任 丹，齊方圓，黃紫妍，秦路平，朱 波 （. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州， 30053；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽， 72046）

玄參別名元參、黑參、浙玄參等，為我國傳統(tǒng)大宗藥材，主產(chǎn)地為浙江、安徽、四川、貴州等地[1-2]。玄參，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，味甘、苦、咸，性微寒[3]；歸肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)的功效，常用于熱病傷陰，舌絳煩渴，津傷便秘、目赤、咽痛等癥[4-5]。環(huán)烯醚萜苷類是玄參的主要有效成分，包括哈巴苷、哈巴俄苷等，臨床上主要用于腦缺血、高血壓、糖尿病等疾病，具有抗炎、保護(hù)心血管、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[6-9]。

關(guān)于不同產(chǎn)地玄參有效成分含量測定的報道較少，僅有的報道也只集中在少數(shù)產(chǎn)地[10-11]。玄參藥材原植物生長環(huán)境差別大，不同的生境因子下藥材質(zhì)量參差不齊，且在栽培過程中，栽培品系繁多混雜，嚴(yán)重阻礙了玄參產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。2020版《中國藥典》規(guī)定將哈巴苷、哈巴俄苷作為玄參藥材的質(zhì)控成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明哈巴苷、哈巴俄苷具有保護(hù)心血管、保護(hù)神經(jīng)的藥理作用[12-13]。因此，課題組以哈巴苷和哈巴俄苷成分為指標(biāo)性成分，收集全國玄參15 個主產(chǎn)區(qū)玄參種質(zhì)資源，建立HPLC 法對其進(jìn)行含量測定，分析不同產(chǎn)地玄參環(huán)烯醚萜苷類成分之間的差異性，以期為玄參藥材質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材

2019 年11 月至2019 年12 月，收集浙江磐安、安徽譙城區(qū)、貴州陽溪、河南朱莊、四川隴東等15 個產(chǎn)地新鮮玄參種質(zhì)資源，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)教研室秦路平教授鑒定為玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensisHemsl.）的干燥根，信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地玄參樣品信息

1.2 儀器與試劑

Waters Alliance e2695 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司）；ZORBAX Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；XS105 型電子分析天平（梅特勒-多利多公司）；超純水儀（美國Millipore 公司）；DXF–60D 型中藥打粉機(jī)（廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司）；KQ–300DV 型超聲波（廣州穎漢科技有限公司）；DHG–9031A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信試驗儀器有限公司）。哈巴苷（B20481）、哈巴俄苷（B20480）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司。乙腈（色譜級，美國天地公司），磷酸（色譜級，上海阿拉丁公司），其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）–0.03%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（1～10 min，3%～10% A；10～20 min，10%～33% A；20～25 min，33%～50% A；25～30 min，50%～80% A；30～35 min，80% A；35～37 min，80%～3% A；37～42 min，3% A）；體積流量1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為10 μl；檢測波長為210、280 nm。色譜圖見圖1。

1.3.2 線性關(guān)系考察

精密稱取哈巴苷、哈巴俄苷對照品適量，用30%甲醇溶液制備成終質(zhì)量濃度為每1 ml 含哈巴苷0.6 mg、哈巴俄苷0.2 mg 的混合對照品溶液，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。分別精密吸取哈巴苷、哈巴俄苷混合對照品溶液0.34、0.67、1.00、1.40、1.70 ml 置于2 ml 容量瓶中，30%甲醇溶液定容至2 ml，吸取上述溶液適量，0.45 μm 微孔濾膜過濾，按“1.3.1”項下色譜條件依次進(jìn)樣。哈巴苷的檢測波長為210 nm，哈巴俄苷的檢測波長為280 nm。以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知哈巴苷與哈巴俄苷在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系考察

1.3.3 供試品溶液制備

將洗凈后的玄參根切片，置于60 ℃烘箱中烘至恒定質(zhì)量，粉碎后過3 號篩。精密稱取玄參根樣品粉末0.25 g，置于25 ml 具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 ml，密塞，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理45 min（300 W, 40 kHz），放冷，再稱定重量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足損失的重量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。按“1.3.1”項下色譜條件平行測定3 次。

1.3.4 精密度試驗

精密吸取哈巴苷、哈巴俄苷對照品溶液適量，按“1.3.1”項下色譜條件依次進(jìn)樣6 次，測得哈巴苷、哈巴俄苷峰面積RSD 分別為0.11%、0.09%，表明儀器精密度良好。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗

取浙江磐安樣品，按“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h，按“1.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測得哈巴苷、哈巴俄苷峰面積RSD 分別為0.24%、0.17%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.6 重復(fù)性試驗

取浙江磐安樣品6 份，按“1.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測得哈巴苷、哈巴俄苷含量的RSD 分別為0.59%、0.50%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.7 加樣回收率試驗

取含量已知的浙江磐安樣品，精密稱定0.125 g,加入哈巴苷、哈巴俄苷對照品適量，按“1.3.3”項下方法制備成供試品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應(yīng)用SPSS 19.0 軟件處理數(shù)據(jù)。方差分析采用單因素ANOVA 分析，聚類分析采用組間連接法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈巴苷與哈巴俄苷含量比較

15 個產(chǎn)地間玄參根中哈巴苷、哈巴俄苷的含量存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），結(jié)果見表4。哈巴苷、哈巴俄苷含量以及兩者總量分別為0.791、0.228、1.265 mg/g。四川隴東產(chǎn)哈巴苷含量最高、安徽譙城區(qū)含量最低；浙江磐安產(chǎn)哈巴俄苷含量最高，四川永富含量最低；四川隴東產(chǎn)哈巴苷與哈巴俄苷總量最高，杭州植物園最低,含量范圍在0.752～1.529 mg/g之間，均符合《中國藥典》2020 版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

