杭白菊中井岡霉素A的固相萃取

盧燕平,楊 廣,吳加倫

(1.閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室，福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所，福建福州350002；2.農(nóng)業(yè)部植物病原及昆蟲分子生物學(xué)重點實驗室，浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，浙江杭州310058；3.害蟲綠色防控福建省高等學(xué)校重點實驗室，福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州350002；4.閩臺作物有害生物生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心，福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州350002；5.農(nóng)業(yè)部閩臺作物有害生物綜合治理重點實驗室，福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州350002)

杭白菊中井岡霉素A的固相萃取

盧燕平1,3,4,5,楊 廣1,3,4,5,吳加倫2

(1.閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室，福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所，福建福州350002；2.農(nóng)業(yè)部植物病原及昆蟲分子生物學(xué)重點實驗室，浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，浙江杭州310058；3.害蟲綠色防控福建省高等學(xué)校重點實驗室，福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州350002；4.閩臺作物有害生物生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心，福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州350002；5.農(nóng)業(yè)部閩臺作物有害生物綜合治理重點實驗室，福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州350002)

建立杭白菊中井岡霉素A的固相萃取的方法。比較不同溶劑對目標(biāo)農(nóng)藥的提取效率,其中采用甲醇－水(8∶2)提取時,井岡霉素A的平均回收率最好,平均回收率在89.53%－93.73%。比較不同萃取方式的凈化效率,其中用C18-HLB串聯(lián)小柱固相萃取井岡霉素A的回收率效果最好,為89.43%－92.60%。選擇0.5 mL乙腈進(jìn)行洗脫,發(fā)現(xiàn)第3次洗脫后回收率穩(wěn)定,在90.05%－98.04%。用建立的方法對胎菊和朵菊樣品進(jìn)行添加回收率試驗,杭白菊鮮樣及干樣中井岡霉素A的添加回收率在83.02%－89.93%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.57%－2.95%。

固相萃??；井岡霉素A；杭白菊

中國是中醫(yī)藥的發(fā)源地,是中藥的生產(chǎn)和使用大國(汪佳鳳等,2013)。杭白菊(Chrysanthemum morifolium)又稱甘菊,為“浙八味”之一,是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的首批藥食同源的藥材。杭白菊有大洋菊與小洋菊之分,具有散風(fēng)清熱、平肝明目、抗炎降壓等功效,“杭白貢菊”一向與“龍井名茶”并提,古時曾作貢品(趙靜等,2013)。杭白菊根據(jù)采摘期不同分為胎菊和朵菊兩種,其在種植過程中易感染葉枯病、根腐病等病害,而井岡霉素是其常用的防治藥物之一。

井岡霉素是吸水鏈霉菌井岡變種產(chǎn)生的水溶性農(nóng)用抗生素(余曉江等,2011),屬于氨基糖苷類化合物,共有6種結(jié)構(gòu)(A－F),主要活性物質(zhì)為井岡霉素A,一般產(chǎn)品中以井岡霉素A的含量來標(biāo)示產(chǎn)品的規(guī)格及質(zhì)量(杜良偉等,2012；Cao et al.,2011)。井岡霉素主要用于水稻紋枯病,也可用于水稻稻曲病、玉米大小斑病以及蔬菜和棉花、豆類等作物病害的防治,高效低毒且不易產(chǎn)生真菌抗藥性,是我國獨立發(fā)現(xiàn)并開發(fā)的一種農(nóng)用抗生素(林志楷等,2013),在我國使用近40 a,目前已成為我國生產(chǎn)量最大的農(nóng)用抗生素(朱永和等,2006)。出于保護(hù)人類健康和環(huán)境等原因(成卓敏,2005),2003年歐盟出臺了有效霉素(井岡霉素)的禁用政策,引起我國有關(guān)部門的高度重視。

國內(nèi)外關(guān)于井岡霉素A檢測技術(shù)的研究很少,在中藥材上的殘留分析方法也未見報道。井岡霉素A分子中含多個極性基團(tuán),難于氣化,不能直接用氣相色譜分析(許鵬軍等,2008)。已有的報道多用高效液相色譜法(余曉江等,2011；馬婧瑋等,2007)、柱前衍生化毛細(xì)管氣相色譜法(許鵬軍等,2008)和液相色譜－質(zhì)譜法(關(guān)文碧等,2012)分析井岡霉素A,但主要集中在水稻及土壤樣本上,已開發(fā)的方法難以應(yīng)用于成分較復(fù)雜的中藥材。為此,本文建立了杭白菊中井岡霉素A的殘留分析方法,采用C18-HLB小柱聯(lián)用凈化,有效解決文獻(xiàn)中使用單一萃取柱凈化存在的雜質(zhì)干擾大、分離效果差等問題,其樣品檢測的靈敏度較高,操作簡便迅速,重現(xiàn)性好,為高效檢測成分復(fù)雜中藥材中的井岡霉素A提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

