閆雪瑩，楊淋清，吳德生，劉素純，袁建輝，劉建軍

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳 518055）

三氯異氰尿酸對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚的發(fā)育毒性

閆雪瑩1，楊淋清2，吳德生2，劉素純1，袁建輝2，劉建軍2

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳 518055）

目的探討新型消毒劑三氯異氰尿酸（TCCA）對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚的發(fā)育毒性。方法選擇受精后2 h的斑馬魚胚胎進(jìn)行染毒：①將胚胎置于含有TCCA 50，100，150，200，250和300 mg·L-1的培養(yǎng)液中暴露48 h，檢測(cè)半數(shù)致死濃度（LC50）。②將胚胎置于含有TCCA 0，10.4，20.8和41.7 mg·L-1的培養(yǎng)液中暴露96 h，分別于暴露后48，72和96 h檢測(cè)胚胎死亡率、畸形率和心率，采用羥胺法于暴露后2，4和6 h檢測(cè)胚胎組織超氧化物歧化酶（SOD）的活性，HE染色觀察暴露后7 d幼魚頭部組織病理結(jié)構(gòu)。結(jié)果TCCA暴露48 h，斑馬魚胚胎LC50為166.9 mg·L-1。與正常對(duì)照組相比，暴露后96 h，TCCA 41.7 mg·L-1組斑馬魚胚胎死亡率和畸形率顯著升高（P＜0.05），TCCA各劑量組心率顯著下降（P＜0.05）；暴露后72 h，TCCA 41.7 mg·L-1組死亡率顯著升高（P＜0.05），20.8和41.7 mg·L-1組畸形率顯著升高（P＜0.05），心率顯著下降（P＜0.05）；暴露后48 h，TCCA 41.7 mg·L-1組畸形率顯著升高（P＜0.05）、心率顯著下降（P＜0.05）。TCCA暴露4和6 h，20.8和41.7 mg·L-1組SOD活性較正常對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）。TCCA暴露7 d后，與正常對(duì)照組相比，各濃度組斑馬魚幼魚均出現(xiàn)腦和眼部間隙變大及眼部視網(wǎng)膜分層不明顯的病理改變。結(jié)論TCCA對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育有毒性作用，能引起胚胎發(fā)育早期SOD活性下降，造成幼魚視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)損傷。

三氯異氰尿酸；胚胎發(fā)育；視網(wǎng)膜；斑馬魚

氯化消毒劑在生活飲用水、餐具及環(huán)境消毒等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，使用便捷，但近年來人們逐漸發(fā)現(xiàn)，其分解產(chǎn)物常與水中某些有機(jī)物和無機(jī)成分產(chǎn)生反應(yīng)，從而生成氯化消毒副產(chǎn)物，對(duì)人體健康構(gòu)成威脅［1］。三氯異氰尿酸（trichloroisocyanuric acid，TCCA）是第四代氯化消毒劑，其化學(xué)名稱為三氯-均三嗪2，4，6（1H，3H，5H）三酮，也稱強(qiáng)氯精，屬有機(jī)化合物，白色晶狀粉末或粒狀固體，具有強(qiáng)烈的氯化刺激味［2］。TCCA在水中分解后的主要產(chǎn)物為次氯酸，可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，使蛋白質(zhì)氧化；導(dǎo)致細(xì)菌死亡［3］。此外，TCCA還可分解產(chǎn)生尿氰酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成三聚氰酸［4-5］。有研究表明，TCCA對(duì)劍尾魚、羅非魚和藻類具有毒性作用［6-8］，但其對(duì)胚胎的毒性效應(yīng)鮮有報(bào)道。本研究擬探討TCCA暴露對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚的毒性作用及初步作用機(jī)制，為闡明TCCA致胚胎發(fā)育毒性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

斑馬魚購自深圳市花鳥魚市場(chǎng)，體長1.0～3.0 cm，飼養(yǎng)于深圳市疾病預(yù)防控制中心生態(tài)毒理實(shí)驗(yàn)室，水溫27～29℃，pH 7.2～7.4，光照/黑暗時(shí)間周期為14/10 h，電導(dǎo)率500～550 mS·cm-1，每天投食2次，喂以新鮮的鹵蟲幼體。

1.2 藥品、試劑和儀器

TCCA和HEPES購自美國Sigma公司；NaCl，KCl，CaCl2和MgSO4均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒（A001-3）購自南京建成公司。斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生有限公司）；CKX41倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科科技儀器有限公司）；石蠟切片機(jī)和石蠟包埋機(jī)（德國萊卡公司）；VCX400超聲波破碎儀（Sonics公司）。

