丁少成，張懷才，高林林

（杭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 杭州 310016）

·技術(shù)與應(yīng)用·

PrepFiler Express BTATM裂解液聯(lián)合硅珠法快速提取骨骼DNA

丁少成，張懷才，高林林

（杭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 杭州 310016）

目的建立方便、快捷的提取骨骼DNA的方法。方法對15份長骨樣本清洗消毒后，采用電鉆鉆取骨屑，使用PrepFiler Express BTATM裂解液進(jìn)行裂解消化后，應(yīng)用手工硅珠吸附純化進(jìn)行DNA提取檢驗(yàn)。結(jié)果有14份樣本獲得滿意的STR分型，僅1份樣本未獲得STR分型，檢出率為93.33%。結(jié)論本研究建立的骨骼DNA快速提取方法操作簡單、便捷、有效，適應(yīng)性強(qiáng)，值得推廣應(yīng)用。

法醫(yī)遺傳學(xué)；骨骼；DNA；PrepFiler Express BTATM；硅珠法

隨著DNA技術(shù)的發(fā)展和實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)的積累，骨骼類生物檢材DNA提取的方法已有多種多樣[1]，高林林等[2]依托AutoMate ExpressTM系統(tǒng)，使用 PrepFiler Express BTATM試劑盒（以下簡稱BTA試劑盒），將骨骼DNA提取時(shí)間縮短到了3h內(nèi)，大大提高了實(shí)驗(yàn)室的工作效率，為公安快速辦案提供強(qiáng)有力的科技支撐。

筆者借鑒高林林等[2]建立的方法，采用電鉆鉆取骨屑，使用PrepFiler Express BTATM裂解液進(jìn)行裂解消化，結(jié)合硅珠法純化提取骨骼DNA，獲得滿意DNA分型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取日常檢案中積累的高度腐敗或者白骨化尸體骨骼樣本15份（均為長骨），死亡時(shí)間長短不等，最長為30年左右，最短時(shí)間半年左右。

1.2 主要試劑和儀器

博世電鉆（GSR120-Li，德國 BOSCH 公司）、Prep-Filer Express BTATM試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Lysis Buffer裂解液（德國 QIAGEN公司）、15%硅珠懸液、AmpF?STR?Identifiler?Plus試劑盒（美國 AB公司）；9700型 PCR儀（美國 AB公司）、3500xL基因分析儀（美國AB公司）等。

1.3 方法

1.3.1 樣本準(zhǔn)備與提取

所有樣本均用刀將表面組織及污垢去除，清水清洗后晾干，置紫外燈下照射2h，用博世電鉆在骨密質(zhì)部位鉆取骨屑。

每份樣本取骨屑150mg左右于2mL樣本管中，按照BTA試劑盒使用說明加入裂解緩沖液220 μL、蛋白酶 K（proteinase K，PK） 7 μL、1 mol二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 3μL（如裂解液不能完全浸沒骨屑，可以按上述比例添加裂解液、PK和DTT至骨屑完全浸沒于液體中）。56℃振蕩消化2h，以離心半徑5 cm，14 000 r/min，離心3 min，取上清液置于 1.5 mL離心管中，加入2倍體積Lysis Buffer裂解液、15%硅珠懸液30 μL，按硅珠法純化提取模板DNA，洗脫體積為 30μL。

1.3.2 擴(kuò)增與檢測

采用AmpF?STR?Identifiler?Plus試劑盒在9700型PCR儀上進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為10μL，其中模板DNA量為4 μL。反應(yīng)條件：95℃ 11 min；94℃ 20 s，59℃ 3 min，29 個循環(huán)；60℃ 30 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物利用3500xL基因分析儀電泳檢測，使用ID-X 1.4軟件（美國AB公司）進(jìn)行基因型分析。

2 結(jié) 果

2.1 樣本結(jié)果

15份骨骼樣本中有14份獲得全部16個STR基因座分型（圖1），僅1例結(jié)果為陰性，檢出率為93.33%。

2.2 案例應(yīng)用

使用本研究方法對本實(shí)驗(yàn)室保存約150年的骨骼進(jìn)行檢驗(yàn)，取骨粉樣本150mg按本方法獲得12個STR基因座分型，且相對熒光單位（relative fluorescence units，RFU）值低，平均RFU值為600左右。取骨粉樣本450mg，20μL洗脫，獲得16個STR基因座完整分型（圖2）的平均RFU值為1700左右。參照高林林等[2]報(bào)道的方法提取該樣本，使用AmpF?STR?Identifiler?Plus試劑盒擴(kuò)增檢驗(yàn)獲得13個基因座的STR分型。

