,2李熙銀1周 莉1汪 洋1李 志1桂建芳1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

為了揭示F系和A+系的遺傳差異以及解析F系的遺傳特征, 研究基于前期基因組Survey分析發(fā)現(xiàn)一個特異于銀鯽F系大小為782 bp片段的基礎, 首先采用混合池篩選方法從銀鯽F系BAC文庫中篩選出一個包含該特異片段的BAC克隆(F782-BAC)。鳥槍法測序結果表明, F782-BAC序列全長大小為172625 bp, 富含轉座子序列, 包含1個具備完整結構的Tc1-like轉座子, 以及不具備完整結構的transposase-like、PIF/Harbinger、target-primed reversed transcription(TPRT) 和transponX-element等6個轉座子。用地高辛標記F782-BAC質粒得到的DNA探針進行了銀鯽F和A+系有絲分裂中期相的染色體熒光原位雜交, 結果表明不論是在F系還是A+系的有絲分裂中期相中, 3個陽性熒光信號皆清晰地定位于3條大小相同的近端著絲粒染色體短臂的近著絲粒位置。進一步開展了銀鯽A+系相應同源的F782-BAC序列的差異鑒定和序列分析, 揭示A+系缺失了大小為3395 bp的一段序列, 且特異于銀鯽F系大小為782 bp的片段正好位于其中, 并由此篩選出可作為區(qū)分銀鯽F系和A+系的SCAR標記。研究為銀鯽的多倍化起源提供了進一步的染色體定位證據(jù), 鑒定的SCAR標記可為銀鯽分子標記輔助育種提供新的遺傳標記。

多倍體銀鯽; 轉座子;Tc1-like; BAC; SCAR標記

多倍體銀鯽通常被視為鯽(Carassius auratusL.)的一個亞種 (Carassius auratus gibelioBloch)[1],然而, 隨著研究的深入, 已逐漸被視為一個獨立的物種(Carassius gibelioBloch)[2—5]。銀鯽不同于其他的單性脊椎動物, 在其自然群體中均發(fā)現(xiàn)有雄性個體存在[7—9], 且擁有單性雌核生殖和有性生殖等多重生殖方式[1,2,6]。最近的研究表明, 銀鯽D系卵子與異種紅鯉雄魚的精子受精時行單性雌核生殖,當與同一克隆雄魚的精子受精時行有性生殖, 而當與不同克隆的雄魚精子受精時行類雜種生殖[2]。銀鯽廣泛分布于亞歐大陸, 擁有超過156條染色體[10],在經(jīng)歷了連續(xù)的兩輪多倍化歷程后[11], 目前正處在二倍化進程之中, 且生殖方式也正在由單性雌核生殖向兩性有性生殖轉變[2,3]。在二倍化過程中, 多倍體物種的基因組會發(fā)生缺失、復制和重組等巨大變化[12,13], 而在生物進化過程中, 這些染色體重排事件通常是轉座子(Transposon)活動的結果[14]。因此在多倍體銀鯽中進行轉座子的相關研究可理解其基因組進化的內在驅動機制。

我國主養(yǎng)品種異育銀鯽“中科3號”(A+系)是銀鯽A系的精子在銀鯽D系的卵質中通過雄核生殖產(chǎn)生的一個新的銀鯽核質雜種克隆[15,16]。銀鯽F系是由銀鯽E系的卵子與團頭魴(Megaloabrama AmblycephalaYin)的精子經(jīng)過冷休克處理, 行雌核生殖而來, 并表現(xiàn)出類似團頭魴的隆背性狀[17]。染色體熒光原位雜交實驗表明, 銀鯽F系除了含有母本E系的156條染色體之外, 還含有來自團頭魴的微小染色體片段[17], 是一個具有潛力的育種新品系。為了揭示F系和A+系的遺傳差異以及解析F系的遺傳特征,在前期的研究中, 我們對F系和A+系分別進行了基因組Survey分析, 并通過基因組Soap分析獲得了2個品系之間的差異序列。在本研究中, 我們選取了一個存在于銀鯽F系而不存在于A+系、大小為782 bp的差異片段進行分析。我們首先采用混合池篩選方法從銀鯽F系BAC文庫中篩選了含有該差異片段的一個BAC克隆, 并對該BAC克隆進行了鳥槍法序列測定和生物信息學分析。結果表明, 該BAC克隆富含轉座子序列, 其上有一個具有完整結構的轉座子Tc1-like (Cg-Tc1-like轉座子)。接著以地高辛標記的F782-BAC質粒DNA為探針進行染色體熒光原位雜交, 發(fā)現(xiàn)該序列都定位在銀鯽F系和A+系中3個相同大小近端部著絲粒染色體的短臂上。最后根據(jù)F782-BAC的序列設計引物, 經(jīng)比較分析篩選獲得了2個可用于區(qū)分銀鯽F系和A+系的SCAR分子標記。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