表4 不同產(chǎn)地間玄參樣品中各成分含量測定結(jié)果（±s，n=3，mg/g）

表4 不同產(chǎn)地間玄參樣品中各成分含量測定結(jié)果（±s，n=3，mg/g）

**P<0.01，表示不同產(chǎn)地的哈巴苷或哈巴俄苷含量存在極顯著差異。

樣品 哈巴苷含量 哈巴俄苷含量 哈巴苷與哈巴俄苷總量S10.598±0.0030.852±0.0031.450±0.006 S20.979±0.0020.520±0.0041.499±0.006 S30.600±0.0070.152±0.0090.752±0.013 S40.625±0.0030.542±0.0031.167±0.004 S50.489±0.0020.831±0.0081.320±0.009 S60.558±0.0030.615±0.0061.173±0.009 S70.730±0.0210.626±0.0171.355±0.038 S80.921±0.0070.563±0.0061.484±0.002 S90.642±0.0040.655±0.0041.297±0.008 S101.147±0.0060.382±0.0021.529±0.008 S110.992±0.0160.036±0.0021.029±0.017 S120.560±0.0020.422±0.0010.983±0.002 S130.759±0.0060.385±0.0051.144±0.009 S141.120±0.0090.234±0.0151.355±0.024 S151.140±0.0070.297±0.2941.434±0.010均值0.791**0.228**1.265**

2.2 相關(guān)性分析

對不同產(chǎn)地之間中的有效成分與生境因子進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表5 所示，哈巴苷與海拔、降雨量、年平均溫度呈正相關(guān)關(guān)系，與海拔正相關(guān)系數(shù)最高為（0.440）；與經(jīng)度、緯度之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與經(jīng)度負(fù)相關(guān)系數(shù)最高為（–0.419）。哈巴俄苷與經(jīng)度、緯度呈正相關(guān)，與海拔、降雨量、年平均溫度呈負(fù)相關(guān)，與海拔負(fù)相關(guān)系數(shù)最高為（–0.360）。

表5 玄參中哈巴苷、哈巴俄苷含有量與生境因子相關(guān)性分析

2.3 聚類分析

以哈巴苷、哈巴俄苷含量以及兩者總量為參考指標(biāo)，對15 個產(chǎn)地玄參進(jìn)行聚類分析，根據(jù)歐式距離D2=19.98 將不同產(chǎn)地劃分為3 個類群，如圖2所示。類群I 共5 個產(chǎn)地，分別為浙江臨安，河南南豐，貴州陽溪、玉溪，四川隴東，該類玄參中哈巴苷含量、哈巴苷和哈巴俄苷總量最高；類群II 有8 個產(chǎn)地、分別為貴州洛龍，四川五龍，安徽利辛、譙城區(qū)、渦陽，浙江磐安，河南太丘、朱莊，這些產(chǎn)地哈巴俄苷含量次之；類群III 共有2 個產(chǎn)地，分別是四川永富和杭州植物園，這兩個產(chǎn)地的哈巴俄苷含量、哈巴苷和哈巴俄苷總量最低。

圖2 15 批玄參樣品聚類樹狀圖

3 討論與結(jié)論

本試驗采用高效液相法測定玄參哈巴苷與哈巴俄苷含量，經(jīng)PDA 檢測器對哈巴苷和哈巴俄苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行波長掃描，結(jié)果顯示，哈巴苷的最大檢測波長是210 nm，與溶劑甲醇的吸收波長一致，此處會有溶劑峰的出現(xiàn)，而哈巴俄苷的最大檢測波長是280 nm，此時基線平穩(wěn)，未與溶劑峰相重疊，因此，確定檢測波長為210 nm 和280 nm；采用2020 版《中國藥典》中哈巴苷與哈巴俄苷的含量測定的提取方法及流動相，結(jié)果顯示，提取、分離效果良好，哈巴苷與哈巴俄苷在甲醇中超聲處理45 min即可提取完全，各峰之間的分離度>1.5，理論塔板數(shù)>5 000，哈巴苷與哈巴俄苷的保留時間分別是10.107、24.116 min。

藥用植物的生長環(huán)境對次生代謝產(chǎn)物的積累起著非常關(guān)鍵的作用，包括經(jīng)緯度、海拔、降雨量等[14]。本實驗結(jié)果顯示，15 個產(chǎn)地玄參根中哈巴苷、哈巴俄苷的含量存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），其中四川隴東、河南南豐、浙江臨安、磐安含量最高；海拔、降雨量、年平均溫度與哈巴苷之間呈正相關(guān)，與哈巴俄苷呈負(fù)相關(guān)。課題組發(fā)現(xiàn)，浙江臨安、磐安的海拔分別是1 050 m、1 020 m，遠(yuǎn)高于杭州植物園的25 m，因此，臨安、磐安哈巴苷的含量要高于植物園，這與實驗結(jié)果一致；經(jīng)緯度與哈巴俄苷呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)較大，經(jīng)緯度越高，哈巴俄苷的含量就越大，四川隴東、永富、五龍的經(jīng)緯度低于安徽利辛、渦陽、譙城區(qū)，因此，前者的哈巴俄苷的含量低于后者。結(jié)果顯示，經(jīng)緯度越高越有利于哈巴俄苷的積累，降雨量越大，海拔越高，越有利于哈巴苷的積累，故可優(yōu)先在擁有上述環(huán)境條件的種質(zhì)中選擇。本實驗只對玄參中哈巴苷、哈巴俄苷的含量進(jìn)行測定，下一步將繼續(xù)增加其他活性成分的含量測定，為玄參的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。