林慧　陳一和　夏曉東

[摘要] 目的 觀察不同頻率間歇低氧對大鼠血壓的影響及其血管內(nèi)皮功能的變化。 方法 將40只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為常氧對照組（NC組）及4個(gè)間歇低氧組（IH1，IH2，IH3，IH4），其低氧頻率分別為10次/h、20次/h、30次/h、40次/h。測定實(shí)驗(yàn)前后大鼠動(dòng)脈收縮壓、血清內(nèi)皮素-1、一氧化氮水平。 結(jié)果 ①各組大鼠實(shí)驗(yàn)前SBP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各 IH組SBP較實(shí)驗(yàn)前和NC組均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；隨著間歇低氧頻率的增加，各IH組大鼠血壓逐漸升高，但I(xiàn)H4組較IH3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NC組SBP較實(shí)驗(yàn)前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②各IH組血清ET-1水平較NC組相比明顯增高（P<0.05），血清NO水平顯著降低（P均<0.01）。隨著間歇低氧頻率的增加，血清ET-1水平升高，NO水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。IH4組與IH3組相比，各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 血管內(nèi)皮功能障礙在慢性間歇低氧致高血壓過程中起著重要的作用。隨著間歇低氧頻率增高，血壓升高及內(nèi)皮損傷加重，但并非頻率越高，損傷越重。

[關(guān)鍵詞] 阻塞性睡眠呼吸暫停；血壓；內(nèi)皮功能；間歇低氧頻率

[中圖分類號(hào)] R544.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）29-0031-04

Effects of different intermittent hypoxia frequency on blood pressure and vascular endothelial function in rats

LIN Hui1 CHEN Yihe2 XIA Xiaodong1

1.Department of Respiratory Medicine， the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China； 2.Department of Cardiovascular Medicine，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To observe the effect of intermittent hypoxia with different frequencies on blood pressure and the changes of vascular endothelial function in rats. Methods 40 Wistar male rats were randomly divided into normoxic control group（NC group） and 4 intermittent hypoxia group（IH1， IH2， IH3， IH4）. The frequency of hypoxia was 10 times/h， 20 times/h， 30 times/h， and 40 times/h. The arterial systolic blood pressure， serum endothelin-1 and nitric oxide levels were measured before and after the experiment. Results （1）There were no statistically significant differences in SBP between the two groups before the experiment. After 6 weeks of experiment， SBP in each IH group was significantly higher than that before experiment and that in NC group（P<0.05 or P<0.01）； with the increase of intermittent hypoxia frequency， the blood pressure of each IH group of rats was increased gradually， but there was no statistically significant difference between IH4 group and IH3 group. SBP in NC group was not statistically significant compared with that before experiment. （2） Compared with NC group， the levels of serum ET-1 in each IH group were significantly higher（P<0.05）. Serum NO level was significantly decreased（all P<0.01）. With the increase of intermittent hypoxia frequency， serum ET-1 level was increased， and NO level was significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）. There was no statistically significant difference in each index between IH4 group and IH3 group. Conclusion Vascular endothelial dysfunction plays an important role in the process of hypertension caused by chronic intermittent hypoxia. With the increase of intermittent hypoxia frequency， the blood pressure is increased and the endothelial injury becomes severe. But it is not the case that the higher the frequency， the more severe the injuryendprint

[Key words] Obstructive sleep apnea； Blood pressure； Endothelial function； Intermittent hypoxia frequency

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是一種常見的睡眠呼吸障礙性疾病，可以導(dǎo)致OSAS患者各系統(tǒng)損傷，尤其是心血管系統(tǒng)[1，2]。文獻(xiàn)表明，OSAS與高血壓有很強(qiáng)的相關(guān)性，是高血壓發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[3，4]。不斷有研究證明OSAS患者夜間頻繁的間歇低氧血癥可導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，從而引起OSAS合并高血壓的發(fā)生[5]。關(guān)于不同間歇低氧程度和間歇低氧持續(xù)時(shí)間對大鼠高血壓的嚴(yán)重程度影響已有文獻(xiàn)報(bào)道，但動(dòng)物模型方面有關(guān)低氧頻率的研究較少。因此我們通過建立OSAS模式不同頻率間歇低氧（intermittent hypoxia，IH）大鼠模型，測定鼠尾動(dòng)脈收縮壓（systolic arterial pressure，SBP）以及大鼠血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）和內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1），探討睡眠呼吸暫停模式不同頻率間歇低氧下大鼠血管內(nèi)皮功能的變化以及對血壓的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性Wistar大鼠40只，合格證號(hào)：SCXK-（軍）2009-003，體重（202±15）g。給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 按照隨機(jī)排列表法，將大鼠分為5組，每組8只，分別為NC組（常氧對照組）及IH1組、IH2組、IH3組、IH4組，其間歇低氧頻率分別為10次/h、20次/h、30次/h、40次/h。

