三種豬偽狂犬病抗體監(jiān)測方法的比較

龔文波，徐靜，郭建寶，邱文英，張麗燕，秦運(yùn)杰

（華派生物工程集團(tuán)有限公司，四川 簡陽 641400）

三種豬偽狂犬病抗體監(jiān)測方法的比較

龔文波，徐靜，郭建寶，邱文英，張麗燕，秦運(yùn)杰

（華派生物工程集團(tuán)有限公司，四川 簡陽 641400）

本試驗(yàn)以偽狂犬病病毒（PRV）Bartha-k61制備滅活疫苗，接種PRV抗體陰性豬，然后用gB ELISA抗體檢測法、中和抗體指數(shù)法和中和抗體法進(jìn)行效果監(jiān)測。結(jié)果顯示：三種方法都能檢測到疫苗接種后發(fā)生了免疫應(yīng)答，但以中和指數(shù)值和中和抗體值來表示豬群免疫效果更為準(zhǔn)確，gB ELISA抗體陽性率不能作為群體免疫效果指標(biāo)。

偽狂犬病病毒；gB ELISA；中和抗體；中和指數(shù)

豬偽狂犬病是豬的主要疾病之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前常接種gE基因缺失的偽狂犬病疫苗進(jìn)行控制[1-3]。為了獲得最佳的豬偽狂犬病疫苗抗體監(jiān)測方法，本文對(duì)臨床常使用的ELISA方法、注冊(cè)資料中常使用的中和指數(shù)法與中和抗體法[4]進(jìn)行比較，以評(píng)判g(shù)B ELISA方法是否能用于免疫抗體臨床監(jiān)測。

1 材料

1.1 試劑盒 偽狂犬病gB ELISA抗體檢測試劑盒，由美國IDEXX公司生產(chǎn)，批號(hào)：DK060。

1.2 細(xì)胞 豬睪丸傳代細(xì)胞購自CTCC，F(xiàn)4由四川省華派生物制藥有限公司質(zhì)管部提供。

1.3 毒種 PRV Bartha-k61 E20由四川省華派生物制藥有限公司質(zhì)管部提供。

1.4 試劑 MEM購自Gibcol公司，批號(hào)：1310366；血清購自金源康公司，批號(hào)：20130325；28VG由法國賽比克公司生產(chǎn)，批號(hào)：T30641。

2 方法

2.1 滅活疫苗的制備

2.1.1 疫苗 將長至單層的ST細(xì)胞（T-75）棄營養(yǎng)液，加入20mL無血清MEM，然后接種100μL種毒病毒液，接種后置37℃ 5%CO2條件下每天觀察，細(xì)胞病變至80%收獲，同時(shí)取樣測病毒含量。

2.1.2 滅活 按體積比加入0.1%的β-丙內(nèi)酯，4℃滅活24h，每隔4h振搖一次。

2.1.3 病毒含量測定 將病毒液用無血清的MEM做 10 倍系列稀釋，取 10-4、10-5、10-6、10-7四個(gè)稀釋度，接種長至單層的ST細(xì)胞，100μL/孔，每個(gè)稀釋度接種8孔，置37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)5d，從第3d起觀察細(xì)胞病變，并計(jì)數(shù)。按Reed-Munch法計(jì)算TCID50。

2.1.4 滅活檢驗(yàn) 取長至單層的ST細(xì)胞一瓶，棄培養(yǎng)液，加18mL無血清MEM，然后接種2 mL待檢樣品，置37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)3d，每天觀察細(xì)胞病變，若無細(xì)胞病變，則凍融后再盲傳2次，仍無病變，則滅活徹底。

2.1.5 乳化 根據(jù)測定的病毒含量結(jié)果，將滅活的病毒液稀釋成107.5TCID50/mL，將稀釋后的滅活病毒液按3份病毒液+1份28VG，以3500r/min乳化20min，然后分裝。

2.2 選豬及分組 選擇28～35日齡，gB ELISA抗體陰性和偽狂犬病中和抗體≤2的仔豬17頭，分別標(biāo)記。

2.3 疫苗接種及血清采集 將17頭陰性豬隨機(jī)分為2組，疫苗接種組12頭，未接種疫苗對(duì)照組5頭，混合飼養(yǎng)。第1組在試驗(yàn)開始前（PI0）接種偽狂犬病滅活疫苗1 mL/頭，在首次接種后14d（PI14）進(jìn)行第二次接種（1mL/頭），對(duì)照組接種生理鹽水。在首免后14 d（PI14）、21 d（PI21）、28 d（PI28）、35 d（PI35）采集血樣，分離血清備用。

