藺凌云 尹文林 潘曉藝 袁雪梅 姚嘉赟 徐 洋 王 超 沈錦玉

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313001)

自然微生物掛膜處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的效果及微生物群落分析

藺凌云 尹文林 潘曉藝 袁雪梅 姚嘉赟 徐 洋 王 超 沈錦玉

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313001)

以彈性填料和流化床填料為硝化反應(yīng)的生物掛膜材料, 聚羥基丁酸/戊酸共聚酯(PHBV)為反硝化反應(yīng)的碳源和生物膜載體, 通過微生物自然掛膜處理低C/N比水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水, 去除水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮及總氮。應(yīng)用Miseq高通量測序技術(shù)對生物膜的微生物群落組成和結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明: 溫度25—30℃, 該處理系統(tǒng)首次掛膜成功需要4周, 啟動后運行穩(wěn)定, 對2種不同來源和氮污染程度的養(yǎng)殖廢水均有較好的脫氮效果, 氨氮、亞硝酸鹽氮及總氮的去除率均在90%以上。硝化生物膜(a)的優(yōu)勢菌分別歸屬變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。反硝化生物膜(b)微生物群落的多樣性指數(shù)和豐度指數(shù)均遠大于前者, 主要為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門(Spirochaetae)及綠菌門(Chlorobi)。其中, 歸屬于變形菌門β-變形菌綱(Betaproteobacteria)的叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)和紅環(huán)菌科(Rhodocyclaceae)在2種生物膜中占比均較高。由于所處環(huán)境(載體, 碳源、溶氧等)不同, 在屬分類水平上,2種生物膜的細菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯差異。生物膜a中屬的種類僅為b的三分之二, 相對豐度＞0.5%的優(yōu)勢菌屬, a為8個, b為18個。其中, 隸屬叢毛單胞菌科和紅環(huán)菌科未知屬的優(yōu)勢種群分別占到a、b總序列數(shù)的56.67%和45.51%。磁螺菌屬(Magnetospirillum)和硝化螺菌屬(Nitrospira)是a中特有的優(yōu)勢功能菌群, 梭菌屬(Clostridium)、動膠菌屬(Zoogloea)、管道桿菌屬(Cloacibacterium)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)等具有反硝化功能的菌群為b的優(yōu)勢菌屬。

生物填料; PHBV; 養(yǎng)殖廢水; 生物膜; 微生物群落

隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 氮污染物的大量排放對人體健康及周圍的水域環(huán)境都產(chǎn)生了較大的危害。因此, 養(yǎng)殖廢水的脫氮處理受到廣泛關(guān)注。生物脫氮法相比物理化學(xué)法, 具有費用低、不易產(chǎn)生二次污染、不破壞養(yǎng)殖生態(tài)平衡等優(yōu)點, 是養(yǎng)殖廢水處理及循環(huán)養(yǎng)殖中去除氮素污染最有效的方法之一。目前, 以傳統(tǒng)硝化/反硝化為核心的生物脫氮工藝已經(jīng)在水處理工程中廣泛應(yīng)用[1,2]。然而, 水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中碳氮比(C/N, C以COD計)普遍較低, 特別是溫室甲魚養(yǎng)殖廢水, 70%以上的水樣C/N比小于2[3]。實現(xiàn)完全反硝化脫氮的理論C/N比值為2.86 kg COD/kg N, 結(jié)合微生物的生長, 實際所需值通常為4.2 kg COD/kg N[4]。有研究表明, 當COD/TN小于5時, 氮素的去除效率將明顯降低[5]。因此, 針對低C/N比的廢水, 一般需要外加碳源以保證其高效的脫氮效果。甲醇、乙醇、乙酸、葡萄糖是最常用的碳源[6—9], 不僅需要經(jīng)常添加, 而且容易出現(xiàn)投加不足或者過量, 為系統(tǒng)的穩(wěn)定運行及維護帶來不小的麻煩。因此人們傾向于使用固相碳源, 盡管天然固相碳源物質(zhì), 如秸稈、樹皮、蘆葦、棉纖維、貝殼等價格低廉, 但這些物質(zhì)降解產(chǎn)生大量的氨, 且容易導(dǎo)致出水顏色加深[10—14]。與此同時, 可生物降解的高分子固相碳源, 如聚羥基脂肪酸酯(PHAs)、聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚β-羥基丁酸/戊酸酯共聚物(PHBV)等以其操作方便易于維護、效果穩(wěn)定, 無二次污染等優(yōu)勢備受青睞[15—18]。

有研究證明, 增加硝化細菌的數(shù)量或延長水力停留時間是加快硝化反應(yīng)的重要措施之一。目前主要通過添加填料的方法, 使硝化細菌附著于填料表面, 以促進其富集生長。沸石顆粒、活性炭、彈性填料、聚乙烯小球等都成功用作硝化細菌的掛膜材料[20], 填料的添加不僅加快了系統(tǒng)的啟動, 同時極大地提高了脫氮性能。

