周炳文，樓燁亮，鐘曉明，黃 真

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

研究表明，腦缺血發(fā)生后，缺血區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，神經(jīng)細(xì)胞凋亡與腦缺血疾病具有密切的聯(lián)系[1]。線粒體作為調(diào)控真核細(xì)胞生命活動的中心，其不僅是細(xì)胞的供能場所，且是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用[2]。因此，保證線粒體生理功能的完整性對急性腦缺血的治療具有重要意義。細(xì)胞凋亡主要有內(nèi)源性的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑以及外源性的死亡受體途徑3種。內(nèi)源性的線粒體途徑又包括caspase依賴性及caspase非依賴性細(xì)胞凋亡途徑兩種[3]。線粒體介導(dǎo)的非caspase依賴凋亡通路主要為當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部凋亡刺激因子作用后，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)與核酸內(nèi)切酶G(endonuclease G，Endo G)可由線粒體釋放到胞質(zhì)，并最終進(jìn)入細(xì)胞核，引起DNA的破壞，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，哈巴苷對急性腦缺血具有保護(hù)作用，且其作用可能與caspase依賴性細(xì)胞凋亡通路相關(guān)[5-6]。本研究采用多指標(biāo)研究哈巴苷抗急性腦缺血的作用機(jī)制，為哈巴苷應(yīng)用于臨床治療腦缺血疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物ICR小鼠，SPF級，♂，體質(zhì)量23～25 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號：SCXK(滬)：2013-2016。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22-25℃，相對濕度45%～70%，晝夜周期12 h/12 h，喂以普通飼料，自由飲水。

1.2藥物與試劑哈巴苷(批號：15030621，上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；依達(dá)拉奉(批號：86-141106，南京先聲東元制藥有限公司)；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(批號：6033840，美國BD公司)；JC-1探針粉末(批號：MKBZ3766V，美國Sigma公司)；線粒體蛋白提取試劑盒(批號：20151228，凱基生物技術(shù)股份有限公司)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(批號：10121，北京康為生物科技有限公司)；5×蛋白上樣緩沖液(批號：LMYG 15502，杭州諾森德生物技術(shù)有限公司)；預(yù)染蛋白Marker(批號：00135995，美國賽默飛世爾科技有限公司)；AIF兔抗人單克隆抗體(批號：ab32516)、Endo G兔抗人單克隆抗體(批號：ab76122)、β-actin單克隆抗體(批號：3700S-10)，均購自美國Abcam公司；山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗(批號：C50113-05、C50331-05，美國LI-COR公司)；Mini BEST Universival RNA提取試劑盒、Prime ScriptTMRT-PCR試劑盒、Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(批號：AK901、AK4102、AK7509，日本TaKaRa公司)；其余試劑均為分析純。引物由上海生物工程有限公司提供，引物序列見Tab 1。

Tab 1 qPCR primer sequence

1.3儀器Centrifuge5804R高速冷凍離心機(jī)、Master cycler nexus gradient梯度PCR儀(德國Eppendorf公司)；Accuri C6小型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；EM UC7 超薄切片機(jī)(德國徠卡公司)；H-7650透射電鏡(日本HITACHI公司)；PowerWaveX340型酶標(biāo)儀(美國BioTek儀器有限公司)；MiniT-H2C型恒溫金屬浴(杭州奧盛儀器有限公司)；Odyssey熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)；Onedrop微量紫外分光光度計(jì)(美國Merinton公司)；ABI 7500/7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)動物分組、造模及給藥實(shí)驗(yàn)前，小鼠禁食不禁水12 h，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉3.2 mg·kg-1組及哈巴苷4、8、12 mg·kg-1組。腹腔注射4%水合氯醛(10 mL·kg-1)麻醉，參考改進(jìn)的Zea Longa法[7]建立小鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。各組小鼠造模后立即經(jīng)尾靜脈注射相應(yīng)藥物(10 mL·kg-1)，假手術(shù)組及模型組同法給予等量生理鹽水。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測MCAO小鼠缺血側(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率造模6 h后立即斷頭取腦，無菌條件下快速分離MCAO小鼠缺血側(cè)海馬，D-Hank’s漂洗2遍后，用眼科剪剪成1 mm3的組織塊，于37℃條件下，邊震蕩邊胰酶消化30 min后，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，沉淀用DMEM完全培養(yǎng)基重懸，300目濾網(wǎng)過濾得單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)。取5～10萬細(xì)胞，1 000 r·min-1，離心5 min，取沉淀，PBS洗滌2次后，按AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說明書方法進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測MCAO小鼠缺血側(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位按“2.2”項(xiàng)下方法制備海馬神經(jīng)單細(xì)胞懸液。取5～10萬細(xì)胞，1 000 r·min-1，離心5 min，取沉淀，PBS洗滌2次，加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育15 min。37℃孵育結(jié)束后，600×g，4℃離心5 min，取沉淀，PBS洗滌2次。500 μL PBS緩沖液重懸后，流式細(xì)胞儀檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體的膜電位變化。