杭白菊胎菊及朵菊樣品采自浙江桐鄉(xiāng)市鳳鳴街道杭白菊種植基地(未施過井岡霉素A),部分鮮樣經(jīng)加工后制成干樣,用中藥粉碎機粉碎,過20目(孔徑900 μm)篩。

井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品(純度為91.8%,上海農(nóng)藥研究所),甲醇、乙腈為色譜純(美國Dikma公司),磷酸氫二鈉、磷酸為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),超純水(美國Millipore公司),助濾劑Celite545(硅藻土載體,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜檢測條件 色譜柱為TSKgel ODS-100V(250 gel OD,5 μm,迪馬公司)；流動相為0.005 mol·L－1磷酸氫二鈉緩沖液(磷酸調(diào)節(jié) pH＝7) ∶甲醇＝95 ∶5；流速 1 mL·min－1；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30℃。采用保留時間定性,外標(biāo)法定量,井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間在7 min左右。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確稱取0.0109 g的井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL的容量瓶中,加超純水配制成100 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液用超純水稀釋為10、5、1、0.5、0.1 mg·L－1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按1.2.1節(jié)進(jìn)樣,以質(zhì)量濃度(x,mg·L－1)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為:y＝15430x＋53.473,R2＝0.99998。井岡霉素A在質(zhì)量濃度為0.1－10 mg·L－1之間具有良好的線性關(guān)系。

1.2.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取新鮮胎菊(朵菊)樣品4 g,置于50 mL有蓋樣品瓶中,加25 mL甲醇－水(體積比8∶2)和1 g助濾劑,在勻漿機中高速勻漿1 min,超聲提取30 min后布氏漏斗抽濾,10 mL甲醇分2次洗殘渣,合并濾液于100 mL平底燒瓶中,60℃水浴減壓濃縮近干,加2 mL甲醇制成待凈化液,將2 mL待凈化液過C18小柱凈化,先用3 mL水,3 mL甲醇活化C18小柱,上樣后用1 mL甲醇洗脫,收集洗脫液吹干加超純水1 mL后過HLB小柱,先用3 mL甲醇,3 mL水活化HLB小柱,上樣后再用1.5 mL乙腈洗脫,萃取完成后氮氣吹干,用超純水定容為2 mL,0.45 μm濾膜過濾,待測。

準(zhǔn)確稱取2 g干胎菊(干朵菊)樣品加15 mL甲醇－水(體積比8∶2)提取,其他步驟同新鮮胎菊(朵菊)樣品。

1.2.4 添加回收試驗 選取不含井岡霉素A的胎菊和朵菊樣品進(jìn)行添加回收率測定,按照

1.2.3 和1.2.1步驟進(jìn)行樣品前處理和分析測定。胎菊及朵菊鮮樣的添加水平分別為0.05、0.25、0.5 mg·kg－1,胎菊及朵菊干樣的添加水平分別為 0.1、0.25、1.5 mg·kg－1,同時做空白對照,計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

井岡霉素A是強極性化合物,易溶于水和甲醇。本研究比較了甲醇、水、甲醇－水3種溶劑對目標(biāo)農(nóng)藥的提取效率,結(jié)果如表1所示。從表中可以看出,采用甲醇－水(8∶2)提取時,井岡霉素A的平均回收率最好,平均回收率在89.53%－93.73%,因此本研究選用甲醇－水(8∶2)作為提取溶劑對胎菊及朵菊中井岡霉素A進(jìn)行提取。

表1 不同溶劑提取井岡霉素A的回收率(x±SE， n＝3)1)Table 1 Recovery rate of validamycin A with different extraction solvents

2.2 凈化方法的優(yōu)化

2.2.1 不同萃取方式的比較 樣品中井岡霉素A的前處理最常用的是C18固相萃取小柱凈化(許鵬軍等,2008；馬婧瑋等,2007；關(guān)文碧等,2012；劉虹等,2007),但是C18固相萃取小柱主要吸附極性較低的物質(zhì),對于極性很強的井岡霉素A幾乎不保留。因此,本研究比較了固相萃取(SPE)和液相萃取(LLE)對井岡霉素A的凈化效率。SPE選用固相萃取小柱HLB、C18及C18-HLB串聯(lián)小柱,LLE采用二氯甲烷和石油醚為萃取液,結(jié)果如表2所示。從表中可以看出,用C18-HLB串聯(lián)小柱固相萃取對井岡霉素A的回收率最好,平均回收率在89.43%－92.60%,圖1是其色譜分離效果。因此選擇C18-HLB串聯(lián)小柱對杭白菊樣品中井岡霉素A進(jìn)行富集和純化。

表2 不同萃取方式對井岡霉素A回收率的影響(x±SE， n＝3)1)Table 2 Effect of different extraction methods on recovery rate of validamycin A