1.2.2 模型制作 建立OSAS模式間歇低氧模型，將各組大鼠置于自制的相同密閉低氧艙，通過電腦控制程序設(shè)定壓縮空氣和氮?dú)獾尼尫艜r(shí)間及流量，使低氧艙內(nèi)氧氣濃度循環(huán)維持在5%～21%，達(dá)到預(yù)置的低氧/復(fù)氧條件。即首先低氧艙內(nèi)充入純氮?dú)?30 s，使艙內(nèi)氧濃度降至最低5%，隨后充入壓縮空氣（IH1：330 s，IH2：150 s，IH3：90 s，IH4：60 s），使艙內(nèi)氧濃度從低氧狀態(tài)5%恢復(fù)至 21%。NC組艙內(nèi)氧濃度始終維持在21%。每日低氧暴露時(shí)間為9：00～17：00，共6周。其余時(shí)間自由攝食，實(shí)驗(yàn)過程中無大鼠死亡。

1.2.3 大鼠血壓測定 應(yīng)用無創(chuàng)鼠尾動(dòng)脈血壓儀測量大鼠SBP，分別于實(shí)驗(yàn)開始前1 d早晨8：00、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天早晨8：00測量收縮壓。連續(xù)測量三次取平均值。儀器BP-6，購自成都泰盟科技有限公司。

1.2.4 血清標(biāo)本采集及各指標(biāo)測定 于6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采取大鼠動(dòng)脈血，4 000 r/min離心15 min，取上清液，-80℃保存待測。血清ET-測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELI SA），血清NO測定采用硝酸還原酶法，試劑盒分別購于R&D公司（Rndsystems，美國）和南京建成生物工程研究所。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理結(jié)果，計(jì)量資料以（x±s）表示。各組間采用單因素方差分析檢驗(yàn)（One-Way ANOVA），多組間兩兩比較采用LSD。采用配對t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同頻率間歇低氧暴露后大鼠血壓變化

實(shí)驗(yàn)前各組大鼠SBP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。至6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，IH1、IH2、IH3、IH4組SBP較實(shí)驗(yàn)前SBP和NC組顯著升高（P<0.05或<0.01）；與IH1組相比，IH3、IH4組SBP升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；IH4組較IH3組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NC組SBP較實(shí)驗(yàn)前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2不同頻率間歇低氧暴露后大鼠血清ET-1及NO水平

各IH組與NC組相比，血清ET-1水平顯著增高，NO水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。IH3、IH4組ET-1水平顯著高于IH1組，NO水平低于IH1組和IH2組（P<0.05或P<0.01）。IH4組與IH3組相比，ET-1及NO水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

3 討論

OSAS與高血壓病在臨床上有著較高比例的共存率[6]。在高血壓等心血管疾病的發(fā)生過程中，機(jī)制較多[7]，但血管內(nèi)皮損傷是其最基礎(chǔ)的病理變化[8]。而在OSAS患者特有的慢性間歇低氧條件下，可以出現(xiàn)血管內(nèi)皮收縮功能增強(qiáng)，舒張功能減弱[9，10]，血管活性收縮物質(zhì)代謝失衡[11]，從而出現(xiàn)血管內(nèi)皮功能障礙。因此，血管內(nèi)皮功能障礙在OSAS患者高血壓發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著潛在的重要作用。