銀鯽F系[17]和A+系[15]來自中國科學院水生生物研究所官橋實驗基地。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴增

取銀鯽F系和A+系的魚鰭提取其基因組DNA,使用Wizard?Genomic DNA Purification Kit(Promege公司)試劑盒?；蚪M提取和PCR擴增方法參照Dan等[18]和Zhu等[19], 引物序列見表1。

1.3 BAC克隆的篩選及提取

采用混合池篩選方法篩選包含特異片段F782的BAC克隆。對于384孔板的篩選, 我們首先構建16個行池和24個列池, 然后利用特異的引物對這16個行池和24個列池進行PCR篩選, 陽性行池和陽性列池的交叉點即為陽性克隆所在[20]。對陽性BAC克隆劃線后挑取單克隆, PCR驗證后對其進行擴大培養(yǎng)并提取BAC質粒。BAC質粒提取使用PureLink?HiPure Plasmid DNA Purefication Kits(Invitrogen公司)試劑盒, 具體過程參照說明書。

1.4 BAC克隆序列分析

BAC克隆在華大基因公司利用鳥槍法進行完全測序。利用GENESCAN (http://www.eurofins.de/food-analysis/laboratories/eurofins-genescan.aspx)等軟件對BAC序列進行基因預測; 通過Repeat-Masker (http://www.repeatmasker.org/)在線利用Repbase重復序列數(shù)據(jù)庫對BAC上的已知重復序列進行對比分析。將通過RepeatMasker預測出的已知重復序列提出后, 剩余的序列與BAC克隆序列本身進行對比, 進一步找出更多的未知重復序列。

表1 實驗所用的引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.5 轉座子序列及結構分析

利用GENESCAN (http://www.eurofins.de/foodanalysis/laboratories/eurofins-genescan.aspx)預測BAC序列上Cg-Tc1-like轉座酶的開放閱讀框, 隨后利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)確定Cg-Tc1-like的DD(34)E結構域, 之后利用DNAMAN軟件對比得到轉座子兩端的反向重復序列以及TA靶位點重復, 最終確定Cg-Tc1-like轉座子的核苷酸全長序列。

1.6 染色體的制備及染色體熒光原位雜交(FISH)

銀鯽F系和A+系中期染色體的制備方法參考之前的報道[3,11]。利用DIG-Nick Translation Mix試劑盒(Roche公司)制備BAC質粒DNA熒光探針[3,11]。染色體熒光原位雜交的具體步驟參考文獻。

1.7 DNA的回收與測序

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠檢測后, 使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(OMEGA公司)回收特異性目的條帶, 回收方法參照說明書。將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T Vector (TaKaRa公司)上, 16℃連接3h。轉入DH5α感受態(tài)大腸桿菌中, 用含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后, PCR篩選陽性克隆送鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。

2 結果

2.1 銀鯽F系特異片段F782的鑒定

根據(jù)差異片段F782的序列, 設計特異引物, 分別在銀鯽F系和A+系各5尾個體中進行PCR擴增, 結果表明, 與基因組Survery分析結果一致, 該引物只能從銀鯽F系5尾個體中擴增出大小為782 bp的特異片段, 而不能從A+系5尾個體中擴增出相應片段(圖1)。