2.4透射電鏡觀察MCAO小鼠缺血側(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)造模6 h后，將小鼠麻醉固定，拔出線栓，打開小鼠胸腔，暴露心臟，將灌注針頭插入左心室，剪開右心耳。首先使用生理鹽水進(jìn)行快速灌注，直至小鼠四肢、兩肺及肝臟變白且灌注液變清后，換成4%多聚甲醛+1%戊二醛進(jìn)行灌注，剛開始灌注時(shí)老鼠前后肢劇烈抽動，尾部翹起并逐漸變僵硬，灌注時(shí)間10～15 min。灌注結(jié)束后，斷頭取出整個(gè)大腦組織。分離缺血側(cè)海馬組織，并取1 mm3大小的組織塊，立即放入含有2.5%戊二醛溶液的離心管內(nèi)4℃固定，固定過夜后使用常規(guī)電鏡樣品方法處理。包埋好的樣品采用超薄切片機(jī)切片，片厚70 nm，該切片經(jīng)醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色1 h以及檸檬酸鉛溶液染色15 min后，于透射電鏡下觀察。

2.5Westernblot法檢測線粒體中AIF及EndoG的蛋白表達(dá)造模6 h后，各組小鼠脫頸處死，立即于冰上取大腦，仔細(xì)分離左側(cè)大腦皮層及海馬組織，按線粒體蛋白提取試劑盒說明書分別制備線粒體蛋白提取液及胞質(zhì)蛋白提取液。按BCA蛋白定量試劑盒說明書定量蛋白，并以PBS調(diào)整蛋白濃度一致，加入5×上樣緩沖液(蛋白液 ∶5×上樣緩沖液=4 ∶1)后，100℃變性10 min，室溫冷卻后，4℃保存?zhèn)溆谩Ｃ坑镜酪?0 μg蛋白上樣，AIF及Endo G經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(以β-actin為內(nèi)參照)，待目的蛋白電泳至距膠上側(cè)2/3位置時(shí)停止電泳。100 V、轉(zhuǎn)膜110 min，將蛋白從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)至0.22 μm PVDF膜上。5% BSA封閉2 h后，TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min。分別加入AIF兔抗人單克隆抗體稀釋液(1 ∶5 000)、Endo G兔抗人單克隆抗體稀釋液(1 ∶1 000)，4℃過夜。TBST緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次5 min；加入兔二抗，于搖床上室溫孵育2 h后，TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min，用Odyssey熒光掃描成像系統(tǒng)對蛋白結(jié)果進(jìn)行分析。以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值的比值作為樣品中目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.6qPCR法檢測MCAO小鼠海馬組織中AIF及EndoGmRNA的表達(dá)造模6 h后立即斷頭取腦，置于培養(yǎng)皿中以生理鹽水清洗干凈，濾紙吸干表面液體。立即按TaKaRa RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA。使用Onedrop微量紫外分光光度計(jì)測定總RNA的濃度和純度。按TaKaRa Prime ScriptTMRT-PCR試劑盒說明書步驟將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按TaKaRa?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書進(jìn)行qPCR反應(yīng)。qPCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7 min。以2-△△CT方法分析基因的相對表達(dá)量，以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1哈巴苷對MCAO小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的影響如Tab 2、Fig 1所示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，哈巴苷各劑量組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。

Tab 2 Effects of harpagide on apoptosis of hippocampal neurons in MCAO mice(±s, n=6)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 1 Effects of harpagide on apoptosis of hippocampal neurons in MCAO mice

A: Control; B: Model; C: Edaravone 3.2 mg·kg-1; D: Harpagide 4 mg·kg-1; E: Harpagide 8 mg·kg-1; F: Harpagide 12 mg·kg-1

3.2哈巴苷對MCAO小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位的影響如Tab 3、Fig 2所示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，哈巴苷4、8、12 mg·kg-1組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位均明顯增加(P<0.01)。