圖1 杭白菊樣品提取物色譜圖Figure 1 Chromatogram of extraction from Chrysanthemum morifolium

2.2.2 洗脫液及其用量的選擇 在HLB小柱之前串聯(lián)C18小柱,樣品中脂質(zhì)、色素等雜質(zhì)能夠被去除(許鵬軍等,2008；馬婧瑋等,2007；關(guān)文碧等,2012；劉虹等,2007),收集液再通過HLB小柱進(jìn)一步純化。井岡霉素A吸附在HLB小柱上,需用合適的洗脫液洗脫。采用乙腈洗脫時,獲得的收集液含雜質(zhì)較少,因此選擇乙腈作為洗脫溶劑。用乙腈分6次洗脫,每次0.5 mL,分段收集洗脫劑測定回收率。由圖2可知,第3次洗脫后回收率穩(wěn)定,在90.05%－98.04%,因此確定洗脫劑的用量為1.5 mL。

圖2 洗脫液不同用量對井岡霉素A回收率的影響Figure 2 Effect of different dosages of elution solution on recovery rate of validamycin A

2.3 添加回收率試驗

對胎菊和朵菊樣品進(jìn)行添加回收率試驗,結(jié)果如表3所示。在最優(yōu)色譜條件下,檢出限分別為0.05 mg·kg－1(胎菊及朵菊鮮樣)、0.1 mg·kg－1(胎菊及朵菊干樣)。杭白菊鮮樣及干樣中井岡霉素A的添加回收率在83.02%－89.93%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.57%－2.95%。

表3 井岡霉素A在杭白菊中的添加回收率(n＝3)Table 3 Fortified recovery rate of validamycin A in Chrysanthemum morifolium(n＝3)

3 討論與結(jié)論

樣品前處理是農(nóng)藥殘留分析技術(shù)的關(guān)鍵,本試驗對前處理條件進(jìn)行優(yōu)化。在選擇提取溶劑時,甲醇提取出的雜質(zhì)較多,干擾大。水作提取溶劑時,后續(xù)的抽慮及濃縮蒸干過程困難。為減少雜質(zhì)對檢測分析的干擾,簡化操作,提高回收率,選擇甲醇－水進(jìn)行目標(biāo)物的提取。在樣品凈化選擇洗脫溶劑過程中,使用甲醇洗脫時,甲醇的極性大、洗脫性強,雜質(zhì)的峰很高,影響色譜分離效果。水作為洗脫液時,回收率較低,且后續(xù)的濃縮困難。而用乙腈洗脫滿足凈化要求,因此選擇乙腈作為洗脫溶劑。井岡霉素A在不同介質(zhì)中的回收率不同,可能是因為胎菊及朵菊鮮樣與干樣中井岡霉素A的吸附性不同,進(jìn)而導(dǎo)致回收率的差異(劉虹等,2007)。本方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求,也可為檢測其他產(chǎn)品中井岡霉素A的殘留量提供參考。

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Solid phase extraction of validamycin A from Chrysanthemum morifolium

LU Yan-Ping1,3,4,5,YANG Guang1,3,4,5,WU Jia-Lun2
(1.State Key Laboratory of Ecological Pest Control for Fujian and Taiwan Crops,Institute of Applied Ecology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China；2.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogens and Insects,Institute of Pesticide and Environmental Toxicology,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 310058,China；3.Key Laboratory of Green Control of Insect Pests(Fujian Agriculture and Forestry University),Fujian Province University,Fuzhou,Fujian 350002,China；4.Fujian-Taiwan Joint Centre for Ecological Control of Crop Pests,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China；5.Key Laboratory of Integrated Pest Management for Fujian-Taiwan Crops,Ministry of Agriculture,Fuzhou,Fujian 350002,China)

A method has been developed for the extraction and purification of validamycin A from Chrysanthemum morifolium.Validamycin A was extracted with the mixture of methyl alcohol and water(8∶2)with a better recovery rate of 89.53%－93.73%.Validamycin A was purified with C18-HLB and the recoveries were 89.43%－92.60%.Acetonitrile of 0.5 mL was used as the solvent for elution and after 3 times of elution the recovery rate reached the stable point of 90.05%－98.04%.Using the above method,the fortified recoveries of validamycin A were 83.02%－89.93%,with relative standard deviations(RSD)of 0.57%－2.95%.

solid phase extraction；validamycin A；Chrysanthemum morifolium

O657

A

1001－4276－(2017)01－0074－06

盧燕平，楊廣，吳加倫，2017.杭白菊中井岡霉素A的固相萃取[J].武夷科學(xué)，33:74-79.

2017－09－29。

中加政府間科技合作專項“農(nóng)業(yè)土壤治理與改良關(guān)鍵技術(shù)的聯(lián)合研發(fā)”(2016YFE0102100)。

盧燕平(1988－)，女，助理實驗師。研究方向:農(nóng)藥殘留分析。Email:1010177685＠qq.com。

(責(zé)任編輯:陳曉雯)