生物脫氮是通過生物膜中微生物的代謝活動來實現(xiàn)的, 微生物群落的結(jié)構(gòu)及多樣性與脫氮效果有直接關(guān)系[20]。研究發(fā)現(xiàn), 不同處理系統(tǒng)和不同的運行參數(shù)都會造成微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著差異。金浩等[21]對污水處理活性污泥的細菌群落進行了分析, 變形菌門占細菌總數(shù)的91.9%, 其他優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、硝化螺菌門(Nitrospirae)和綠彎菌門(Chloroflexi), 其中明顯的優(yōu)勢菌群為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)。Ma等[22]利用高通量測序技術(shù)考察了9個焦化廢水處理廠的微生物群落特征, 結(jié)果表明, 硫桿菌屬(Thiobacillus)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、索氏菌屬(Thauera)、固氮彎曲菌屬(Azoarcus)及紅游動菌屬(Rhodoplanes)是至少6個處理廠的優(yōu)勢菌屬。而其他出現(xiàn)在城市生活污水處理廠的核心菌屬, 如動膠菌屬(Zoogloea), 突柄桿菌屬(Prosthecobacter)等在焦化廢水處理反應(yīng)器中占比很低。徐影等[23]的研究發(fā)現(xiàn), 固體碳源表面生物膜中的主要微生物均為革蘭氏陰性, 包括有益桿菌屬(Diaphorobacter)、食酸菌屬(Acidovorax)、紅長命菌屬(Rubrivivax)、固氮螺形菌屬(Azospira)、熱單胞菌屬(Thermomonas)和德沃斯氏菌屬(Devosia), 它們分別屬于變形菌門的α-, β-和γ-變形菌綱, 其中有益桿菌屬為反應(yīng)器穩(wěn)定運行期生物膜中豐度最高的菌群。

目前, 國內(nèi)外已有很多關(guān)于生物膜微生物群落的研究, 特別是利用固相碳源為載體的反硝化處理中。研究的方法既有純培養(yǎng)技術(shù)[24], 又有分子生態(tài)學(xué)技術(shù), 如16S rRNA文庫序列分析[21,25]、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)[26]、變性梯度凝膠電泳(PCRDGGE)[23], 高通量測序等[27]。其中高通量測序技術(shù)以其高分辨率、高速、分析結(jié)果準確等特點, 被廣泛應(yīng)用于污水處理、土壤及人類腸道等各種環(huán)境樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究[27—30]。

本試驗采用生物膜法, 以彈性填料及流化床填料為硝化掛膜材料, 以PHBV同時作為反硝化碳源和生物膜載體, 對養(yǎng)殖廢水的脫氮效果進行了研究。試驗裝置分為硝化和反硝化兩個功能區(qū), 使養(yǎng)殖廢水的硝化及反硝化在同一系統(tǒng)中得以高效進行。硝化功能區(qū)持續(xù)曝氣, 為硝化細菌的富集和代謝提供充足的氧氣; 反硝化功能區(qū)保持微溶氧環(huán)境以利于反硝化細菌的生長及脫氮。并利用Miseq高通量測序技術(shù)對掛膜成熟階段生物膜微生物的組成和群落結(jié)構(gòu)及多樣性進行分析, 以期為脫氮機理的研究、微生態(tài)制劑的研發(fā)及掛膜材料的優(yōu)選等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

硝化掛膜材料: 彈性填料(單元直徑15 cm, 中心一根尼龍繩, 周圍呈毛刷狀, 圖1a1)和流化床填料(為聚丙烯空心填料, 內(nèi)外共有三層空心圓, 外徑2.5 cm, 圖1a2)。反硝化碳源及掛膜材料: PHBV顆粒(圓柱形, 平均高度0.32 cm, 平均截面直徑為0.31 cm, 圖1b)。

1.2 試驗裝置及運行

圖1 本試驗中使用的掛膜材料(a1-彈性填料, a2-流化床填料, b-PHBV)Fig. 1 The biofilm carriers used in this experiment (a1-elastic filler, a2-fluidized bed packing materials, b-PHBV)

圖2 養(yǎng)殖廢水處理裝置Fig. 2 The experimental set-up for aquaculture wastewater treatment

養(yǎng)殖廢水處理試驗裝置如圖2, 分為A、B兩段。A段, 又稱為硝化功能區(qū)。安裝有通氣設(shè)施,24h曝氣, 每格懸掛彈性填料1根, 流化床填料30個。B段, 又稱反硝化功能區(qū)。本區(qū)針對淡水集約化養(yǎng)殖廢水中C/N普遍較低, 不利于反硝化脫氮的情況, 特別添加了固相碳源-有機高分子聚合物PHBV 3.0 kg。PHBV分裝于小網(wǎng)袋投放至反硝化功能區(qū)。廢水經(jīng)儲水桶首先進入A段, 經(jīng)柵格上端的缺口進入下一格, 再由此格底部的開口流出, 如此流入流出, 大大增加了水流長度和水處理的作用時間。最后, 由B末端出水口的管道排到儲水桶, 再經(jīng)水泵將其抽至A段進行循環(huán)處理。設(shè)備總載水量75 L, 掛膜階段水泵調(diào)節(jié)為24h循環(huán)1次, 系統(tǒng)正啟動后為每8h循環(huán)1次。