1.3 試劑配制和胚胎收集

用 E3培養(yǎng)液（mmol·L-1：NaCl 5，KCl 0.17，CaCl20.33，MgSO40.33，HEPES 0.7；pH 6.8～7.0）配制TCCA母液，超聲溶解40 min，水溫≤18℃，再用培養(yǎng)液稀釋至染毒濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將雌、雄斑馬魚以1∶2的比例放入交配盒中，用擋板隔開，適應(yīng)過夜，第2天早晨給予光照并抽開擋板，1 h后收集胚胎，用E3培養(yǎng)液清洗胚胎2次。

1.4 胚胎染毒方法

在體視顯微鏡下挑選受精后2 h、發(fā)育正常且大小基本一致的胚胎，隨機(jī)分配至6孔板，每孔30個(gè)，分別加不同濃度TCCA染毒液（染毒組）或E3培養(yǎng)液（正常對(duì)照組）4.0 mL，置于27～29℃恒溫生化培養(yǎng)箱中，每24 h換1/2培養(yǎng)液或染毒液，實(shí)驗(yàn)過程中及時(shí)清除死亡的胚胎。

1.5 半數(shù)致死濃度的測(cè)定

按1.4方法，將受精后2 h的胚胎暴露于含TCCA 50，100，150，200，250和300 mg·L-1的E3培養(yǎng)液中持續(xù)染毒48 h，每12 h在體視顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育情況，記錄各組胚胎死亡數(shù)，計(jì)算半數(shù)致死濃度（LC50）。以卵凝結(jié)作為胚胎死亡學(xué)終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.6 致死率和致畸率的測(cè)定

按1.4方法將胚胎暴露于含TCCA 0，10.4，20.8和41.7 mg·L-1的E3培養(yǎng)液中持續(xù)染毒96 h，每24 h在體視顯微鏡下觀察記錄胚胎或幼魚死亡數(shù)目，同時(shí)計(jì)數(shù)存活胚胎或幼魚中畸形個(gè)體的數(shù)目。以卵凝結(jié)作為胚胎死亡學(xué)終點(diǎn)，以心臟停止跳動(dòng)作為幼魚死亡學(xué)終點(diǎn)。以脊柱彎曲，眼睛畸形，心包水腫為畸形的判定標(biāo)準(zhǔn)。致死率（%）=死亡數(shù)/總胚胎數(shù)×100%；致畸率（%）=畸形數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.7 心率的測(cè)定

按1.4方法將胚胎暴露于含TCCA 0，10.4，20.8和41.7 mg·L-1的E3培養(yǎng)液中持續(xù)染毒96 h，分別于染毒48，72和96 h在體視顯微鏡下記錄胚胎1 min內(nèi)心跳次數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.8 羥胺法檢測(cè)胚胎組織SOD活性

按1.4方法將胚胎暴露于含TCCA 0，10.4，20.8和41.7 mg·L-1的E3培養(yǎng)液中。分別于暴露2，4和6 h后收集各組胚胎，加入生理鹽水400 μL，冰上制備勻漿，845×g離心10 min，取上清液，按照試劑盒操作步驟檢測(cè)SOD活性，以在本體系中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活性單位（U）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 HE染色觀察幼魚組織病理結(jié)構(gòu)

按1.4方法將胚胎暴露于含TCCA 0，10.4，20.8和41.7 mg·L-1的E3培養(yǎng)液中持續(xù)染毒7 d，用4%多聚甲醛將幼魚組織固定過夜，制成厚度6 μm的石蠟切片，經(jīng)蘇木素-伊紅染色，中性樹脂封片，置顯微鏡下觀察。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TCCA暴露48 h斑馬魚胚胎半數(shù)致死濃度

TCCA暴露后48 h，胚胎死亡率隨暴露濃度的增加而增加，250和300 mg·L-1組胚胎死亡率達(dá)99%，LC50為166.9 mg·L-1（圖1）。

Fig.1 Mortality of zebrafish embryos exposed to trichloroisocyanuric acid（TCCA）for 48 h.Zebrafish embryos were treated with TCCA during 2-50 h post fertilization（hpf）.The TCCA solutions were renewed every 24 h.±s，n=5.

2.2 TCCA對(duì)斑馬魚死亡率和畸形率的影響

TCCA暴露后72和96 h，斑馬魚死亡率隨TCCA暴露濃度增加而增加，與正常對(duì)照組相比，41.7 mg·L-1組死亡率分別為（12.0±3.0）%和（13.3±3.5）%（P＜0.05）。暴露后48 h，TCCA各濃度組死亡率與正常對(duì)照組無明顯差異（圖2）。斑馬魚畸形率隨TCCA暴露濃度增加而增加。與正常對(duì)照組相比，暴露后48 h，TCCA 41.7 mg·L-1組畸形率達(dá)（9.3%±2.8）%（P＜0.05）；暴露后 72 h，TCCA 20.8和41.7 mg·L-1組畸形率分別為（6.7±3.4）%和（13.3±3.4）%（P＜0.05）；暴露后 96 h，41.7 mg·L-1組畸形率達(dá)（14.0%±2.8）%（P＜0.05）（圖3）。

Fig.2 Mortality of zebrafish embryos exposed to TCCA.Zebrafish embryos were treated with TCCA 10.4，20.8 and 41.7 mg·L-1 during 2-98 hpf.Mortality was measured at 48，72 and 96 h after TCCA exposure，respectively.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control（0.0）group.

