李金勇,張士彥,李 娜,顏 鈁,唐 琳(四川大學 生命科學學院 能源植物生物燃油制備及利用國家地方聯(lián)合工程實驗室,四川 成都610064)

麻瘋樹油脂皂基的抑菌及皮膚刺激性試驗研究

李金勇,張士彥,李 娜,顏 鈁,唐 琳
(四川大學 生命科學學院 能源植物生物燃油制備及利用國家地方聯(lián)合工程實驗室,四川 成都610064)

利用麻瘋樹油脂及其葉乙醇提取物作為原料,采用正交試驗方法,考察氫氧化鈉濃度、皂化溫度、攪拌時間對皂基總游離堿含量的影響,確定最佳皂化條件,并制得含有和不含有麻瘋樹葉乙醇提取物的兩種皂基。配制濃度梯度為10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、30mg/mL的皂液,利用濾紙片法考察這兩種皂基對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的抑菌效果。以配制濃度為50mg/mL的皂液進行家兔皮膚刺激性試驗,考察對皮膚的刺激效果。結果顯示：氫氧化鈉濃度為12%、皂化溫度為40℃、攪拌時間為15min時的條件最佳,且總游離堿含量最低為0.30%。兩種皂液對白色念珠菌無抑菌效果,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯的抑菌效果。隨著濃度增加,抑菌效果呈現(xiàn)增強的趨勢,有無麻瘋樹葉乙醇提取物在抑菌效果上沒有明顯差異。皮膚刺激性試驗表明,這兩種皂液對家兔皮膚有輕微刺激性,但含有麻瘋樹葉乙醇提取物的皂液對家兔皮膚刺激性較弱。

麻瘋樹;皂基;正交試驗;抑菌;皮膚刺激

麻瘋樹(JatrophacurcasL.)為大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬植物[1],主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。據(jù)報道[2],麻瘋樹具有一定的藥用和藥理特性,可治療一些常見疾病。近年研究發(fā)現(xiàn),麻瘋樹葉提取物具有體外抗病毒[3]和殺菌的作用[4,5]。

麻瘋樹的種仁含油量高達60%以上,含有棕櫚酸、硬脂酸等飽和脂肪酸和油酸、亞油酸、棕櫚油酸等不飽和脂肪酸[6]。由于油脂中含有大量的有毒成分,特別是佛波酯[7]限制了它在食用油工業(yè)的應用,因此近年來麻瘋樹的應用研究主要集中在生物柴油上。經四川大學生命科學學院研究[8],從麻瘋樹果實中制備的新型燃油可適用于各種柴油發(fā)動機,并在閃點、凝固點、硫含量、一氧化碳排放量、顆粒值等關鍵技術上優(yōu)于國內零號柴油。李沁玲等[9]利用小蘇打作為反應試劑,采用正交試驗法探索了麻瘋樹餅粕的最佳脫毒條件，在此條件下實現(xiàn)了良好的脫毒效果,而且對餅粕中原有的營養(yǎng)成分不構成較大的破壞,為麻瘋樹在脫毒飼料上的應用提供了技術支撐。

麻瘋樹籽油不僅可提煉制成生物柴油,還可作為制皂的原料[10]。Rangwala Juzer Ali、Sarasan Geetha[11]利用麻瘋樹油脂制得肥皂,其總脂肪物、總游離堿、pH等指標符合當?shù)貥藴?被認定為三級肥皂,可用于人們日常洗浴。Mak-Mensah E E、Firempong C K在研究中指出[12],麻瘋樹油脂可制造藥皂或化妝品的洗浴皂,對皮膚有一定的保護作用。

傳統(tǒng)的藥皂是以牛油、椰子油或其他油脂和少量發(fā)泡劑、燒堿等原料制成,并額外加入法定含量的殺菌劑,具有清潔去污和殺菌的作用,可保護皮膚健康、預防疾病。常見傳統(tǒng)藥皂分為酚類藥皂、硼酸類藥皂和硫磺類藥皂[13]。在皂基中加入酚類化合物如苯酚等制成的藥皂為酚類藥皂,這類藥皂對皮膚刺激性較強,皮膚敏感者或有小傷口的人不宜使用,且該類藥皂殺滅真菌的效果相對較差。如今開發(fā)的新產品,如滴露、舒膚佳等品牌藥皂中使用的即是酚類殺菌劑。硼酸類藥皂是在皂基中加入一定量的硼酸制成,但硼酸的消毒能力相對較弱,僅能抑制部分細菌的繁殖,對病毒、寄生蟲等束手無策,較適合普通的皮膚消毒。硫磺類藥皂是在皂基中加入硫磺,在洗浴時產生硫化氫和五氯硫磺,可殺滅螨蟲、疥蟲等寄生蟲和部分真菌等,對疥瘡有輔助療效。但硫磺皂抑制皮膚分泌的作用較強,使用后皮膚可能變得干燥。麻瘋樹油脂中含有天然的抗菌成分,由麻瘋樹油脂制得的皂基不但具有抗菌效果,而且在成品皂的生產過程中不添加抗菌劑,生產過程簡單，大大降低了生產成本,因此研究麻瘋樹油脂制備皂基具有一定的應用意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