首先, 在廢水處理裝置中注入溫室甲魚養(yǎng)殖廢水, 室溫(25—30℃)條件下進行自然微生物掛膜, 每3d更換一半的養(yǎng)殖廢水, 隔天取水樣檢測NH3-N、NO2-N、TN及pH。待出水水質(zhì)穩(wěn)定后, 標志著掛膜基本完成。此后, 系統(tǒng)正式啟動, 分別以甲魚和南美白對蝦養(yǎng)殖廢水為處理對象進行試驗。甲魚廢水處理結(jié)束, 將水排空, 自來水在系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)一次后排出, 然后在儲水桶內(nèi)加入南美白對蝦養(yǎng)殖廢水。甲魚及南美白對蝦養(yǎng)殖廢水在系統(tǒng)內(nèi)的循環(huán)時間(HRT)分別為4d和2d。

1.3 樣品采集及水質(zhì)指標分析方法

試驗運行期間, 定期(掛膜階段隔天取樣, 正式運行階段每12h取樣)從取樣口采集水樣, 水樣經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后分別對NH4-N、NO2-N、TN、pH進行測定。NH4-N和NO2-N分別采用納氏分光光度法和N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法, 參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》[31], 分光光度計采用VARIAN cary 50 Bio。TN采用HACH公司的總氮測定試劑盒, 樣品消解器HACH DRB200, 吸光度及濃度測定HACH DR2800。pH采用哈希便攜式pH/溶氧計測定。水質(zhì)數(shù)據(jù)分析及作圖采用Excel軟件。

1.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在掛膜完成后, 分別取硝化及反硝化掛膜材料,超聲波(15min, 2 kw/h, 40 kHz)分離載體表面的生物膜, 懸液離心(13000 r/min, 20min)取沉淀, 即為生物膜樣品。生物膜DNA的提取采用水樣基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱形, BioTeke)。提取的DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, 并用核酸蛋白測定儀(NanoDrop 2000)測定DNA的質(zhì)量和濃度。PCR擴增16S rRNA的V4+V5區(qū)[32], 引物序列515F: 5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′; 907R: 5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′。PCR采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase。反應(yīng)體系: 5×FastPfu Buffer 4 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL, Forward Primer (5 μmol/L) 0.8 μL, Reverse Primer(5 μmol/L) 0.8 μL, FastPfu Polymerase 0.4 μL, Template DNA 10 ng, 補充ddH2O至20 μL。PCR儀: ABI GeneAmp? 9700型。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性3min, 95℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s, 27個循環(huán), 最后72℃延伸10min。用AXYGEN凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物, 2%瓊脂糖電泳檢測, 將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司, 美國)檢測定量, 之后按照每個樣本的測序量要求, 進行相應(yīng)比例的混合,構(gòu)建基因文庫。高通量測序平臺為Illumina Miseq PE250, 測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接, 同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾, 區(qū)分樣本后進行OUT聚類分析和物種分類學(xué)分析。OUT聚類利用MOTHUR軟件(版本1.30.1), 聚類相似性為97%, 計算樣本Chao豐度指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)及測序深度指數(shù)。根據(jù)SILVA106庫中的參考序列對OUT進行分類學(xué)分析。分別在各個分類水平: domain(域)、phylum(門)、class(綱)、order(目)、family(科)、genus(屬)、species(種)統(tǒng)計各樣本的群落組成, 并應(yīng)用Excel軟件作圖對樣品的群落結(jié)構(gòu)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 自然微生物膜的形成及水質(zhì)指標變化

溫室甲魚養(yǎng)殖廢水在系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)運行約4周之后, 水體的NH4-N、NO2-N、TN及pH分別穩(wěn)定在1.0—1.4、0.05—0.07和12—15 mg/L, pH為7.4—7.6。觀察裝置內(nèi)硝化及反硝化掛膜材料的表面均有一層薄膜覆蓋。如圖3所示, 為生物膜形成階段, 養(yǎng)殖廢水NH4-N、NO2-N、TN及pH的變化。TN在第20天出現(xiàn)明顯的下降, 30d后出水TN小于15.0 mg/L。NH4-N在1—6d呈明顯下降趨勢, 7d后略有上升, 總體平穩(wěn)直至掛膜最后階段(第26天)又迅速降至1.4 mg/L以下, 前期NH4-N去除率高于后期。NO2-N則先升高后降低, 在第6天達到最大(54.2 mg/L), 并有一段時間的積累, 隨后逐漸降低,22d后降至0.7 mg/L, 并最終維持在0.05 mg/L左右。脫氮過程中, pH先降低后升高, pH最低為5.6,大約在16d后趨于穩(wěn)定, 出水pH約為7.5, 略高于進水(pH=7.2)。

2.2 自然微生物掛膜法對養(yǎng)殖廢水的脫氮效果

在掛膜完成后, 分別對甲魚和南美白對蝦養(yǎng)殖廢水進行處理, 廢水中NH4-N、NO2-N、TN及pH等指標的變化趨勢與掛膜階段相似, NH4-N和TN逐漸降低, NO2-N先增加后降低, 最終均獲得了良好的氮素去除效果。pH則先降后升, 維持在6—8。如圖4所示, 甲魚養(yǎng)殖廢水在96h后, 其NH4-N、NO2-N、TN分別由初始的48.04、1.68、128.0 mg/L將至1.20、0.05和2.0 mg/L。氨氮、亞硝氮及總氮的去除率分別為97.58%、97.02%和98.43%。如圖5所示,南美白對蝦養(yǎng)殖廢水經(jīng)過48h的凈化處理, 其NH4-N、NO2-N、TN分別有初始的2.46、1.43、12.5 mg/L將至0.36、0.02和1.20 mg/L。氨氮、亞硝氮及總氮的去除率分別為90.24%、98.60%和90.40%。