Fig.3 Malformation of zebrafish embryos exposed to TCCA.See Fig.2 for the zebrafish embryo treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control（0.0）group.

2.3 TCCA對(duì)斑馬魚心率的影響

與正常對(duì)照組相比，TCCA暴露后48 h，僅41.7 mg·L-1組心率顯著降低（P＜0.05）；暴露后72 h，TCCA 20.8和41.7 mg·L-1組心率均顯著降低（P＜0.05）；暴露后96 h，TCCA各濃度組心率均顯著降低（P＜0.05）（圖4）。

2.4 TCCA對(duì)斑馬魚胚胎組織SOD活力的影響

與正常對(duì)照組相比，TCCA暴露后4和6h，TCCA 20.8和41.7 mg·L-1組SOD活力均顯著下降（P＜0.05），暴露后2 h，TCCA各濃度組SOD活力無顯著變化（圖5）。

2.5 TCCA對(duì)斑馬魚幼魚視網(wǎng)膜組織病理結(jié)構(gòu)的影響

正常對(duì)照組斑馬魚腦部發(fā)育正常，視網(wǎng)膜色素上皮層、感光細(xì)胞層、外界膜、外核層、外網(wǎng)層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、視神經(jīng)纖維層和內(nèi)界膜發(fā)育正常，而TCCA 10.4 mg·L-1組眼部與腦部出現(xiàn)間隙；20.8和41.7 mg·L-1組視網(wǎng)膜分層完全消失，眼部與腦部的空隙變大（圖6）。

Fig.4 Heart rate of zebrafish embryos exposed to TCCA.See Fig.2 for the zebrafish embryos treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with normal control（0.0）group.

Fig.5 Effect of TCCA on superoxide dismutase（SOD）activity in zebrafish embryos.Zebrafish embryos were treated with TCCA 10.4，20.8 and 41.7 mg·L-1during 2-8 hpf and the SOD activity was detected at 2，4 and 6 h after TCCA exposure，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control（0.0）group.

Fig.6 Effect of TCCA on histopathology in zebrafish larvae by HE staining（×400）.Zebrafish embryos/larvae were treated with TCCA during 2 hpf to 7 d.Yellow arrows indicate the eye and brain tissue gaps and eye lesions.

3 討論

胚胎時(shí)期暴露于毒物中，能對(duì)脊椎動(dòng)物，特別是卵生脊椎動(dòng)物（如魚類和鳥類）產(chǎn)生嚴(yán)重的傷害。研究表明，這些物種在生命早期對(duì)污染物的生態(tài)毒理效應(yīng)最敏感［9-11］。本研究通過測(cè)定TCCA暴露48 h斑馬魚胚胎LC50，選擇10.4，20.8和41.7 mg·L-1作為TCCA暴露劑量。研究結(jié)果顯示，TCCA對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚具有致死和致畸的毒性效應(yīng)，且TCCA對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚的致死作用發(fā)生在暴露72 h以內(nèi)，染毒72～96 h幼魚很少再發(fā)生死亡，因此致死率與致畸率很接近，這可能與染毒劑量較低有關(guān)，也可能與TCCA在生物體內(nèi)代謝途徑有關(guān)，需進(jìn)一步研究闡明。

氯化消毒劑暴露可導(dǎo)致心功能紊亂，血液流動(dòng)減慢，使得氧和營養(yǎng)物質(zhì)不能充分供給機(jī)體，從而導(dǎo)致畸形與死亡。經(jīng)消毒劑氯胺、二氧化氯或次氯酸鈉處理的再生水均可引起斑馬魚胚胎心率減緩和畸形等毒性反應(yīng)［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，TCCA暴露引起斑馬魚胚胎心率下降，表明TCCA對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育具有毒性。