2.2 銀鯽F系含有F782片段的BAC克隆篩選及其序列特征

采用混合池篩選的方法對銀鯽F系BAC文庫進行了篩選, 結果表明, 在第16號384孔板的第L行和第23列交叉孔對應的BAC克隆包含了差異片段F782。鳥槍法測序表明, 該F782-BAC克隆全長大小為172625 bp; GENESCAN預測結果顯示, F782-BAC克隆序列包含有7個轉座子, 其大小和方向如圖2A所示, 它們依次排布為target-primed reversed transcription轉座子(TPRT)、Cg-Tc1-like轉座子、transposase-like轉座子、PIF/Harbinger轉座子、transpon X-element轉座子、PIF/Harbinger轉座子和target-primed reversed transcription轉座子TPRT。其中Cg-Tc1-like、transposase-like和PIF/Harbinger轉座子屬于DNA轉座子(Ⅱ類轉座子), 通過“剪切-粘貼”的方式來進行轉座[21,22];TPRT和transpon X-element轉座子為反轉錄轉座子(Ⅰ類轉座子), 通過“復制-粘貼”的方式來進行轉座[21, 22]。

圖1 差異片段F782在銀鯽A+系和F系中擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram of fragment F782 in strain A+ and strain F of gibel carp (M. DL2000 DNA marker)

圖2 F782-BAC序列的轉座子預測和重復序列分析Fig. 2 Prediction of transposons and repeated sequences in F782-BAC sequence

此外, Repeat Masker軟件分析表明, 在F782-BAC序列中有28.9%序列是與轉座子有關的重復序列, 其中DNA轉座子中的重復序列占F782-BAC序列全長的4.1%, 反轉錄轉座子中的短散在元件(Short interspersed elements, SINEs)、長散在元件(Long interspersed elememts, LINEs)和長末端重復反轉座子(Long terminal repeat retrotransposons,LTRs)分別占F782-BAC序列全長的 0.3%、15.1%和 9.4%。除去與轉座子相關的重復序列外, 還有1.4%的簡單重復序列, 0.2%的低復雜性區(qū)段和15.6%的未知重復序列(圖2B)。

進一步分析發(fā)現(xiàn), 在所預測出的7個轉座子中,transposase-like轉座子、PIF/Harbinger轉座子和transpon X-element轉座子缺失了轉座酶開放閱讀框(Open reading frame, ORF), 兩個TPRT轉座子均只含有1個ORF2結構, 而完整的TPRT轉座子應同時含有2個ORF結構(ORF1和ORF2), 這2個TPRT轉座子也無轉錄活性; 只有Cg-Tc1-like轉座子具有完整的結構, 具有潛在轉錄活性。Cg-Tc1-like大小為1633 bp, 兩端各有一段反向重復序列(Inverted terminal repeats, ITRs)以及一個TA靶位點重復(TA target site duplication, TSD), 其中5′端ITR3長度為225 bp, 3′端ITR3長度為211 bp。Cg-Tc1-like轉座子不含內含子, 其ORF長度為996 bp, 編碼大小為331個氨基酸的轉座酶。轉座子序列第768到第1148個堿基編碼一個完整的DD (34)E結構域。DD(34)E結構域含有2個天冬氨酸殘基(D, D), 在距離第2個天冬氨酸殘基的第34個氨基酸處有一個谷氨酸殘基(E)[23]。DD (34)E結構域是Tc1-like轉座子作用的重要位點, 它在轉座子進行“剪切”時催化DNA鏈在特異位點的裂解與斷裂。

2.3 F782-BAC序列在銀鯽中染色體的定位

利用地高辛標記的F782-BAC質粒DNA, 分別對銀鯽F和A+系有絲分裂中期相的染色體進行熒光原位雜交。如圖3所示, 在銀鯽F和A+系的有絲分裂中期相中, 3個陽性熒光信號皆清晰地定位于3條相同大小近端著絲粒染色體短臂的近著絲粒位置(圖3), 這表明銀鯽在其基因組或整套染色體組中的同源染色體有3個, 且F782-BAC序列在銀鯽F和A+系存在同源序列。