Tab 3 Effects of harpagide on mitochondrial membrane potential of hippocampal neurons in MCAO mice(±s，n=6)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3.3哈巴苷對MCAO小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響與假手術(shù)組相比，MCAO小鼠神經(jīng)元核膜皺縮，核染色質(zhì)密度增高，線粒體內(nèi)室擴(kuò)張，基質(zhì)變稀，電子密度明顯降低，線粒體結(jié)構(gòu)松散(呈空泡狀)，可見明顯腫脹，線粒體嵴短而少，移至邊緣或發(fā)生斷裂，可見溶酶體。與模型組相比，哈巴苷4、8、12 mg·kg-1能不同程度減輕MCAO小鼠缺血側(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷(Fig 3)。

3.4哈巴苷對MCAO小鼠腦組織線粒體中AIF及EndoG蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織線粒體中AIF及Endo G蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，哈巴苷4、8、12 mg·kg-1組小鼠腦組織線粒體中Endo G蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，哈巴苷8、12 mg·kg-1組小鼠腦組織線粒體中AIF蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。

3.5哈巴苷對MCAO小鼠腦組織線粒體中AIF及EndoGmRNA表達(dá)的影響如Tab 4所示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠海馬組織AIF及Endo G mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，哈巴苷8 mg·kg-1組小鼠海馬組織AIF及Endo G mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)。

Tab 4 Effects of harpagide on AIF, Endo G mRNA expression in hippocampus organization(±s, n=6)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Fig 2 Effects of harpagide on mitochondrial membrane potential of hippocampal neurons in MCAO mice

A: Control; B: Model; C: Edaravone 3.2 mg·kg-1; D: Harpagide 4 mg·kg-1; E: Harpagide 8 mg·kg-1; F: Harpagide 12 mg·kg-1

Fig 3 Effects of harpagide on ultrastructure of hippocampus neuron mitochondria in MCAO mice(×80 000)

A: Control; B: Model; C: Edaravone 3.2 mg·kg-1; D: Harpagide 4 mg·kg-1; E: Harpagide 8 mg·kg-1; F: Harpagide 12 mg·kg-1

Fig 4 Effects of harpagide on contents of AIF and Endo G in mitochondria

1: Control; 2: Model; 3: Edaravone 3.2 mg·kg-1; 4: Harpagide 4 mg·kg-1; 5: Harpagide 8 mg·kg-1; 6: Harpagide 12 mg·kg-1.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

4 討論

本實(shí)驗(yàn)所造的模型為永久性局灶性腦缺血模型，造模后立即尾靜脈給藥，同步觀察受試藥物對腦缺血急性期(6 h)的保護(hù)作用。有研究利用線栓法致大鼠MCAO模型，觀察缺血1、1.5、2、3、4、6、9、12、24 h后腦梗死體積的變化，發(fā)現(xiàn)缺血1、1.5 h組未發(fā)現(xiàn)梗死灶；缺血2 h組基底節(jié)區(qū)出現(xiàn)梗死灶，梗死灶邊界欠清，4 h組梗死體積明顯增大，且與時(shí)間呈正相關(guān)。在觀察局部腦血流變化時(shí)，缺血30 min時(shí)血流量開始下降，缺血1 h時(shí)，血流量下降為正常的42.2%，6 h時(shí)降為正常的8.5%，9 h時(shí)為正常的7.1%，缺血側(cè)腦血流已趨于平穩(wěn)，到12 h時(shí)幾乎已無變化。課題組前期研究了哈巴苷對MCAO 6、8、10 h等時(shí)間段的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)哈巴苷在MCAO 6 h具有明顯保護(hù)作用，8、10 h時(shí)間點(diǎn)有作用，但不及6 h[8]。綜上，權(quán)衡腦血流、腦梗死體積及哈巴苷在不同缺血時(shí)間的抗腦缺血作用等方面，所以在本實(shí)驗(yàn)選擇了MCAO 6 h。

眾多研究表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是目前公認(rèn)的腦缺血疾病中導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要機(jī)制，是梗死區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式。因此，抗凋亡治療已成為治療腦缺血疾病的重要途徑以及當(dāng)前腦缺血疾病研究的熱點(diǎn)[9]。本研究采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測MCAO小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率，評價(jià)哈巴苷對小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明，哈巴苷4、8、12 mg·kg-1均可明顯降低因缺血而增加的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提示哈巴苷的抗腦缺血作用可能與其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用相關(guān)。