2.3 微生物多樣性和分類學(xué)分析

圖3 自然微生物掛膜階段養(yǎng)殖廢水NH4-N、NO2-N、TN及pH變化Fig. 3 Changes of aquaculture wastewater NH4-N, NO2-N, TN and pH during cultivation of biofilm

圖4 甲魚養(yǎng)殖廢水NH4-N、NO2-N、TN及pH變化Fig. 4 Changes of Chinese turtle aquaculture effluent NH4-N,NO2-N, TN and pH

圖5 南美白對蝦養(yǎng)殖廢水NH4-N、NO2-N、TN及pH變化Fig. 5 Changes of Penaeus vannmei aquaculture wastewater NH4-N, NO2-N, TN and pH

通過對兩組樣品-彈性填料及流化床填料生物膜樣品a和PHBV生物膜樣品b 16S rRNA基因文庫進行Miseq高通量測序, 經(jīng)修剪、去雜后, a與b各獲得28150和25373條優(yōu)化序列, 序列平均長度為400 bp。將優(yōu)化序列提取非重序列、去除沒有重復(fù)的序列, 抽平后, 與SILVA106庫比對進行聚類, a與b在 97%相似性下分別獲得了121和198個OTUs, 樣品的稀釋曲線如圖6所示, 可知測序數(shù)據(jù)量在20000條以上時, 曲線趨于平坦, 說明本研究測序數(shù)據(jù)量合理, 足以覆蓋樣本中絕大多數(shù)細菌。2個樣本的測序深度都大于0.99, 即樣本OTU可以有效表征樣本中細菌種群。由圖6和表1均可以看出, b樣本的細菌豐度指數(shù)及多樣性指數(shù)均高于樣本a。

圖6 樣品的稀釋曲線Fig. 6 Dilution curve of samples

表1 生物膜樣品中細菌的豐度及多樣性指數(shù)Tab. 1 Richness and diversity indexes of bio-film samples(α=0.03)

圖7 細菌群落結(jié)構(gòu)分布(分類到門)Fig. 7 Bacterial communities at phylum level

經(jīng)過物種注釋, 在門分類水平上, 生物膜樣品a、b共劃分為15個已知菌門, 占全部測序序列數(shù)的99.21%。圖7為a、b樣品在門分類水平上(＞1%)的細菌群落結(jié)構(gòu)。變形菌門是a和b中最主要的菌門,在a樣品中為93.26%, b中為65.68%。變形菌門中,β-變形菌綱是最大的優(yōu)勢菌綱, a、b中的比例分別為69.05%和57.99%。其次是α-變形菌綱(a=23.60%,b=2.59%)、γ-變形菌綱(a=0.40%, b=2.95%)、δ-變形菌綱(a=0.20%, b=2.14%)。其他優(yōu)勢菌門依次為:厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門和綠菌門。雖然這些門在2種生物膜樣品中均有鑒定, 但在b中的占比遠高于a。僅硝化螺菌門是a中特有的優(yōu)勢種群。

在科分類水平上, 2個樣品總共有88個分類單元被鑒定, 樣品a分屬63科, 其中有36個已知菌科,占全部序列數(shù)的96.32%。其優(yōu)勢菌科為叢毛單胞菌科(50.98%), 紅螺菌科(Rhodospirillaceae, 23.37%)、紅環(huán)菌科(16.26%)、黃桿菌科(Flavobacteriaceae,2.50%)、硝化螺菌科(Nitrospiraceae, 0.96%)、亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae, 0.50%); 樣品b分屬83科, 其中有 43個已知菌科, 占全部序列數(shù)的92.10%。其優(yōu)勢菌科為叢毛單胞菌科(36.56%)、紅環(huán)菌科(20.92%)、梭菌科(Clostridiaceae_1,15.06%)、黃桿菌科(3.64%)、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae, 2.67%)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae,2.24%)、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae,1.86%)、紅螺菌科(1.56%)、螺旋體科(Spirochaetaceae, 1.39%)、韋榮氏球菌科(Veillonellaceae,0.98%)、冷形菌科(Cryomorphaceae, 0.96%)。叢毛單胞菌科、紅螺菌科、紅環(huán)菌科及黃桿菌科為a、b的共同優(yōu)勢菌科, 這些細菌絕大多數(shù)為好氧或兼性厭氧的異養(yǎng)菌, 具有較強的適應(yīng)性。梭菌科、黃單胞菌科、瘤胃球菌科、脫硫弧菌科、螺旋體科、韋榮氏球菌科、冷形菌科則為生物膜b中特有的優(yōu)勢菌群。