2.4 銀鯽A+系同源的F782-BAC序列的差異鑒定以及區(qū)分F系和A+系SCAR標記的篩選

為了揭示銀鯽A+系同源的F782-BAC序列的差異, 我們首先根據(jù)F系F782-BAC序列設計了10對特異性引物(圖4A), 分別在銀鯽F和A+系中進行PCR擴增。如圖4B所示, 這10對引物均能在銀鯽F系中特異地擴增出目標大小的片段; 而在銀鯽A+系中, 除F782片段與前述不能擴增出相應片段(圖1)外, 在其上下游還各有一對引物不能擴增出片段(第Ⅱ和第Ⅳ片段), 其余7對引物均能擴增出相應的目的片段。接著, 我們在第Ⅰ個和第Ⅱ個片段之間(30122—30144 bp)以及第Ⅳ和第Ⅴ個片段之間(34713—34733 bp)設計了一對引物, 分別在銀鯽F系和A+系的5尾個體中進行PCR擴增, 結果表明,在銀鯽F系5尾個體中均擴增出一條大小約4600 bp的DNA片段, 而在銀鯽A+系的5個個體中均擴增出一條大小約為1200 bp的DNA片段(圖5C)。將回收的這2個大小不同的片段分別進行測序表明, 與F系相比, A+系缺失了大小為3395 bp的一段序列(圖4D), 特異于銀鯽F系大小為782 bp的片段正好位于其中。因此, 這對引物和前面用于擴增F782序列的引物都可作為區(qū)分銀鯽F系和A+系的SCAR標記。

圖3 地高辛標記的F782-BAC序列探針在銀鯽有絲分裂中期相的熒光原位雜交Fig. 3 Fluorescence in situ hybridization of the DIG-labeled F782-BAC sequence on mitotic metaphases of gibel carp

圖4 F782-BAC序列在銀鯽F系和A+系中的差異呈現(xiàn)Fig. 4 Differential screening of F782-BAC sequence between strain F and strain A+ of gibel carp

3 討論

多倍體銀鯽在其天然種群中存在著豐富的克隆多樣性, 這些不同的克隆在形態(tài)學表型和遺傳組成上都存在著顯著的差異[1]。在前期研究中, 我們已經(jīng)建立了血清轉鐵蛋白表型[24]、RAPD和SCAR標記[25,26]、微衛(wèi)星DNA標記[27]、轉鐵蛋白等位基因多態(tài)性[26—28]以及mtDNA控制區(qū)序列[28]等多種遺傳標記, 從我國銀鯽天然種群中連續(xù)鑒別出眾多不同的克隆, 并利用細胞工程育種技術和遺傳標記輔助育種技術連續(xù)培育出三代異育銀鯽品種, 推動了我國鯽魚養(yǎng)殖業(yè)的快速持續(xù)發(fā)展[1]。為了揭示一個具有育種潛力的銀鯽品系F系與主養(yǎng)品種“中科3號”的遺傳差異以及解析F系的遺傳特征, 本研究從基因組Survery分析獲得的2個品系之間的差異序列中, 選取了一個存在于銀鯽F系而不存在于A+系的差異片段進行分析, 經(jīng)系列比較研究, 篩選獲得了可用于區(qū)分銀鯽F系和A+系的SCAR標記。

在魚類的進化歷程中, 多倍化是一個重要的且頻繁發(fā)生的現(xiàn)象, 對其進化具有重要意義[19]。多倍化為基因功能的歧化和功能創(chuàng)新提供了原始材料[29], 增加了物種的適應性, 促進了物種的分化[30],是一種重要的進化動力[1]。相對于二倍化的四倍體鯉科魚類, 銀鯽被認為具有更高的倍性, 是一個正在二倍化的六倍體[1]。與銀鯽5S rDNA染色體定位和單個染色體的描繪結果相同[18], F782-BAC克隆的信號位于3個相同大小的近端部著絲粒染色體上,而且它們的位置一致, 都是位于短臂的近著絲粒區(qū)域(圖4)。上述的結果表明銀鯽在其基因組或整套染色體組中的同源染色體為3個。對鯉魚全基因組序列的解析證實了其異源四倍體特征和獨特的全基因組復制事件[31]。本實驗室對兩個歧化的銀鯽Dmrt1基因的染色體定位及系統(tǒng)發(fā)生分析, 揭示了銀鯽的兩輪多倍化起源歷程。大約在1849萬年前,一次早期的多倍化形成了銀鯽、鯽和鯉的共同四倍體祖先; 隨后大約在51萬年前, 在鯽這個分支上發(fā)生了另一次近期的多倍化事件, 形成了現(xiàn)在的六倍體銀鯽[11]。銀鯽可能與鯉類似, 存在著兩套不同來源的染色體組, 這兩套染色體組之間雖然有一定的同源性, 但仍有十分明顯的序列差異[11]。因此,當以單個染色體的進行描繪[21]或以F782-BAC克隆序列為探針進行染色體熒光原位雜交實驗時, 只檢測到3個熒光信號。