2.4 血清ELISA gB抗體檢測 按廠家使用說明操作并判定結(jié)果。

2.5 中和抗體測定 取50 μL血清，在96孔微量培養(yǎng)板中用不含血清的MEM進(jìn)行2倍系列稀釋，稀釋至28，然后將PRV Bartha-k61病毒稀釋成2000TCID50/mL，每孔加入稀釋好的病毒 50 μL，并設(shè)病毒對(duì)照、MEM對(duì)照，置37℃下作用60min，然后加入細(xì)胞懸液100μL，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中4～5d，觀察細(xì)胞病變，以完全抑制細(xì)胞病變的血清最高稀釋度為該血清的中和抗體效價(jià)，中和抗體效價(jià)以log2表示。

2.6 中和抗體與ELISA抗體S/N值的比較 分別計(jì)算當(dāng)中和抗體為 0、1、2、3、4、5、6 時(shí) ELISA 抗體 S/N值的幾何平均值，并以此作圖。

2.7 中和指數(shù)測定 將PRV Bartha-k61病毒液進(jìn)行10-1～10-710倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度各取0.5mL，分別加入等量的中和抗體為0的血清，37℃作用1h，然后接種長滿單層的ST細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8孔，接種后37℃培養(yǎng)、觀察120h，計(jì)算其TCID50。同中和抗體為 0 的血清一樣，測中和抗體為 1、2、3、4、5、6的血清與10倍系列稀釋的病毒液作用后的TCID50。分別計(jì)算中和抗體為0的TCID50與中和抗體為 1、2、3、4、5、6 的 TCID50的比值，即得中和指數(shù)[5]。

將不同中和抗體效價(jià)的中和指數(shù)與不同中和抗體效價(jià)的ELISA抗體S/N幾何平均值比較，并以此作圖。

3 結(jié)果

3.1 PI0、PI14、PI21、PI28、PI35 gB ELISA 抗體陽性率、ELISA S/N幾何平均值及中和抗體幾何平均值 結(jié)果見表1。

表1 不同時(shí)間段疫苗接種組和陰性對(duì)照組的ELISA陽性率、ELISA S/N幾何平均值、中和抗體幾何平均值

在疫苗接種前，ELISA抗體檢測結(jié)果都為陰性，中和抗體在0～2之間（數(shù)據(jù)未顯示）。因此將ELISA抗體為陰性、中和抗體不高于2的豬定為陰性豬。在疫苗接種后14～35d，gB ELISA抗體全都為陽性，中和抗體的幾何平均值上升到2.62～4.42。ELISA S/N幾何平均值從PI0的0.937下降到0.027。未接種疫苗組的gB ELISA抗體全部為陰性，中和抗體平均值在0.2，ELISA S/N幾何平均值維持在 0.83～1.08之間。

從以上結(jié)果可以看出，ELISA抗體陽性率反映了疫苗接種后的免疫應(yīng)答，但不能反映不同時(shí)間段免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。ELISA抗體S/N幾何平均值大小反映了疫苗接種后的免疫應(yīng)答及免疫應(yīng)答強(qiáng)度，中和抗體也同樣反映了疫苗接種后的免疫應(yīng)答及免疫應(yīng)答強(qiáng)度。

3.2 不同中和抗體值測得的中和指數(shù) 結(jié)果見表2。從表2結(jié)果來看，病毒液測出的病毒含量為108.2TCID50/mL，中和抗體為0和1的血清與病毒液中和后測出的病毒含量為107.5TCID50，說明血清本身含有的一些因子對(duì)病毒有很低的中和能力。隨著中和抗體滴度上升，中和抗體指數(shù)也上升。

表2 中和抗體指數(shù)法測定結(jié)果

從中和抗體與中和指數(shù)關(guān)系曲線圖來看，R2=0.969，表明用這兩種方法來監(jiān)測免疫應(yīng)答的結(jié)果具有很強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系。當(dāng)中和抗體指數(shù)為316時(shí)，相交于中和抗體軸的3.3（圖1）。

圖1 中和抗體與中和指數(shù)關(guān)系曲線

3.3 中和抗體為 0、1、2、3、4、5、6 時(shí) ELISA 抗體的 S/N幾何平均值 結(jié)果見表3。

表3 中和抗體與gB ELISA S/N幾何平均值的比較

從表3結(jié)果來看，中和抗體在0、1時(shí)，S/N值差異不顯著；中和抗體在2、3時(shí)，S/N值差異不顯著；中和抗體在4、5、6時(shí)S/N值差異不顯著。從圖2中和抗體與ELISA S/N值的關(guān)系曲線來看，二者有較強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系，R2=0.840；中和抗體為3.3時(shí)，相交于S/N軸的0.155。從圖3的中和指數(shù)與ELISA S/N幾何平均值的比較來看，二者具有較強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系，R2=0.875；中和抗體指數(shù)為316時(shí)，相交于S/N軸的0.145。

