有機陽離子轉(zhuǎn)運體與水蘇堿的相互作用研究＊

陳婷

（杭州醫(yī)學院藥學院，浙江 杭州 310053）

有機陽離子轉(zhuǎn)運體與水蘇堿的相互作用研究＊

陳婷

（杭州醫(yī)學院藥學院，浙江 杭州 310053）

目的是，研究考察水蘇堿與轉(zhuǎn)運體OCTs的相互作用。方法是，水蘇堿為一種季銨N+化合物，在生理pH7.4的環(huán)境中一般以陽離子形式存在。小分子的有機陽離子和中性化合物可被位于腎臟、肝臟細胞基底膜上的有機陽離子轉(zhuǎn)運體（OCT1、OCT2和OCT3）轉(zhuǎn)運?；谒K堿的化學結(jié)構(gòu)和OCTs的肝腎分布，應用穩(wěn)定高表達人有機陽離子轉(zhuǎn)運體OCTs和空載體（mock）細胞（MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT2、MDCK-hOCT3和MDCK-mock）模型，采用細胞積聚的方法來研究考察水蘇堿與轉(zhuǎn)運體OCTs之間的相互作用。結(jié)果是，闡明水蘇堿能在一定程度上抑制OCTs的經(jīng)典底物，但是，水蘇堿在3種高表達人有機陽離子轉(zhuǎn)運體細胞上的積聚與空載mock細胞上的積聚沒有差異。由此證明，其不是這些有機陽離子轉(zhuǎn)運體的底物。結(jié)論是，水蘇堿與轉(zhuǎn)運體OCTs之間存在一定的相互作用。

有機陽離子轉(zhuǎn)運體；水蘇堿；藥理作用機制；藥物治療

水蘇堿（stachydrine），別名為脯氨酸甜菜堿（proline betaine），是最簡單的吡咯生物堿，存在于多種植物中，比如益母草?，F(xiàn)代研究證明，水蘇堿具有興奮子宮、改善血液流變學、抗血栓等藥理作用，具有潛在的開發(fā)價值和應用前景[1]。目前，國內(nèi)外有關水蘇堿的研究主要集中在水蘇堿的分布、制備、測定和藥理作用這幾個方面[2-4]。

有機陽離子轉(zhuǎn)運體[3]（organic cation transporters，OCTs）有多種亞型，其中以OCT1、OCT2、OCT3最為常見。研究發(fā)現(xiàn)，這3種亞型存在于體內(nèi)多個組織，其中，OCT1和OCT2在人體腎臟的腎小管近段上皮細胞膜和肝臟上最多，所以，這2個轉(zhuǎn)運體主要負責腎臟、肝臟細胞攝取藥物的行為。OCT3廣泛分布于人體多個組織，主要包括心臟、肝臟、大腦皮質(zhì)和腸道等。OCTs主要負責小分子有機陽離子和中性化合物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運，在大多數(shù)此類化合物的組織分布方面發(fā)揮了重要的作用。研究表明，這3種轉(zhuǎn)運體具有相似的底物譜，并有OCTs的大量底物和抑制劑，也有文獻闡明OCTs在藥物治療中發(fā)揮了重要的作用。水蘇堿為含氮的季胺生物堿，在生理pH7.4的條件下以陽離子的形式存在，因此，推測腎細胞膜上表達的OCT2、肝細胞膜上的OCT1和OCT3可能影響腎臟、肝臟細胞對水蘇堿的攝取。在代謝方面，由于傳統(tǒng)中藥成分復雜，有效成分難以判斷，且往往采用復方制劑給藥，所以，中藥與其他合用藥物相互作用的可能性很大。目前，研究藥物代謝的文獻對中藥單體與其他藥物相互作用的報道尚少，因此，考察中藥單體對轉(zhuǎn)運體的影響對于安全、合理地使用中藥有非常重要的意義。為了深入了解OCT1、OCT2和 OCT3在肝、腎細胞中處置水蘇堿的作用，并推測轉(zhuǎn)運體對其體內(nèi)藥理作用的影響，本研究考察水蘇堿與轉(zhuǎn)運體OCTs的相互作用，進而研究由轉(zhuǎn)運體OCTs介導的水蘇堿跨膜轉(zhuǎn)運的特征，從而進一步了解其藥理作用機制，為水蘇堿的進一步開發(fā)和應用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