麻瘋樹籽油來自云南神宇新能源公司；成熟的麻瘋樹葉片,晾干備用；白色念珠菌(ATCC10231)、金黃色葡萄球菌(ATCC6583)、大腸埃希氏菌(ATCC25922)凍干菌種(含復蘇液)購于廣東環(huán)凱生物科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基在無菌條件下配置備用；成年家兔8只,雌雄各1/2,由四川大學動物實驗中心提供；25mm×25mm紗布塊,由青島海諾生物工程有限公司提供。

阿莫西林、鹽酸伊曲康唑購于四川大學校醫(yī)院；無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、氫氧化鉀、硫酸、酚酞均為國產分析純；雙蒸水；活性炭；電子秤ESJ120-4(精度0.0001g)、MS300型磁力攪拌器、酒精計、恒溫水浴鍋、無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋。

1.2 試驗方法

皂基的制備:①溶液的配置。精確稱取氫氧化鈉6.7g,分別加入40%乙醇溶液40mL、50mL、60mL,配置成濃度為14%、12%、10%的氫氧化鈉溶液以備用。0.3mol/L的硫酸標準滴定溶液按GB/T 601-2002[14]中的4.3配置,0.1mol/L的氫氧化鉀—乙醇標準滴定溶液按GB/T 601-2002中的4.24配置,10g/L酚酞指示液按GB/T 603-2002[15]中的4.1.4.12配置。②正交試驗設計。選取反應液氫氧化鈉的濃度(A)、皂化溫度(B)、攪拌時間(C)作為考察因素,設計3水平進行皂化反應,自然干燥得皂基后,以皂基中總游離堿含量為考察指標,利用L9(34)的實驗表設計正交試驗。每次試驗稱取麻瘋樹籽油50g,按QB/T 2623.2-2003[16]方法測定皂基中總游離堿的含量,因素水平見表1。③麻瘋樹葉乙醇提取物的提取。稱取干燥粉碎的麻瘋樹葉68g,加入20倍質量倍數(shù)的40%的乙醇溶液,浸提60h后過濾,用8%—10%質量倍數(shù)的活性炭吸附色素3h后過濾得麻瘋樹葉乙醇提取物。④皂化過程。稱取氫氧化鈉6.7g,利用正交試驗得出的最佳條件進行皂化反應得不含有麻瘋樹葉乙醇提取物皂基。另稱取氫氧化鈉6.7g,用麻瘋樹葉乙醇提取物溶解后,同上方法皂化得含有麻瘋樹葉乙醇提取物皂基。將兩種皂基放在室溫下20—30天,自然干燥成型。

表1 正交試驗因素水平

抑菌試驗:①菌懸液的制備。將實驗菌種按照按使用說明書進行菌種復蘇并傳代培養(yǎng)至第三代,采用梯度稀釋平板法制備濃度在107—108cfu/mL的菌懸液備用。②樣品制備。用無菌生理鹽水將兩種皂基配置成濃度梯度為10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、30mg/mL的皂液作為實驗組,以阿莫西林(10mg/mL)、鹽酸伊曲康唑(10mg/mL)為陽性對照組、無菌生理鹽水為空白對照度。③試驗方法。在無菌條件下,采用濾紙片法[17]進行抑菌試驗操作,每次吸取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌懸液100μL均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,吸取白色念珠菌菌懸液100μL均勻涂布在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上,每組試驗采樣濾紙片(直徑6mm)8次。分別在37℃、28℃下培養(yǎng)24h、48h,測量并記錄抑菌圈大小,求取平均值,結果見表2、表3。