圖2 中和抗體與ELISA S/N值關(guān)系曲線

圖3 中和指數(shù)與ELISA S/N值關(guān)系曲線

4 討論與結(jié)論

4.1 gB ELISA是臨床監(jiān)測偽狂犬病免疫效果的主要手段，監(jiān)測結(jié)果常以陽性所占百分比表示，百分率越高，表示保護(hù)效果越好。從本研究結(jié)果來看，疫苗接種后14d陽性率達(dá)到100%，但中和抗體幾何平均值為2.62，中和抗體指數(shù)在130～140之間（根據(jù)作圖獲得的結(jié)果）。據(jù)資料報(bào)道，中和抗體指數(shù)在316時(shí)才具有保護(hù)作用。因此盡管在接種14d時(shí)陽性率達(dá)100%，但仍不具有保護(hù)作用。故不能以gB ELISA抗體陽性百分率來表示免疫保護(hù)效果。

4.2 從中和抗體指數(shù)與中和抗體關(guān)系的比較來看，二者有很強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系，中和抗體指數(shù)在316時(shí)，對(duì)應(yīng)的中和抗體為3.3，因此可將中和抗體達(dá)到3.3定為具有免疫保護(hù)作用。

4.3 從中和抗體指數(shù)值、中和抗體值與gB ELISA S/N幾何平均值的關(guān)系來看，前二者與gB ELISA S/N幾何平均值都有較強(qiáng)的相關(guān)關(guān)系。中和抗體指數(shù)在316時(shí)，對(duì)應(yīng)的gB ELISA S/N幾何平均值為0.14～0.15；中和抗體值在3.3時(shí)，對(duì)應(yīng)的gB ELISA S/N幾何平均值為0.15～0.16。因此，可將gB ELISA S/N值在0.15左右定為具有免疫保護(hù)作用。進(jìn)行群體免疫效果監(jiān)測時(shí)，不應(yīng)以ELISA抗體陽性率來判定免疫效果，而應(yīng)以gB ELISA S/N值在0.15以上作為群體免疫效果的評(píng)判依據(jù)。

[1] 王川慶，楊霞，陳陸.4株豬偽狂犬病病毒gE基因的克隆與序列分析[A]∥中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第七屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].2009.

[2]楊毅，李文剛，饒寶，等.豬偽狂犬病疫苗的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010（3）：154-157.

[3] Yu X，Zhou Z，Hu D，et al.Pathogenic pseudorabies virus China，2012[J].Emerging Infectious Diseases，2014，20（1）：102-104.

[4] 鄒浩勇，陳冬煥，熊金鳳，等.偽狂犬病毒中和抗體與gB-ELISA抗體阻斷率之間的相關(guān)性[J].豬業(yè)科學(xué)，2008（5）：94-96.

[5] 舒銀輝，黃文輝，饒清宜，等.豬偽狂犬病滅活疫苗（HB-J株）對(duì)兔與豬免疫攻毒保護(hù)平行關(guān)系研究[J].中國獸藥雜志，2014，46（10）：5-8.

Comparison of Three Methods for the Monitoring of Porcine Pseudorabies antibody

Gong Wenbo，Xu Jing，Guo Jianbao，et al.
（Huapai Bioengineering Group Co.′Ltd.′Sichuan Jianyang 641400，China）

Pseudorabies virus（PRV） antibody negative pigs were inoculated with the inactivated vaccine prepared by PRV Bartha-k61 strain，and then the immunizing efficiency of the vaccine was evaluated by gB ELISA antibody assay，neutralizing antibody index method and neutralizing antibody method.The results showed that the three methods could detect the immune response after vaccination，compared with the positive rates of gB ELISA antibody，the neutralizing index values and the neutralizing antibody values were more accurate to measure the immune effect of the vaccine in pigs，so it could not be used as an indicator for the evaluation of herd immunity effect.

Pseudorabies virus；gB ELISA；Neutralizing antibody；Neutralizing index

S854.43

B

1001-8964（2017）11-0025-04

2017-08-17

龔文波（1965-），男，重慶墊江人，碩士研究生，高級(jí)工程師，華派生物工程集團(tuán)有限公司總經(jīng)理，主要從事獸用生物制品的研發(fā)及生產(chǎn)管理。