朱頂紅中黃烷類(lèi)化學(xué)成分的研究

辛國(guó)松，李 鑫，薛沁冰，魏 馳，朱洪劍，厲增毅，趙 賀，季宇彬

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076；2. 國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076)

朱頂紅中黃烷類(lèi)化學(xué)成分的研究

辛國(guó)松1,2，李 鑫1,2，薛沁冰1,2，魏 馳1，朱洪劍1，厲增毅1，趙 賀1，季宇彬1,2

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076；2. 國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076)

對(duì)朱頂紅進(jìn)行成分的粗提取，經(jīng)分離純化獲得單體化合物，進(jìn)行Hepg-2細(xì)胞的活性試驗(yàn).用回流法對(duì)朱頂紅中有效成分進(jìn)行粗提，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，通過(guò)HPLC法獲得二氯甲烷部分的單體化合物.最終制得化合物1為4'-羥基-7,3'-二甲氧基黃烷(4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan)；化合物2為7,4'二羥基-3'-甲氧基黃烷(7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan).朱頂紅中的化學(xué)成分對(duì)腫瘤細(xì)胞Hepg-2細(xì)胞具有抑制作用.

分離純化；HPLC；抑制作用；單體化合物；腫瘤細(xì)胞

朱頂紅(Hippeastrum vittatum)是單子葉亞綱石蒜科(Amaryllidaceae)植物，為朱頂紅屬所有種類(lèi)總稱(chēng)，原產(chǎn)于墨西哥加勒比海以及阿根廷的北部[1].朱頂紅花形優(yōu)美、色澤艷麗.朱頂紅除了具有觀賞價(jià)值外也兼具有藥用價(jià)值[2].通過(guò)查閱文獻(xiàn)了解到，朱頂紅中各成分含量豐富并具有多種藥理活性，具有抗菌，抗氧化，抗腫瘤，促透等功效[3].本課題通過(guò)粗提朱頂紅中各化學(xué)成分后萃取粗分.通過(guò)查閱文獻(xiàn)了解到朱頂紅二氯甲烷提取部分活性較好[4-5].繼續(xù)對(duì)二氯甲烷提取部分分離純化得到單體化合物[6-7].

1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N-1100，東京理化器械株式會(huì)社)、型電子分析天平(BS110S，北京塞多利斯天平有限公司)、循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、倒置顯微鏡(CKX-41-32，日本OLYMPUS公司)；無(wú)水乙醇(分析純，批號(hào)：20121008)二氯甲烷(分析純，批號(hào)：20140516)甲醇(分析純，批號(hào)：20140708)石油醚(分析純，批號(hào)：20130423)乙酸乙酯(分析純，批號(hào)：20131014)正丁醇(分析純，批號(hào)：20130301).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1朱頂紅的粗提

取朱頂紅干燥葉片用70%乙醇以固液比1∶12回流提取，旋蒸除去試劑得總浸膏，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次得粗提產(chǎn)物[8].

2.2朱頂紅二氯甲烷部分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 二氯甲烷部分的粗分

硅膠柱分離取二氯甲烷部位浸膏作為拌樣硅膠置于合適研缽中，將樣品溶于二氯甲烷中，將拌有樣品的硅膠放入通風(fēng)廚中直至拌樣硅膠呈細(xì)沙狀，在拌樣硅膠柱面上加一層脫脂棉，再向其加入流動(dòng)相梯度洗脫.將梯度洗脫的餾分以半個(gè)保留體積570 mL為一餾分收集，薄層層析隨時(shí)跟蹤檢測(cè).再將安瓿瓶中的樣品分別用少量二氯甲烷、甲醇溶解后薄層層析檢測(cè)，將Rf值等同的流分收集在一個(gè)安瓿瓶中.

2.2.2 HPLC法對(duì)樣品進(jìn)行純度分析

分析型色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速：0.8 mL/min；流動(dòng)相：甲醇-水(梯度洗脫)，進(jìn)樣量：20 μL；進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣.合并ODS色譜柱洗脫部分，經(jīng)TLC薄層色譜分析，將已純化的樣品進(jìn)行純度分析.將樣品用甲醇溶解，采用0.45 μm的為空濾膜過(guò)濾到自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，以甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫，進(jìn)行高效液相色譜分析并通過(guò)光譜學(xué)分析和文獻(xiàn)對(duì)照對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定.

2.2.3 HPLC法對(duì)樣品進(jìn)行單體制備

制備型色譜柱：Eclipse XDB-C18(10 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速：2.0 mL/min；流動(dòng)相：甲醇-水(比例選用分析色譜儀分析的峰型較好的達(dá)到基線分離的比例)；進(jìn)樣量100 μL；手動(dòng)進(jìn)樣，手動(dòng)收集.

2.2.4 純度測(cè)定和結(jié)構(gòu)分析

按制備液相的色譜條件，分別將上述得到的化合物溶液注入分析型HPLC中檢測(cè).最后對(duì)單體化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1朱頂紅的粗提

濃縮回收試劑得石油醚部分84.9 g、二氯甲烷部分17 g、乙酸乙酯部分23.8 g、正丁醇部分140.4 g.