研究中使用的材料有：制冰機（AF100，Scotsman公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma Series II WaterJacketed，美國Thermo Electron公司），pH計（TOLEDO 320，瑞士METTLER公司），倒置顯微鏡（Olympus公司），超凈工作臺（Heraeus公司），氣浴恒溫振蕩器（THZ-82，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠），ALl04型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），臺式高速冷凍離心機（Centrifuge 5415，Eppendorf公司），Spectramax M2酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

1.2 試劑與藥品

研究中使用的試劑和藥瓶有：水蘇堿（純度＞98.0%），購自中國藥檢所；MPP+、西咪替丁、奎尼丁和氯雷他定購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自美國GIBICO公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；水為18 MΩ超純水；乙腈為色譜純，購自美國默克公司；其他試劑均為分析純。

水蘇堿單體溶于DMSO，配成一定濃度儲備液。氯雷他定內(nèi)標溶液配制方法是，精密稱取氯雷他定粉末100.0 mg，置于10.0 mL的DMSO中溶解，取適量儲備液用乙腈稀釋至內(nèi)標溶液的質(zhì)量濃度為100 ng/mL。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT2、MDCK-hOCT3 和mock細胞由本實驗室成功構(gòu)建，當細胞生長至融合度達到90%時，用體積分數(shù)為0.25%胰酶將細胞消化并傳代。

2.2 水蘇堿對甲基苯吡啶（MPP+）攝取MDCK-hOCTs細胞的作用

將MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT2、MDCK-hOCT3細胞按密度1×105/孔接種于24孔板，生長3 d后，進行水蘇堿對MPP+在細胞上積聚的實驗。將細胞培養(yǎng)液棄除，用37℃的HBSS清洗24孔板2遍，再在37℃溫度下預孵育10 min后，棄去孵育液；對照組加入1 μmol/L MPP+的HBSS（pH7.4）200 μL，水蘇堿物質(zhì)的量濃度為 0.001～100 μmol/L。37 ℃孵育后迅速將孵育液棄去，用冰浴中的PBS洗3遍24孔板來終止細胞積聚反應，再用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的SDS裂解孔內(nèi)細胞，反復吹打細胞，收集裂解液，放離心管中。在裂解液中加入乙腈溶液（含內(nèi)標氯雷他定）沉淀蛋白，漩渦震蕩、離心，取上清液分析檢測MPP+。另取SDS細胞裂解液，采用商品化BCA試劑盒測定每孔細胞的總蛋白量。每個樣品的細胞攝取結(jié)果用每孔蛋白總量來校正[1-2]。

2.3 OCTs抑制劑對水蘇堿細胞攝取的作用

將MDCK-hOCT1、MDCK-hOCT2、MDCK-hOCT3細胞按密度1×105/孔接種于24孔板，生長3 d后，進行OCT1、OCT2、OCT3抑制劑對水蘇堿在細胞攝取的抑制實驗。棄去細胞培養(yǎng)液，用37℃的HBSS洗2遍板，37℃預孵育后將孵育液棄去。對照組加入水蘇堿，物質(zhì)的量濃度為1 μmol/L，抑制組加入相同濃度水蘇堿和陽性抑制劑100 μmol/L（OCT1：奎尼丁；OCT2：西咪替?。籓CT3：奎尼?。?7℃孵育設定的時間后，迅速將孵育液棄去，用冰浴中的PBS洗3遍來終止細胞積聚反應，0.1%的SDS裂解后，以下步驟同“2.2”所述操作步驟。

3 結(jié)果

結(jié)果表明，水蘇堿對MPP+在MDCK-hOCTs細胞上攝取的抑制有一定的作用，如圖1所示：OCT1、OCT2、OCT3的IC50值分別為30.52μmol/L、35.35μmol/L、42.25μmol/L。進一步對水蘇堿在3種細胞及mock細胞中的積聚進行研究，發(fā)現(xiàn)在這3種細胞的積聚無顯著差異，而水蘇堿在細胞中的積聚高于mock細胞。為了進一步驗證水蘇堿是否為hOCTs的底物，我們考察了OCTs的經(jīng)典抑制劑對水蘇堿在hOCTs細胞上攝取的抑制情況。結(jié)果顯示，如圖2所示，水蘇堿不可以被OCTs的抑制劑奎尼丁、西咪替丁抑制，提示水蘇堿不是hOCTs的底物。