圖1 死亡時(shí)間30年左右的骨骼DNA分型；圖2死亡時(shí)間150年左右的骨骼DNA分型

3 討 論

骨骼外層有致密堅(jiān)硬的骨密質(zhì)保護(hù)，可較好地抵抗外界環(huán)境因素對骨骼樣本的侵蝕，使骨DNA得以長期保存，但同時(shí)也增加了實(shí)驗(yàn)室從骨骼樣本中獲取模板DNA的難度。雖然隨著DNA技術(shù)的發(fā)展和實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)的積累，多數(shù)骨骼DNA提取方法成功率超過90%，但一般所需樣本量大、檢驗(yàn)步驟復(fù)雜、耗時(shí)長、易污染。高林林等[2]建立的方法有效克服了上述缺點(diǎn)，但其對AutoMate ExpressTM系統(tǒng)的依賴一定程度限制了該方法的推廣應(yīng)用。

本研究建立的骨骼DNA提取方法保留了高林林等[2]建立的方法優(yōu)勢，與傳統(tǒng)方法相比，具有：（1）提取時(shí)間短，骨粉消化裂解無須EDTA脫鈣，僅需消化2h、硅珠純化約1h，共約3h即可用于擴(kuò)增；（2）所需檢材量少，一般僅需150 mg骨粉；（3）檢驗(yàn)步驟簡便易于掌握。而以手工硅珠法替代AutoMate ExpressTM自動核酸提取儀對消化后樣本進(jìn)行模板DNA的純化提取，擺脫了儀器設(shè)備對骨骼DNA提取的限制性，具有更強(qiáng)的推廣適用性。

本次對保存時(shí)間長達(dá)150年的骨骼樣本分析能夠獲得成功，主要是因?yàn)椋海?）增大了骨粉使用量。在本案例應(yīng)用過程中，當(dāng)取骨粉樣本150mg時(shí)，僅獲得12個STR基因座分型，且RFU值低；當(dāng)取骨粉樣本450mg以后，成功獲得16個STR基因座分型。（2）縮小了洗脫體系。本案例應(yīng)用的最終洗脫體系為20μL，小體系洗脫，能有效提高模板DNA濃度[3]。（3）手工硅珠法純化更靈活。使用適當(dāng)?shù)墓柚榱?，采用連續(xù)振蕩的懸浮方式，并適當(dāng)延長DNA與硅珠的結(jié)合時(shí)間，可以提高模板DNA的濃度[4]。受AutoMate ExpressTM系統(tǒng)程序設(shè)定的限制，高林林等[2]建立的方法因儀器進(jìn)樣吸取消化裂解液體積和最終洗脫體系是固定的，極大地限制了骨粉使用量的增加和模板DNA濃度的提高，針對腐敗陳舊骨骼DNA樣本缺乏靈活性。而本研究建立的骨骼DNA提取方法可根據(jù)骨骼實(shí)際情況，通過加大骨粉取樣量、縮小洗脫體積等方式，個性化制定提取方案，在陳舊性骨骼DNA檢驗(yàn)上更具優(yōu)勢。

綜上所述，本研究建立的骨骼DNA提取方法操作簡單、便捷、有效，適應(yīng)性強(qiáng)，值得推廣應(yīng)用。

[1]賈東濤，韓海軍，張玉紅，等.陳舊骨骼DNA提取方法的應(yīng)用研究[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（4）：260-261，封3.

[2]高林林，徐念來，謝煒，等.利用AutoMate ExpressTM自動化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)提取骨骼及牙齒DNA[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（2）：127-129.

[3]董迎春，李詩柳，朱怡，等.改良硅珠法提取DNA的靈敏性及穩(wěn)定性評價(jià)初探[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（1）：59-61.

[4]鄭小婷，徐念來.硅珠法提取生物檢材DNA的影響因素[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（1）：63-64.

2017-07-20）

（本文編輯：張素華）

PrepFiler Express BTATMLysis Buffer Combined with Silicon Microbeads for Rapid DNA Extraction from Bone

DING Shao-cheng,ZHANG Huai-cai,GAO Lin-lin
（Institute of Criminal Science and Technology,Hangzhou Public Security Bureau,Hangzhou 310016,China）

ObjectiveTo establish a convenient and rapid method for extracting DNA from bone.MethodsFifteen long bone samples were washed and sterilized.The skeletal fragments were obtained by electric drill,and lysed by PrepFiler Express BTATMlysis buffer.DNA was then manually extracted by silicon microbeads for further analysis.ResultsSTR genotyping was successfully obtained in 14 out of the 15 samples,and the detection rate was 93.33%.ConclusionThe method for DNA extraction from bone established in present study is convenient,quick,effective,and with a strong applicability,which is worth spreading and applying.

forensic genetics;bone;DNA;PrepFiler Express BTATM;silica-extraction method

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.05.014

1004-5619（2017）05-0514-02

丁少成（1981—），男，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA鑒定及法醫(yī)病理學(xué)檢驗(yàn)；E-mail：89781168@qq.com