3.2朱頂紅二氯甲烷部分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

3.2.1 二氯甲烷部分的粗分

硅膠柱分離硅膠吸附色譜法中采用二氯甲烷-甲醇洗脫體系，比例依次為200∶0、200∶1、100∶1、80∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，最后選用0∶100進(jìn)行沖柱，總共收集到324個(gè)餾分，經(jīng)TLC檢測(cè)相同Rf值得合瓶后得到14個(gè)餾分.

3.2.2 HPLC法對(duì)樣品進(jìn)行純度分析

對(duì)已純化的樣品進(jìn)行純度分析，根據(jù)樣品中各組分的峰面積及分離程度，分析的到三個(gè)分離較好的樣品.色譜條件為起始流動(dòng)相甲醇∶水(40∶60)至35 min甲醇∶水(20∶80)至40min甲醇水(40∶60)梯度洗脫，運(yùn)行時(shí)間45 min.三個(gè)樣品的分析結(jié)果如圖1～3所示.

圖1 樣品1分析液相圖

圖2 樣品2分析液相圖

圖3 樣品3分析液相圖

3.2.3 HPLC法對(duì)樣品進(jìn)行單體制備

從樣品1中分離出3個(gè)化合物，化合物A(25.6 mg)、化合物B(12.3 mg)、化合物C(4.9 mg)，從樣品2中分離出4個(gè)化合物，化合物D(6.6 mg)、化合物E(4.5 mg)、化合物F(8.6 mg)、化合物G(10.9 mg)，從樣品3中分離出1個(gè)化合物，化合物H(12.7 mg).制備液相色譜圖如圖4～6所示.

圖4 樣品1制備液相色譜圖

圖5 樣品2制備液相色譜圖

圖6 樣品3制備液相色譜圖

3.2.4 純度測(cè)定和結(jié)構(gòu)分析

按制備液相的色譜條件，分別將上述得到的8個(gè)化合物溶液注入分析型HPLC中檢測(cè)，其中有3個(gè)組分為單一色譜峰圖.其他組分為單一峰但是峰型不好或有雜峰，顯然不是單體化合物，且樣品純度不足80%.色譜圖如圖7、8、9所示.

圖7 化合物Ⅰ的分析液相圖

圖8 化合物Ⅱ的分析液相圖

圖9 化合物Ⅲ的分析液相圖

3.2.5 分離純化結(jié)果

利用光譜學(xué)分析對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，化合物1：黃色棒狀結(jié)晶(CH3OH).紫外254 nm下有暗斑.1H NMR譜中，δH6.89(d，J = 8.2 Hz,1H)，6.83(m，2H)，6.77 (d，J=8.1 Hz，1H)，6.27 (dd，J=8.1，1.7 Hz，1H)，6.19 (s，1H)推測(cè)為苯環(huán)上的氫信號(hào)；δH4.88(d，J=9.2 Hz，1H)推測(cè)為羥基上的氫；δH3.75 (s，3H)推測(cè)為甲氧基上面的氫；δH3.38 (s，3H)推測(cè)為甲氧基上面的氫；δH2.78 (m，1H)，2.57 (m，1H)，2.37 (s，1H)，2.03 (d，J=13.3 Hz，1H)推測(cè)為飽和碳上的氫.13C NMR (151 MHz，DMSO)譜中，δC156.84推測(cè)為二氫苯并哌喃與甲氧基相連的碳；δC155.75推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)與氧相連的碳；δC147.52推測(cè)為苯環(huán)上與甲氧基相連的碳；δC146.76推測(cè)為苯環(huán)上與羥基相連的碳；δC134.71推測(cè)為苯環(huán)上與二氫苯并哌喃相連的碳；130.22推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳；δC117.25推測(cè)為苯環(huán)上的碳；δC113.81推測(cè)為苯環(huán)上與環(huán)氧六環(huán)上共同的碳；δC112.59，112.41推測(cè)為苯環(huán)上的碳；δC108.33，103.12推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳；δC76.97推測(cè)為二氫苯并哌喃上與苯環(huán)相連的碳；δC56.05，56.05推測(cè)為甲氧基上的碳；δC29.80推測(cè)為二氫苯并哌喃上的碳；δC24.07推測(cè)二氫苯并哌喃的碳.鑒定該化合物為4'-羥基-7,3'-二甲氧基黃烷(4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan)，分子式為C17H18O4，分子質(zhì)量為286.12，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖10，1H-NMR見(jiàn)圖11，13C-NMR見(jiàn)圖12.