F782-BAC克隆序列上富含轉座子序列(圖2)。轉座子是一類可以在基因組上及基因組之間移動的具有一定重復性的DNA片段[32,33]。根據(jù)轉座機制, 轉座子可分為DNA轉座子和反轉錄轉座子兩類[34]。目前, 在真核生物基因組中, 已發(fā)現(xiàn)至少17個DNA轉座子超家族[35]。轉座子能夠導致剪切位點的缺失, 插入位點特異序列的擴增[14,35,36], 最終增加等位基因的遺傳多態(tài)性[37], 改變基因功能,甚至會產(chǎn)生新的基因或者使基因功能喪失[12]。轉座子在移動過程中, 有時會造成剪切位點染色體斷裂, 引起染色體重排[14,35,36]。轉座子的活動能加速物種的進化速率, 被視為生物基因組進化的內在驅動[38]。銀鯽目前正處在近期多倍化之后的二倍化過程之中, 且生殖方式也正在由雌核生殖向兩性生殖轉變[2,3]。在二倍化過程中, 多倍體物種的基因組會發(fā)生染色體缺失、復制和重組等巨大的變化[12,13], 而這些染色體重排現(xiàn)象通常是轉座子活動的結果[14]。F782-BAC序列上含有豐富的轉座子序列, 而與F系相比, A+系缺失了該克隆上一段大小為3393 bp的片段, 該缺失片段可能與轉座子的活動相關聯(lián)。Tc1-like轉座子在硬骨魚類基因組中占有很高的比例。在鯉中,Tc1-like轉座子約占到基因組比例的近1.7%, 僅次于hAT轉座子超家族(約2.3%)[31,39]。因此, 全面和深入地分析銀鯽的轉座子有助于我們了解銀鯽復雜基因組的組成和基因組進化的內在驅動機制。

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CHARACTERIZATION, CHROMOSOME LOCALIZATION, AND SCAR MARKER SCREENING OF A BAC SEQUENCE FOR DISCRIMINATING STRAIN F FROM STRAIN A+IN GIBEL CARP

HONG Wei1,2, LI Xi-Yin1, ZHOU Li1, WANG Yang1, LI Zhi1and GUI Jian-Fang1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Gibel carp (Carassius gibelioBloch) has been widely used for basic and applied studies on developmental genetics and genetic engineering because of the polyploid background and multiple reproduction modes. In this study,we isolated a positive BAC clone with the fragment (F782-BAC) from a BAC library of F strain based on a 782 bp fragment (F782) specific to F strain revealed by comparative genome surveys between F and A+strains. Shotgun sequencing revealed the complete sequence of the F782-BAC that is composed of 172625 bp containing a completeTc1-like transposon and six incomplete transposons such astransposase-like transposon,PIF/Harbingertransposon, targetprimed reversed transcription (TPRT) transposon, and transponX-elementtransposon. Using the DIG-labeled F782-BAC sequence as a probe, three positive green fluorescence signals were clearly detected on short arms of three homologous acrocentric chromosomes in mitotic metaphases of both F and A+strains. Moreover, differential screening and sequence analysis of the homologus F782-BAC sequence were performed on the A+strain, and a deleted fragment of 3395 bp was identified in the corresponding F782-BAC sequence of A+strain, in which includes the F strain-specific fragment F782. Furthermore, we developed valuable SCAR markers for discriminating strain F from strain A+in gibel carp. Therefore, the current data provide genetic evidence for polyploidy origin in gibel carp and the identified SCAR markers for the marker-assisted selective breeding in gibel carp.

Polyploid gibel carp; Transposon;Tc1-like; BAC; SCAR marker

Q344+.1

A

1000-3207(2017)06-1169-08

10.7541/2017.145

2016-04-20;

2017-01-17

中國科學院戰(zhàn)略性先導專項(XDA08030201); 現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(NYCYTX-49)資助 [Supported by the Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDA08030201); Modern Agro-industry Technology Research System(NYCYTX-49)]

洪瑋(1992—), 女, 江西南昌人; 碩士研究生; 主要從事發(fā)育遺傳學研究。E-mail: 353849317@qq.com

桂建芳, E-mail: jfgui@ihb.ac.cn