圖2 OCTs的抑制劑西咪替丁、維拉帕米對水蘇堿在hOCTs細胞上攝取的抑制作用

4 討論

目前，國內(nèi)外有關水蘇堿的研究主要集中在水蘇堿的分布、制備、測定和藥理作用這幾個方面。

4.1 水蘇堿的分布方面[3]

水蘇堿主要存在于白花菜科（Capparidaceae）、唇形科（Labiatae）、蕓香科（Rutaceae）、豆科（Leguminosae）和菊科（Compositae）植物中。外國研究人員在衛(wèi)矛科植物的提取物中也發(fā)現(xiàn)了水蘇堿，不僅不同植物中水蘇堿的含量相差比較大，而且同種植物中水蘇堿的含量也有很大差異。出現(xiàn)這種情況的主要原因是，同種植物生長在不同地區(qū)，植物生長的環(huán)境不同（比如氣候、土壤、植被）。例如，研究中發(fā)現(xiàn)，益母草全草的提取物中水蘇堿含量差異較大，少者產(chǎn)于酸性土壤的南方地區(qū)，水蘇堿含量只有大約0.59%；而多者產(chǎn)于堿性土壤的北方地區(qū)，水蘇堿含量高達1.72%.另外，同一株益母草中不同部位水蘇堿的含量也有差異，其中，繁殖部位的水蘇堿含量最高，第二位是葉，莖中含量最低。通過研究熟悉益母草中水蘇堿的含量，它是隨益母草部位、生長時期和產(chǎn)地等條件的不同而不同，這對于確定益母草的最佳采收地和采收期有很大幫助。

4.2 水蘇堿的制備方面

目前，提取水蘇堿時主要有操作簡單的超聲提取法、先進的索氏提取法和最經(jīng)典的加熱回流法，其中，以超聲提取法操作工藝最為簡單[4]，既不需要加熱，也不需要回流，提取效率也比較高，因此，應用頻繁。

4.3 水蘇堿的測定方面

近年來，對于水蘇堿含量的測定，多采用高效液相與其他技術聯(lián)用的方法，比如張彥飛等人[5]用高效液相色譜—蒸發(fā)光散射檢測器法測定中藥茺蔚子中鹽酸水蘇堿的含量。

4.4 水蘇堿的藥理作用方面

劉紅燕等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，水蘇堿能夠減輕過氧化氫所致腎小管上皮細胞損傷。國外又有報道稱，水蘇堿能改善血液流變學，降低血液黏稠度[7]。

綜上所述，研究人員在水蘇堿的以上幾個方面做了大量工作，鑒于水蘇堿醫(yī)藥方面的應用價值，所以，仍需進一步研究水蘇堿的藥動學、藥效學機理，特別是水蘇堿在體內(nèi)過程的發(fā)展變化，這些對于其開發(fā)和應用有非常重要的意義。

［1］Urakami Y，Okuda M，Masuda S，et al.Functional characteristics and membrane localization of rat multispecific organic cation transporters，OCT1 and OCT2，mediating tubular secretion of cationic drugs［J］.J Pharmacol Exp Ther，1998，287（2）：800-805.

［2］Sato T，Masuda S，Yonezawa A，et al.Transcellular transport of organic cations in double-transfected MDCK cells expressing human organic cation transporters hOCT1/hMATE1 and hOCT2/hMATE1［J］.Biochem Pharmacol， 2008（76）：894-903.

［3］李林.水蘇堿的研究概況［J］.安微農(nóng)業(yè)科學，2009，37（3）：931.

［4］任江劍，徐建中，王志安.HPLC法測定鮮益母草中鹽酸水蘇堿含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2006，17（3）：216-218.

［5］張彥飛，李智萌，蔡廣知，等.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定中藥茺蔚子中鹽酸水蘇堿的含量［J］.中國醫(yī)藥導報，2015，12（15）：124-127.

［6］劉紅燕，王瑞，石明，等.小劑量鹽酸水蘇堿對過氧化氫所致腎小管上皮細胞凋亡的保護作用［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2008，9（9）：760-763.

［7］李曉楠，陳佳音，孫曉琳，等.有機陽離子轉(zhuǎn)運體的研究進展［J］.中國臨床藥理學與治療學，2013，18（8）：954-960.

〔編輯：白潔〕

R969.1

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2017.23.001

2095－6835（2017）23－0001－03

2015年度高校國內(nèi)訪問學者專業(yè)發(fā)展項目“有機陽離子轉(zhuǎn)運體與水蘇堿相互作用研究”（編號：123）