在屬分類水平上, a樣品中共有84個分類單元被注釋, 已知屬35個, 僅占全部序列數(shù)的32.25%, 大量的序列不能歸入已知屬(數(shù)據(jù)庫分別以科的名稱加_uncultured、_ norank、_unclassified來表示)。如圖8所示, 8個優(yōu)勢菌群(相對豐度＞0.5%)約占總序列的86.87%, 依次為Comamonadaceae_unclassified(50.36%)、磁螺菌屬(23.35%)、Rhodocyclaceae_unclassified(6.31%)、黃桿菌屬(Flavobacterium, 2.16%)、動膠菌屬(1.72%)、嗜氫菌屬(Hydrogenophaga, 1.09%)、水桿狀菌屬(Aquabacterium, 0.96)、硝化螺菌屬(0.92%)。b樣品中有126個分類單元被鑒定, 已知屬56個, 僅占全部序列數(shù)的35.34%。圖9為屬分類水平b樣品的優(yōu)勢菌群(相對豐度＞0.5%), 18個優(yōu)勢菌屬群約占總序列的84.74%。b中與反硝化有關(guān)的屬包括:Comamonadaceae_unclassified(36.04%)、Rhodocyclaceae_unclassified(12.47%)、梭菌屬(14.37%)、動膠菌屬(8.05%)、管道桿菌屬(2.82%)、脫硫弧菌屬(1.86%)、熱單胞菌屬(1.15%)、黃桿菌屬(0.81%)、嗜氫菌屬(0.25%)、叢毛單胞菌屬(0.24%)、脫氯單胞菌屬(Dechloromonas, 0.14%), 這類細菌占樣品總序列數(shù)的78.2%。

3 討論

通過養(yǎng)殖廢水中的土著微生物自然掛膜形成穩(wěn)定而多樣的微生物群落, 同時利用PHBV作為可釋性碳源為反硝化脫氮提供電子, 可實現(xiàn)低C/N比水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中氮素污染物的高效去除。本試驗不同于之前直接以人工配置廢水進行的脫氮處理,

圖8 生物膜樣品a中主要細菌分類組成(屬水平)Fig. 8 Bacterial communities of biofilm sample a at genus level

圖9 生物膜樣品b中主要細菌分類組成(屬水平)Fig. 9 Bacterial communities of biofilm sample b at genus level

人工配置廢水添加成分簡單, 且往往只添加一種氮素污染物如硝酸鹽[17,23,27,33]。本試驗直接以氮素污染較嚴重的甲魚養(yǎng)殖廢水和相對較輕的南美白對蝦養(yǎng)殖廢水為脫氮處理的試驗用水, 在同一反應(yīng)器中實現(xiàn)了硝化與反硝化的同步進行, 其氨氮、亞硝酸鹽氮及總氮的去除率均在90%以上。反應(yīng)器的前端為硝化功能區(qū), 添加彈性填料、流化床填料等為營附著性生長的硝化功能菌群提供有利生長條件, 通過這些細菌的轉(zhuǎn)化作用, 氨氮在此首先被氧化為亞硝酸鹽氮, 再進一步被氧化為硝酸鹽氮。反硝化功能區(qū)與硝化功能區(qū)之間有多個小格, 其目的在于降低水中的溶氧, 水中的溶氧越低, PHBV上的生物膜越容易接近厭氧的微環(huán)境, 從而使得反硝化脫氮更徹底更高效, 期間觀測到大量氣泡產(chǎn)生, 進一步檢測證實為N2。PHBV本質(zhì)上是微生物的能源儲備物質(zhì), 它具有較好的生物降解性, 在微生物酶的作用下而降解、釋放碳源, 其降解速率可隨環(huán)境的變化做出相應(yīng)的調(diào)節(jié), 不會因釋放過量的有機碳而使水質(zhì)惡化。使用時將其置于網(wǎng)袋中投入水體即可, 操作方便, 持久耐用。最大的不足是該材料價格昂貴, 在一定程度上限制了其推廣應(yīng)用。硝化反應(yīng)產(chǎn)生酸, 而反硝化過程通常會產(chǎn)生堿度, 2個過程在一個反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)進行, 通過內(nèi)部的循環(huán)維持酸堿度的平衡, 無需投加藥劑調(diào)節(jié)pH。反應(yīng)器中的功能微生物皆來自水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水, 并在添加了PHBV后, 形成了新的穩(wěn)定微生物群落結(jié)構(gòu)。因此,對不同氮負荷的養(yǎng)殖廢水均有較好的去除效果。

微生物群落是生物填料及固相反硝化工藝實現(xiàn)氮素轉(zhuǎn)化及去除的決定性因素。本研究借助Miseq高通量測序分析了彈性填料及流化床填料生物膜樣品a和PHBV生物膜樣品b的細菌群落結(jié)構(gòu)。生物膜a的優(yōu)勢菌為變形菌門的β-、α-、γ-變形菌綱; 擬桿菌門的黃桿菌綱(Flavobacteria)和鞘氨醇桿菌綱(Sphingobacteria), 這與李秋芬等[34]的研究相似。根據(jù)已有的研究報道[35,36], 參與硝化過程的細菌, 如氨氧化細菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)及硝化細菌(Nitrite-oxidizing bacteria, NOB),以及將有機氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的氨化細菌等, 大部分種類也都屬于變形菌門。另外, a中還鑒定出了硝化螺菌屬, 它與β變形菌綱的亞硝化單胞菌屬是廢水處理中最常見的硝化功能菌群, 共同完成氨態(tài)氮到亞硝態(tài)氮及硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化。然而, 在生物膜樣品a中, 功能菌群亞硝化單胞菌及硝化螺菌的豐度遠低于其他優(yōu)勢菌, 其原因可能是, 絕大部分種類的硝化細菌皆為專性化能自養(yǎng)菌, 好氧性強, 底物要求專一性高, 且對環(huán)境因子極為敏感, 平均世代周期一般都在10h以上, 生長緩慢。