SOD是機(jī)體防御氧化損傷的關(guān)鍵酶之一，普遍存在于水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)。可以通過催化歧化反應(yīng)清除體內(nèi)過量的O-2，將其分解為H2O2和O2，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷［14-15］。大量研究表明，氯化消毒劑進(jìn)入生物體內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧。SOD是生物體有效清除活性氧的重要酶類之一，被稱為生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的第一道防線［16］，其活性可反映機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，可作為指示氯化消毒劑對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚發(fā)育毒性的早期預(yù)警［6-7］。研究表明，農(nóng)藥、重金屬和納米材料等暴露導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，自由基增多，H2O2含量相應(yīng)增加，導(dǎo)致SOD的輔基被還原，活性下降，進(jìn)一步使其清除自由基的能力降低，自由基積累造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，累積到一定限度會(huì)損害機(jī)體合成酶的能力，并改變酶本身構(gòu)象，導(dǎo)致不可逆的毒性損傷［17-18］。本研究結(jié)果顯示，TCCA暴露后斑馬魚胚胎組織SOD活性下降，提示TCCA對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚的發(fā)育毒性可能與氧化脅迫有關(guān)。

含氯的水溶液對(duì)眼及黏膜均有刺激作用［19］，消毒劑副產(chǎn)物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)具有生殖和神經(jīng)毒性［20-21］。本研究結(jié)果顯示，TCCA暴露后，斑馬魚幼魚眼部視網(wǎng)膜組織形態(tài)異常。

綜上所述，TCCA對(duì)斑馬魚胚胎及幼魚發(fā)育具有毒性作用，能引起胚胎發(fā)育早期SOD活性下降，并造成幼魚視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)損傷。

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（本文編輯：趙 楠）

Developmental toxicity of trichloroisocyanuric acid on zebrafish embryos and larvae

YAN Xue-ying1,YANG Lin-qing2,WU De-sheng2,LIU Su-chun1,YUAN Jian-hui2,LIU Jian-jun2
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Shenzhen Center for Disease Control and Prevention,Shenzhen 518055,China)

OBJECTlVETo investigate the developmental toxicity of a new disinfectant trichloroisocyanuric acid(TCCA)on zebrafish embryos and larvae.METHODSZebrafish embryos of 2 h post fertilization(hpf)were exposed to TCCA:①The embryos were exposed to a culture medium containing TCCA 0,50,100,150,200,250 and 300 mg·L-1for 48 h before 50%lethal concentration(LC50)was calculated.②The embryos were exposed to a culture medium containing TCCA 0,10.4,20.8 and 41.7 mg·L-1for 96 h.The mortality,malformation rate and heart rate of embryos and larvae were measured at 48,72 and 96 h after TCCA exposure.The expression of superoxide dismutase(SOD)was detected at 2,4 and 6 h after TCCA exposure.The pathological changes in the head of zebrafish larvae were observed 7 d after exposure by HE staining.RESULTSLC50of 48 h after TCCA exposure was 166.9 mg·L-1.Compared with normal control group,the mortality and malformation rate of zebrafish embryos were significantly increased(P＜0.05)in TCCA 41.7 mg·L-1group,but the heart rate was decreased significantly(P＜0.05)in each dose of TCCA group at 96 h after TCCA exposure.At 72 h after TCCA exposure,the mortality rate of zebrafish embryos was significantly increased(P＜0.05)in TCCA 41.7 mg·L-1group,the malformation rate of zebrafish embryos was increased(P＜0.05)and the heart rate of zebrafish embryos was decreased(P＜0.05)in 20.8 and 41.7 mg·L-1groups.At 48 h after TCCA exposure,the heart rate of zebrafish embryos was decreased significantly(P＜0.05)in 41.7 mg·L-1group.The SOD activity of zebrafish embryos in 20.8 and 41.7 mg·L-1groups was significantly lower than that of control group(P＜0.05).At 7 d after exposure,the brain and ocular space of larvae were enlarged and the ocular retina layers were not obvious in any dose of TCCA groups.CONCLUSlONTCCA has toxic effect on zebrafish embryonic development,which can down-regulate SOD activity in the early developmental stage of embryos and damage the retina tissue of larvae.

trichloroisocyanuric acid;embryonic development;retina;zebrafish

The project supported by Shenzhen Science and Technology R&D Fund Project(CYJ20140410171018510);Shenzhen Municipal Health Commission commissioned the Construction of Key Disciplines to Enhance the Project(201506064);and Shenzhen Science and Technology R&D Funding Disciplines Project(JCYJ20160328144536436)

LIU Su-chun,E-mail:liusuchun@163.com,Tel:(0731)4617007;WU De-sheng,E-mail:dswucn@126.com,Tel:(0755)25601914（

2017-04-10 接受日期：2017-07-17）

A

1000-3002-（2017）07-0736-06

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.07.006

深圳市科技研發(fā)資金項(xiàng)目（CYJ2014041017-1018510）；深圳市衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)能力提升項(xiàng)目（201506064）；深圳市科技研發(fā)資金學(xué)科布局項(xiàng)目（JCYJ20160328144536436）

閆雪瑩，女，碩士研究生，主要從事營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究。

劉素純，E-mail：liusuchun@163.com，Tel：（0731）4617007；吳德生，E-mail：dswucn@126.com，Tel：（0755）25601914