NO和ET-1分別起著舒張和收縮血管的作用，兩者在血管中處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，有效調(diào)節(jié)了血管舒縮功能。NO是由一氧化氮合酶（NOS）催化生成，研究發(fā)現(xiàn)低氧造成內(nèi)皮細(xì)胞eNOS不僅合成減少，并且活性降低。另外由于底物O2也減少，故NO的生成減少[12]。OSAS患者反復(fù)缺氧可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞生成NO減少，而生成ET-1增加[5]。目前已廣泛應(yīng)用通過檢測上述血漿中內(nèi)皮細(xì)胞功能標(biāo)志物來間接反映血管內(nèi)皮功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著間歇低氧暴露時(shí)間的延長，各IH組大鼠SBP至6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，明顯高于實(shí)驗(yàn)前自身血壓和NC組，而NC組血壓沒有升高，說明由OSAS模式的間歇低氧暴露可以引起大鼠血壓明顯升高，提示OSAS特有的間歇低氧可能是造成血壓升高的根本原因。與NC組比較，IH組大鼠血清中ET-1水平顯著升高，而NO水平呈現(xiàn)下降，這與國內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-14]。該結(jié)果也進(jìn)一步提示了血管活性物質(zhì)的改變，在OSAS引起血管內(nèi)皮功能障礙、高血壓發(fā)病過程中起著重要的作用。內(nèi)皮功能障礙是“內(nèi)皮-高血壓-心血管事件”鏈的始動(dòng)因子和載體，慢性間歇低氧可以引起血管內(nèi)皮受損，導(dǎo)致高血壓，而長期的高血壓對血管壁的剪切力同樣可以加重血管內(nèi)皮損傷，長期惡性循環(huán)，嚴(yán)重影響全身心腦血管系統(tǒng)。endprint

另外，我們還監(jiān)測了不同頻率慢性間歇低氧對大鼠高血壓以及血管內(nèi)皮功能的影響。Lavie P等[15]曾報(bào)道OSAS患者血壓升高的程度與呼吸暫停低通氣指數(shù)（AHI）呈正相關(guān)，研究結(jié)果顯示，OSAS患者AHI每增多1次，高血壓發(fā)生的概率就增加1%。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著間歇低氧頻率的增加，血壓有升高趨勢，但I(xiàn)H4組與IH3組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣，隨著低氧頻率的增加，ET-1水平逐漸增高，因此間歇低氧頻率可以影響ET-1水平。臨床上AHI用來評估患者睡眠呼吸暫停低通氣嚴(yán)重程度，有文獻(xiàn)表明[16]，中重度組OSAS患者血清ET-1明顯升高，而輕度組的患者ET-1并沒有升高。這與我們的課題研究結(jié)果類似。同樣，高IH頻率組NO水平明顯低于低IH頻率組，這說明血管內(nèi)皮舒張功能受損程度隨著頻率增加而損傷加重。但是，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， IH4組ET-1水平高于IH3組，而NO水平下降，但兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與本次研究血壓測得的結(jié)果一致。有研究說明[17]，間歇低氧-再氧合對細(xì)胞炎性損傷，產(chǎn)生于再氧合階段而非間歇低氧階段。因此分析原因可能為頻率的增加使再氧合時(shí)間縮短，不足以再持續(xù)性地加重內(nèi)皮功能損傷[18]。另一原因，過高的呼吸暫停頻率患者與低頻率者相比，前者相對持續(xù)地處于低氧狀態(tài)，呼吸暫停后難以達(dá)到正常氧水平，影響血氧變化的幅度，可能減少內(nèi)皮功能障礙的程度，故血壓沒有進(jìn)一步升高。一項(xiàng)多中心研究納入國內(nèi)20家醫(yī)院共2297例患者，進(jìn)行關(guān)于AHI與高血壓患病率的研究[19]結(jié)果顯現(xiàn)了同樣的趨勢，隨AHI增加，OSAS患者的高血壓患病率增高，但當(dāng)AHI達(dá)到（66～70）次/h，OSAS患者高血壓患病率達(dá)到峰值，而后出現(xiàn)逐漸下降的趨勢。該多中心研究樣本量大，但該研究并未對高血壓產(chǎn)生的機(jī)制如血管內(nèi)皮功能進(jìn)行檢測。因此我們不排除在更高IH頻率或更長的間歇低氧條件下，大鼠血壓出現(xiàn)下降以及內(nèi)皮功能損傷減輕的情況，這還需要在以后的實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證。也有研究表明，AHI并不能完全反映低氧的程度，不能評估間歇低氧對內(nèi)皮損傷及高血壓的影響[20]。

綜上所述，血管內(nèi)皮功能障礙在慢性間歇低氧致高血壓過程中起著重要作用。隨著間歇低氧頻率增高，血壓升高及內(nèi)皮損傷加重，但并非頻率越高，損傷越重。因此仍需大規(guī)模的臨床研究進(jìn)一步展現(xiàn)持續(xù)增高的低氧頻率與血壓及相關(guān)機(jī)制的影響。

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（收稿日期：2017-05-20）endprint