圖10 化合物1結(jié)構(gòu)圖

圖11 化合物1的碳譜圖

圖12 化合物1的氫譜圖

化合物2：透明油狀物(CH3OH).紫外254 nm下有暗斑.1H NMR 中，δH6.98 (s，1H)，6.92(t，J=8.7 Hz，2H)，6.81(d，J=8.4 Hz，1H)，6.26(dd，J=8.2，2.1 Hz，1H)，6.18(d，J=2.1 Hz，1H)推測(cè)為苯環(huán)上氫；δH4.93(dd，J=9.9,，1.3 Hz，1H)推測(cè)羥基氫.δH3.74(d，J=4.7 Hz，3H)推測(cè)甲氧基氫.δH2.88(m，1H)，2.79(m，1H)，2.05(m，1H)，1.91(m，1H)推測(cè)為飽和碳上氫.13C NMR(151 MHz, DMSO)譜中，δC157.68推測(cè)為二氫苯并哌喃與氧相連的碳；δC155.76推測(cè)為二氫苯并哌喃上與羥基相連的碳；δC148.68推測(cè)為苯環(huán)上與甲氧基相連的碳；δC149.03推測(cè)為苯環(huán)上與羥基相連的碳；δC134.63推測(cè)為苯環(huán)上與二氫苯并哌喃相連的碳；δC130.11推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳；δC118.69推測(cè)為苯環(huán)上上的碳；δC111.99推測(cè)為苯環(huán)上與環(huán)氧六環(huán)上共同的碳；δC111.89，110.39推測(cè)為苯環(huán)上的碳；δC108.69推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳；δC103.30推測(cè)為二氫苯并哌喃上苯環(huán)的碳；δC77.16推測(cè)為二氫苯并哌喃上與苯環(huán)相連的碳；δC55.92，55.85推測(cè)為甲氧基上的碳；δC29.90推測(cè)為二氫苯并哌喃上的碳；δC24.262推測(cè)為二氫苯并哌喃的碳.鑒定該化合物為7,4'-二羥基-3'-甲氧基黃烷(7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan)，分子式為C16H16O4，分子質(zhì)量為272.10，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖13，1H-NMR見(jiàn)圖14，13C-NMR見(jiàn)圖15.

圖13 化合物2結(jié)構(gòu)圖

圖14 化合物2的碳譜圖

圖15 化合物2的氫譜圖

化合物3：綠色油狀物(CH3OH).紫外254 nm下有暗斑.1H NMR譜中含有氫信號(hào)δH7.43(t，J=7.9 Hz，1H)，7.27(m，2H)，7.16(d，J=8.3 Hz，1H)，3.33(s，5H)，2.50(dt，J=3.3，1.7 Hz，1H)，1.62(s，3H)，1.23(s，1H)，0.85(t，J=6.9 Hz，1H).13C NMR(151 MHz，DMSO)譜中，δC150.24，150.19，148.14，148.09，147.97，130.63，128.64，126.32，120.30，120.27，119.85，119.83推測(cè)表明至少含有有兩個(gè)苯環(huán).其中δC120.30，120.27推測(cè)表明含有苯環(huán)的對(duì)位取代的羥基，δC128.64推測(cè)表明連有雙鍵或甲基.通過(guò)以上數(shù)據(jù)推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)中至少有兩個(gè)對(duì)羥基取代的苯環(huán)，一個(gè)連在雙鍵或芳環(huán)上的甲基，有可能是二聚體，可能為黃酮類(lèi)化合物.1H-NMR見(jiàn)圖16，13C-NMR見(jiàn)圖17.

圖16 化合物3 的碳譜圖

圖17 化合物3的氫譜圖

以上數(shù)據(jù)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[9]確定了其中的2個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)[10]，分別為4'-羥基-7,3'-二甲氧基黃烷(4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan)，7,4'二羥基-3'-甲氧基黃烷(7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan).

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StudyonflavanechemicalcompositionofHippeastrumVittatum

XIN Guo-song1,2, LI Xin1,2, XUE Qin-bing1,2, WEI Chi1, ZHU Hong-jian1, LI Zeng-yi1, ZHAO He1, JI Yu-bin1,2

(1. Life Science and Environmental Science Research Center,Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. National Ministry of Education Anti-tumor Natural Drug Engineering Research Center, Harbin 150076, China)

Preextraction of Hippeastrum Vittatum was performed to obtained monomeric compounds by separation and purification, and then the activity test for Hepg-2 cells was conducted. The reflux method was used to coarse extract active ingredient in Hippeastrum Vittatum. The extraction solvents are petroleum ether, methylene dichloride, ethyl acetate and n-butanol. HPLC method was applied to obtaine parts of monomeric compounds of dichloromethane. We obtained the No.1 compound 4'-dihydroxy-7,3'-methoxy-flavan and the No.2 compound 7,4'-dihydroxy-3'-methoxy-flavan finally. The chemical components in Hippeastrum Vittatum had inhibiting effects for cancer cells of Hepg-2.

separation and purification; HPLC; inhibiting effects; monomericcompounds; cancer cells

2016-10-10.

哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(2016RQQXJ124,2016RAXXJ064)；黑龍江省教育廳高校創(chuàng)新人才項(xiàng)目(UNPYSCT-2016181)

辛國(guó)松(1984-)，男，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥理學(xué).

R284

A

1672-0946(2017)05-0513-06