當(dāng)細(xì)胞受到如缺血、缺氧等因素的刺激后，會發(fā)生一系列的病理改變，主要變化為線粒體膜去極化，線粒體膜電位下降后，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，MPTP)開放， Smac/DIABLO和Cyt C等從線粒體釋放出來，進(jìn)一步活化caspase家族蛋白，引起細(xì)胞凋亡。由此可見，線粒體膜電位的變化與細(xì)胞凋亡相關(guān)，研究線粒體膜電位的變化規(guī)律對腦缺血疾病的研究具有重要意義[10-11]。線粒體在哺乳動物維持正常的生理功能中發(fā)揮重要作用，其除產(chǎn)生ATP提供能量外，在維持鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞氧化還原狀態(tài)以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。Solenski等[12]發(fā)現(xiàn)，再灌注可加重缺血引起的線粒體腫脹、線粒體嵴斷裂、電子密度增加等改變。上述改變是線粒體功能障礙的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，腦缺血后，大量神經(jīng)細(xì)胞線粒體的損傷可直接引起該損傷區(qū)域腦組織的功能障礙，臨床表現(xiàn)為腦缺血損傷。本研究采用JC-1探針檢測MCAO小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞元的線粒體膜電位，采用透射電鏡觀察MCAO小鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，哈巴苷4、8、12 mg·kg-1可不同程度地增加MCAO小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的線粒體膜電位，減輕海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷，可見哈巴苷組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整，線粒體水腫程度明顯降低，線粒體嵴部分變短或斷裂，基質(zhì)密度與模型組相比較大。表明哈巴苷能在一定程度上通過上調(diào)腦缺血后造成的線粒體膜電位下降，以及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞線粒體生理結(jié)構(gòu)的完整性，發(fā)揮抗腦缺血作用。

線粒體介導(dǎo)的非caspase依賴性凋亡途徑主要為細(xì)胞受到某些因子刺激后，線粒體釋放AIF與Endo G到胞質(zhì)中，并最終進(jìn)入細(xì)胞核，引起 DNA片段化，直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。AIF的前體是在細(xì)胞質(zhì)合成后，再轉(zhuǎn)移到線粒體中的。在凋亡條件的誘導(dǎo)下，AIF先從線粒體轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)中，再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，在細(xì)胞核引起染色體凝聚和DNA大片段斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。與Cyt C不同，AIF誘導(dǎo)凋亡不依賴caspase。在慢性酒精中毒的大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中，可觀察到AIF蛋白表達(dá)明顯增加[14]。細(xì)胞凋亡過程中，線粒體內(nèi)膜釋放Endo G至胞質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，進(jìn)而引起DNA斷裂，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Endo G誘導(dǎo)的DNA降解可以在非依賴caspase的級聯(lián)反應(yīng)中觀察到，表明其在非依賴caspase細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用[15]。結(jié)果顯示，哈巴苷可明顯減少線粒體釋放AIF及Endo G至胞質(zhì)，表明哈巴苷可能通過抑制線粒體介導(dǎo)的caspase非依賴性細(xì)胞凋亡通路，發(fā)揮抗腦缺血作用。

本研究通過3個(gè)劑量組(4、8、12 mg·kg-1)來評價(jià)哈巴苷的抗腦缺血作用，8 mg·kg-1劑量組在小鼠腦神經(jīng)功能評分、腦含水量、腦指數(shù)以及大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量等指標(biāo)均顯示有明顯療效，與陽性藥組療效相當(dāng)，差異沒有顯著性[6]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了哈巴苷對MCAO小鼠神經(jīng)細(xì)胞及caspase非依賴性凋亡通路的影響。結(jié)果表明，8 mg·kg-1劑量組療效較4、12 mg·kg-1劑量組好，與陽性藥組療效相當(dāng)，兩者差異無顯著性。3個(gè)劑量組的作用效果呈現(xiàn)倒鐘狀趨勢，亦與大多數(shù)腦神經(jīng)藥物研究趨勢類似，可能與神經(jīng)藥物的作用機(jī)制有關(guān)，當(dāng)藥物作用靶點(diǎn)達(dá)到飽和的情況下，繼續(xù)增加藥物的劑量，治療效果降低。因此，本實(shí)驗(yàn)12 mg·kg-1劑量組的治療效果反而略低于8 mg·kg-1組。

綜上可得，本研究采用多指標(biāo)評價(jià)哈巴苷抗急性腦缺血的作用機(jī)制，結(jié)果表明哈巴苷可能通過保護(hù)大腦神經(jīng)細(xì)胞及其線粒體功能的完整性，以及抑制caspase非依賴性細(xì)胞凋亡通路，發(fā)揮抗腦缺血作用。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源研究所完成，感謝各位老師和同學(xué)在實(shí)驗(yàn)過程中給予的指導(dǎo)和幫助。)

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