由表1及圖6—10均可以看出, 生物膜b上的細菌群落, 無論是其豐度指數(shù), 還是多樣性指數(shù)均顯著高于生物膜a。b中細菌主要歸屬于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門和綠菌門, 其菌群結(jié)構(gòu)組成與其他生物反硝化脫氮的研究結(jié)果[17,21,22,27,33,37]基本一致。變形菌門是反硝化過程中最主要的優(yōu)勢菌群[16, 17, 21—23, 27, 33, 37, 38], 大部分能夠利用PHBV的反硝化菌都是β-變形菌綱的成員, 其中以叢毛單胞菌科豐度最高[15—18]。這均與本試驗生物膜樣品b的微生物群落結(jié)構(gòu)基本符合, b中變形菌門的比例為65.65%, 變形菌門里88.61%為β-變形菌綱, 叢毛單胞菌科又占到了β-變形菌綱63.24%。有研究表明[17,23,24,33,38,39], 生物膜中與反硝化有關(guān)的主要菌屬包括有益桿菌屬、食酸菌屬、叢毛單胞菌屬、嗜氫菌屬、脫硫弧菌屬、脫氯單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、梭菌屬、熱單胞菌屬、產(chǎn)堿菌屬及動膠菌屬等。這些種類的細菌在b中多有發(fā)現(xiàn), 占樣品總序列數(shù)的78.2%, 是水體中氮素污染物去除的主力軍。

此外, 在屬的分類水平上, 2種生物膜樣品均有大量序列不能歸入已知的屬, a中有67.75%, b中有64.66%, 以叢毛單胞菌科和紅環(huán)菌科的種類最多。這些序列與數(shù)據(jù)庫中的參考序列進行比對后, 根據(jù)置信度閾值的篩選, 在屬的分類級別分值較低, 統(tǒng)計時以Unclassified標記, 例如Comamonadaceae_unclassified、Rhodocyclaceae_unclassified, 在a、b總序列數(shù)中分別占50.36%、36.04%和6.31%、12.47%。推測可能是尚未鑒定的新屬, 有研究指出[22], 細菌群落組成中一些不能鑒別或未培養(yǎng)的細菌, 可能在污染物去除過程中發(fā)揮重要的作用。這些未知細菌和水質(zhì)凈化能力的關(guān)聯(lián), 有待進一步研究。

[1]Ravnjak M, Vrtov?ek J, Pintar A. Denitrification of drinking water in a two-stage biofilm membrane bioreactor [J].Desalination and Water Treatment, 2013, 51(28-30):5402—5408

[2]Sun S P, Nacher N P I, Merkey B,et al. Effective biological nitrogen removal treatment processes for domestic wastewaters with low C/N ratios: a review [J].Environmental Engineering Science, 2010, 27(2): 111—126

[3]Chen C J. Study on anammox treatment of turtle aquaculture wastewater and its microbial mechanism [D]. PhD dissertation. Zhejiang University, Hangzhou. 2012 [陳重軍. 甲魚養(yǎng)殖廢水厭氧氨氧化處理及其微生物機理研究. 博士學(xué)位論文, 浙江大學(xué), 杭州. 2012]

[4]Henze M. Capabilities of biological nitrogen removal processes from wastewater [J].Water Science and Technology, 1991(4—6): 669—679

[5]Wu C Y, Peng Y Z, Peng Y. Biological nutrient removal in A2O process when treating low C/N ratio domestic wastewater [J].Journal of Chemical Industry and Engineering (China), 2008, 59(12): 3126—3131 [吳昌永, 彭永臻, 彭軼. A2O工藝處理低C/N比生活污水的試驗研究. 化工學(xué)報, 2008, 59(12): 3126—3131]

[6]Wang S Y, Yin F F, Hou H X,et al. Biological denitrification with methanol as external carbon source [J].Journal of Beijing University of Technology, 2009, 35(11):1521—1526 [王淑瑩, 殷芳芳, 侯紅勛, 等. 以甲醇作為外碳源的生物反硝化. 北京工業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2009,35(11): 1521—1526]

[7]Delanghe B, Nakamura F, Myoga H,et al. Drinking water denitrification in a membrane bioreactor [J].Water Science and Technology, 1994, 30(6): 157—160

[8]Li H J, Chen Y G, Gu G W. Effect of propionic to acetic acid ratio on biological nitrogen and phosphorus removal with low energy consumption [J].China Environmental Science, 2008, 28(8): 673—678 [李洪靜, 陳銀廣, 顧國維. 丙酸/乙酸對低能耗生物除磷脫氮系統(tǒng)的影響. 中國環(huán)境科學(xué), 2008, 28(8): 673—678]

[9]Bill K A, Bott C B, Murthy S N. Evaluation of alternative electron donors for denitrifying moving bed biofilm reactors (MBBRs) [J].Water Science amp; Technology,2009, 60(10): 2647—2657

[10]Aslan S, Türkman A. Combined biological removal of nitrate and pesticides using wheat straw as substrates [J].Process Biochemistry, 2005, 40(2): 935—943

[11]Trois C, Pisano G, Oxarango L. Alternative solutions for the biodenitrification of landfill leachates using pine bark and compost [J].Journal of Hazardous Materials, 2010,178(1—3): 1100—1105