表2 不含麻瘋樹葉乙醇提取物皂液的抑菌效果

表3 含有麻瘋樹葉乙醇提取物皂液的抑菌效果

皮膚刺激性試驗:①樣品制備。用無菌生理鹽水將這兩種皂基配置成50mg/mL的皂液為實驗組,無菌生理鹽水為對照組,采用自身對照。②試驗方法。試驗采用健康、背部皮膚無損的新西蘭白兔8只,雌雄各半,體重2—3kg,每組各4只。試驗前24h將實驗動物背部脊柱兩側毛剪掉,去毛范圍為10cm×15cm,作為試驗和觀察部位；再將制備好的兩種皂液分別吸取0.5mL直接涂在試驗接觸部位(圖1),對照組接觸部位涂抹無菌生理鹽水。用25mm×25mm透氣性好的紗布塊覆蓋接觸部位包扎帶固定4h后,除去敷貼物,用溫水洗凈拭干并分別在1h、24h、48h和72h觀察涂抹部位有無紅斑和水腫情況。③評價方法及標準。按衛(wèi)生部2007版《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》[18]中皮膚刺激反應評分方法,根據(jù)每只動物涂拭區(qū)皮膚是否形成紅斑、水腫及其程度,分別判為0—4分。急性皮膚刺激性試驗根據(jù)1h、24h、48h和72h各觀察點最高積分均值[即：(紅斑積分+水腫積分)/受試動物數(shù)]進行評價。皮膚刺激強度以積分均值的大小進行判定:0—0.4為無刺激性,0.5—1.9為輕刺激性,2.0—5.9為中刺激性,6.0—8.0為強刺激性。

圖1 皮膚應用部位

2 試驗結果

2.1 正交試驗結果

L9(34)正交試驗設計與結果見表4。按QB/T 2623.2-2003規(guī)定以兩次平行測定總游離堿結果的算術平均值表示至小數(shù)點后兩位作為測定結果。在重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不大于0.05%,以大于0.05%的情況下不超過5%為前提作為其精密度。

由表4可知,兩次平行試驗絕對差值均未超過5%,在其精密度范圍之內。由極差R可知,各因素對總游離堿含量的影響程度為氫氧化鈉濃度(A)gt;皂化溫度(B)gt;攪拌時間(C)。以每個因子在每個水平下的均值K 可以看出,在第二水平上,其總游離堿含量最低,因此結合正交試驗結果可知最佳皂化條件為A2B2C2,即氫氧化鈉濃度為12%、皂化溫度為40℃、攪拌時間為15min,此時總游離堿含量最低為0.30%。

表4 L9(34)正交試驗設計與結果

2.2 抑菌試驗結果試驗

測得兩種皂液的平均抑菌圈大小見表2、表3。兩種皂液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的抑菌效果,在10—30mg/mL濃度范圍內,兩種皂基對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果隨濃度的增大都呈現(xiàn)增強的趨勢，但對白色念珠菌則無抑菌效果。抑菌圈均值隨濃度的關系見圖2、圖3。圖2、圖3可見,有無麻瘋樹葉乙醇提取物的皂基在對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果上無明顯差異。

圖2 不含麻瘋樹葉乙醇提取物皂液抑菌圈均值與濃度的關系

圖3 含有麻瘋樹葉乙醇提取物皂液抑菌圈均值與濃度的關系

2.3 皮膚刺激試驗結果

兩種皂液對家兔皮膚在1h、24h、48h、72h觀察點處積分均值和刺激強度的結果見表5、表6。結果顯示,兩種皂液對家兔單次皮膚刺激試驗均出現(xiàn)輕微刺激反應,對照組家兔皮膚無異常發(fā)現(xiàn)。1h兩組家兔皮膚均出現(xiàn)明顯紅斑和輕微水腫,24h水腫消退,但紅斑無明顯消退跡象。48h和72h紅斑依然存在,較1h和24h相比,紅斑有所減輕但依然肉眼可見。

表5 含有麻瘋樹葉提取皂液對家兔急性皮膚刺激性試驗結果

表6 不含麻瘋樹葉提取物皂液對家兔急性皮膚刺激性試驗結果

3 結論與討論

本文首先利用三因素三水平正交試驗探究麻瘋樹油脂制備皂基的最佳皂化條件,以麻瘋樹籽油和麻瘋樹葉乙醇提取物為原料結合最佳皂化條件,制備出含有與不含有麻瘋樹葉乙醇提取物兩種皂基,并對其抑菌效果和對皮膚刺激做出探究,為麻瘋樹油脂皂基制備成品肥皂提供基礎資料。