[12]Ovez B. Batch biological denitrification usingArundo donax,Glycyrrhiza glabra, andGracilaria verrucosaascarbon source [J].Process Biochemistry, 2006, 41(6):1289—1295

[13]Fang J Z, Xu C Y, Norio O. Denitrification of groundwater using cotton as energy source [J].Water Science amp;Technology, 1996, 34(1—2): 379—385

[14]Robinson-Lora M A, Brennan R A. The use of crab-shell chitin for biological denitrification: batch and column tests [J].Bioresource Technology, 2009, 100(2):534—541

[15]Hiraishi A, Khan S T. Application of polyhydroxyalkanoates for denitrification in water and wastewater treatment [J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2003, 61(2): 103—109

[16]Takahashi M, Yamada T, Tanno M,et al. Nitrate removal efficiency and bacterial community dynamics in denitrification processes using poly (L-lactic acid) as the solid substrate [J].Microbes and Environments, 2010,26(3): 212—219

[17]Chu L B, Wang J L. Denitrification performance and biofilm characteristics using biodegradable polymers PCL as carriers and carbon source [J].Chemosphere, 2013,91(9): 1310—1316

[18]Khan S T, Horiba Y, Takahashi N,et al. Activity and community composition of denitrifying bacteria in poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)-using solidphage denitrification processes [J].Microbes and Environments, 2007, 22(1): 20—31

[19]Wang W, Qu K M, Wang H Z,et al. Preliminary study on the biofilm cultivation and the dissolved inorganic nitrogen-removing efficiency with three filtering stuff under different hydraulic loadings [J].Journal of Safety and Environment, 2012, 12(1): 66—71 [王威, 曲克明, 王海増,等. 水利負荷對3種濾料生物掛膜和溶解無機氮去除效果的初步研究. 安全與環(huán)境學(xué)報, 2012, 12(1): 66—71]

[20]Zhang L Y, Rao B Q, Xiong Y,et al. The micobial mechanism of horizonal constructed wetland used to treated Black-odor River [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2010,34(2): 256—261 [張列宇, 饒本強, 熊瑛, 等. 人工濕地黑臭水體處理系統(tǒng)微生物脫氮機理研究. 水生生物學(xué)報,2010, 34(2): 256—261]

[21]Jin H, Li B L, Ou J,et al. Microbial population diversity of activated sludge for wastewater treatment [J].Journal of Microbiology, 2012, 32(4): 1—5 [金浩, 李柏林, 歐杰,等. 污水處理活性污泥微生物群落多樣性研究. 微生物學(xué)雜志, 2012, 32(4): 1—5]

[22]Ma Q, Qu Y Y, Shen W L,et al. Bacterial community compositions of coking wastewater treatment plants in steel industry revealed by Illumina high-throughput sequencing [J].Bioresource Technology, 2015, 179:436—443

[23]Xu Y, Qiu T L, Han M L,et al. Analysis on microbial community in biofilm coating onto solid carbon source using the PCR-DGGE technique [J].Environmental Sci-ence, 2013, 34(8): 3257—3263 [徐影, 仇天雷, 韓梅琳,等. PCR-DGGE技術(shù)解析固體碳源表面生物膜的微生物群落結(jié)構(gòu). 環(huán)境科學(xué), 2013, 34(8): 3257—3263]

[24]Mergaert J, Boley A, Cnockaert M C,et al. Identity and potential functions of heterotrophic bacterial isolates from a continuous-upflow fixed-bed reactor for denitrification of drinking water with bacterial polyester as source of carbon and electron donor [J].Systematic and Applied Microbiology, 2001, 24(2): 303—310

[25]Wang C, Xie B, Han L, Xu X F. Study of anaerobic ammonium oxidation bacterial community in the aged refuse bioreactor with 16S rRNA gene library technique [J].Bioresource Technology, 2013, 145(4): 65—70

[26]Horiba Y, Khan S T, Hiraishi A. Characterization of the microbial community and culturable denitrifying bacteria in a solid-phase denitrification process using poly (εcaprolactone) as the carbon and energy source [J].Microbes and Environments, 2005, 20(1): 25—33

[27]Shen Z Q, Zhou Y X, Wang J L. Comparison of denitrification performance and microbial diversity using starch/polylactic acid blends and ethanol as electron donor for nitrate removal [J].Bioresource Technology,2013, 131(3): 33—39

[28]Mclellan S L, Huse S M, Mueller-Spitz S R,et al. Diversity and population structure of sewage derived microorganisms in wastewater treatment plant influent [J].Environmental Microbiology, 2010, 12(2): 378—392

[29]Roesch L F, Fulthorpe R R, Riva A,et al. Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity [J].The International Society for Microbial Ecology, 2007,1(4): 283—290

[30]Andersson A F, Lindberg M, Jakobsson H,et al. Comparative analysis of human gut microbiotaby barcoded pyrosequencing [J].PLoS One, 2008, 3(7): 2836—2843

[31]State Environmental Protection Administration. Water and Wastewater Monitoring Analysis Method (4th edition) [M]. Beijing: China Environmental Press. 2002,271—281 [國家環(huán)?？偩? 水和廢水監(jiān)測分析方法 (第四版). 北京: 中國環(huán)境出版社. 2002, 271—281]

[32]Xiong J B, Liu Y Q, Lin X G,et al. Geographic distance and pH drive bacterial distribution in alkaline lake sediments across Tibetan Plateau [J].Environmental Microbiology, 2012, 14(9): 2547—2466

[33]Shen Z Q, Zhou Y X, Hu J,et al. Denitrification performance and microbial diversity in a packed-bed bioreactor using biodegradable polymer as carbon source and biofilm support [J].Journal of Hazardous Materials,2013, 250—251: 431—438

[34]Li Q F, Fu X J, Zhang Y,et al. PCR-DGGE analysis of bacterial communities in bio-filtors of re-circulating mariculture system [J].Journal of Fisheries of China, 2011,35(4): 579—586 [李秋芬, 傅雪軍, 張艷, 等. 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池細菌群落PCR-DGGE分析. 水產(chǎn)學(xué)報,2011, 35(4): 579—586]

[35]Staley J T, Bryant M P, Pfennig N,et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology [M]. Baltimore: Williams amp;Wilkins, 2001, 1807—1835

[36]Ma Y, Qian L M, Wang Y S,et al. Progress in molecular ecology of nitrifying bacteria [J].Journal of Fishery Science of China, 2007, 14(5): 872—879 [馬英, 錢魯閩, 王永勝, 等. 硝化細菌分子生態(tài)學(xué)研究進展. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2007, 14(5): 872—879]

[37]Ye L, Shao M F, Zhang T,et al. Analysis of the bacterial community in a laboratory-scale nitrification reactor and a wastewater treatment plant by 454-pyrosequencing [J].Water Research, 2011, 45(45): 4390—4398

[38]Zhang L H, Liu L L, Qiu T L,et al. Nitrate removal from re-circulating aquaculture system using polyhydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate as carbon source [J].Acta Microbiologica Sinica, 2014, 54(9): 1053—1062 [張?zhí)m河,劉麗麗, 仇天雷, 等. 以聚羥基丁酸戊酸共聚酯為碳源去除循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的硝酸鹽及生物膜中微生物群落動態(tài). 微生物學(xué)報, 2014, 54(9): 1053—1062]

[39]Shao Y Q, Chung B S, Lee S S,et al. Zoogloea caeni sp.nov., a floc-forming bacterium isolated from activated sludge [J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, 59(3): 526—530

THE STUDY OF NATURAL BIOFILM FORMATION FOR NITROGEN REMOVAL FROM AQUACULTURE WASTEWATER AND ANALYSIS ON MICROBIAL COMMUNITY IN BIOFILM

LIN Ling-Yun, YIN Wen-Lin, PAN Xiao-Yi, YUAN Xue-Mei, YAO Jia-Yun, XU Yang,WANG Chao and SHEN Jin-Yu
(Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries, Huzhou 313001, China)

This study was conducted to evaluate the applications of biological filter medias in low C/N ratio aquaculture wastewater. Elastic filler and fluidized bed packing materials were used as biofilm of nitration and PHBV (poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) were used as the carbon source and biofilm carrier of denitrification in this study. The water quality and the bacterial community compositions were determined by the method of Miseq highthroughput sequencing. The obtained results demonstrated that biofilm of the system formed after 4 weeks operation, at the temperature of 25—30℃. Our results also showed that the two kinds of media had great effects on removing total nitrogen (TN), ammonia nitrogen (NH3-N), nitrite (NO2-N). The removal rate of TN, NH3-N and NO2-N can reach up 90%. The sequencing results indicated that the predominant bacteria on the biofilm sample a coating onto elastic filler and fluidized bed packing materials were Proteobacteria, Bacteroidetes and Firmicutes. While the major microorganisms on the biofilm sample b attaching to the surface of PHBV granules were Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Spirochaetae and Chlorobi. The analysis revealed that both diversity index and abundance index of microbial community of biofilm sample b were far higher than the sample. Family of Comamonadaceae and Rhodocyclaceae belonging to Betaproteobacteria were highly enriched in both biofilms samples. However, there was a distinctive difference in phylotypes between the two biofilm samples at genus level, which was probably due to the diversities of biofilm carrier,carbon source and dissolved oxygen. The genera of biofilm sample a was only two thirds of b. A total of 8 and 18 genera with a relative abundance greater than 0.5% were identified from a and b, respectively. Among them, the unknown groups belonging to Comamonadaceae and Rhodocyclaceae accounted for 56.67% and 45.51% of the total sequence of a and b. Organisms from the genusMagnetospirillumandNitrospirawere only detected in a, while the genusClostridium,Zoogloea,Cloacibacterium,Desulfovibroetc were identified in b, which probably contributed to denitrification performance.

Biofilm carrier; PHBV; Aquaculture wastewater; Biofilm; Microbial community

Q938

A

1000-3207(2017)06-1327-09

2016-10-10;

2017-05-11

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2015BAD13B04); 湖州市生態(tài)文明先行示范區(qū)科技專項重點項目(2014ZD2020)資助[Supported by National Science and Technology Project of the 12th Five-year Plan for Rural Areas (2015BAD13B04); Science and Technology Key Projects of Huzhou for Ecological Civilization Precede the Demonstration Area (2014ZD2020)]

藺凌云(1984—), 女, 山東德州人; 碩士研究生; 主要研究方向為微生物學(xué)。E-mail: linly0531@163.com

沈錦玉, 研究員。E-mail: sjinyu@126.com

10.7541/2017.164