通過正交試驗對皂化條件進行優(yōu)化,試驗結果顯示各因素對總游離堿含量影響的大小為:氫氧化鈉濃度gt;皂化溫度gt;攪拌時間。結合極差和均值的分析,皂化的最佳條件是A2B2C2,即氫氧化鈉濃度為12%、皂化溫度為40℃、攪拌時間為15min,此時總游離堿含量最低為0.30%。抑菌試驗顯示,兩種皂液對白色念珠菌均無抑菌效果,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯的抑菌效果,且隨著濃度的增大抑菌效果呈現(xiàn)增強的趨勢,有無麻瘋樹葉乙醇提取在抑菌效果上無明顯差異。家兔急性皮膚刺激試驗表明,這兩種皂液對家兔皮膚有輕微刺激性,含有麻瘋樹葉乙醇提取物的皂液對家兔皮膚刺激相對溫和。

總之,急性皮膚刺激試驗結果從動物外推到人的可靠性有限,白色家兔在大多數(shù)情況下對有刺激性或腐蝕性的物質較人類敏感,且試驗中使用封閉式接觸是一種在超常規(guī)實驗室條件下的試驗,人類在實際使用化妝品或洗浴用品過程中很少存在這種接觸方式。毒性方面,Makkar H P S等人[19]利用甲醇溶劑結合磁力攪拌器進行提取,并對料液比、時間、溫度方面做出優(yōu)化,可提取出幾乎不含佛波酯的麻瘋樹油脂,為麻瘋樹油脂的安全無毒提供了有力保障。

麻瘋樹油脂皂基在制作過程中不會破壞甘油的有效成分,并將其最大限度的保留,其制備的成品皂在清潔的同時可以形成一層保護膜,達到對肌膚良好的保濕效果。

麻瘋樹油脂皂基中總游離堿是由皂化后殘余的堿產生，總游離堿含量不宜過高(含量低于1%)。而由麻瘋樹油脂按最優(yōu)條件皂化其總游離堿含量只有0.3%,完全符合總游離堿含量標準。另外，麻瘋樹油脂具有天然抗菌活性,皂基制備過程中不需要額外添加抗菌劑,使得生產操作得以簡單化并大大降低了生產成本,并且對皮膚的刺激性較溫和,有一定的保濕效果。因此，利用麻瘋樹油脂制皂是可行的,特別是在生產制備藥皂上具有廣闊的應用前景。

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BacteriostasisandSkinIrritationTestResearchofJatrophacurcasL.OilSoap

LI Jin-yong,ZHANG Shi-yan,LI Na,YAN Fang,TANG Lin
(National Local Joint Engineering Laboratory for Energy Plant Bio-oil Production and Application,College of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610064,China)

UsingJatrophacurcasL. oil as well asJatrophacurcasL.leaves ethanol extract as raw material,and orthogonal experiment was carried out to investigate the effects of NaOH concentration,saponification temperature and stirring time on the soap tatol free alkali,determined the optimum conditions of saponification,and preparation of two kinds of sopa cotaniningJatrophaleaves ethanol extract and excludingJatrophacurcasL.leaves ethanol extract.Preparation concentration gradient was 10mg/mL,15mg/mL,20mg/mL,30mg/mL soap liquid respectively,filter method was used to examine the antibacterial effect of the Staphylococcus aureus,E.coli,Candida albicans.Preparation concentration was 50mg/mL of soap liquid for the rabbit acute skin irritation test to measure theJatrophaoil soap stimulation to the skin effect.The results showed that the concentration of NaOH was 12%,saponification temperature was 40℃,the stirring time was 15min which was the best condition,and the total free alkali for a minimum of 0.30%.Two soaps on Candida albicans had no antimicrobial effect,onStaphylococcusaureusandE.colihad obvious bacteriostatic effect.Bacteriostatic effect with the increase of the concentration showed a trend of increase,there was no obvious difference on the bacteriostasis effect for the presence ofJatrophacurcasL.leaves ethanol extract or not.Skin irritation test showed that these two kinds of soap with mild irritation to rabbit skin,and cotaniningJatrophacurcasL.leaves ethanol extract soap to rabbit skin irritation would weaken.

JatrophacurcasL.;soap;orthogonal test;bacteriostatic;skin irritation

10.3969/j.issn.1005-8141.2017.04.017

Q949.97；Q949.753.5

A

1005-8141(2017)04-0473-04

2017-02-06；

2017-03-23

四川省科技支撐計劃項目(編號：2011JZ0002)資助。

李金勇(1990-),男,安徽省合肥人,碩士研究生,研究方向為天然產物應用。

唐琳(1966-),女,四川省成都人,博士,副教授,主要從事資源植物學與植物生物技術等研究工作。