魏愛麗＊，龍 ?。?微，丁 銳，陳 偉，王莉莉

（1.抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850）

基于細胞高內(nèi)涵分析表征氮芥HN-3的細胞毒性

魏愛麗1，2＊，龍 隆1，2＊，李 微1，2，丁 銳1，2，陳 偉1，2，王莉莉1，2

（1.抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850）

目的研究氮芥HN-3對不同來源細胞的毒性表型特征。方法HN-3 100，300和450 μmol·L-1分別作用于原代人胚表皮角質(zhì)細胞（HEKf），原代成人皮膚成纖維細胞（HDFa）和人肺成纖維細胞（HLF）0.5，2，4，6，8，24和48 h后，采用基于細胞成像的多參數(shù)分析技術(shù)，檢測HN-3對細胞存活、細胞核、細胞骨架（微絲和微管）、線粒體膜電位（MMP）、氧化應激、核膜通透性（NMP）、磷酸化組蛋白、溶酶體、自噬、細胞周期和凋亡等參數(shù)的影響。結(jié)果HN-3引起不可逆性的細胞損傷，表現(xiàn)為存活細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01）。在存活細胞數(shù)量顯著減少前，從0.5 h開始，細胞內(nèi)活性氧和磷酸化組蛋白水平即顯著升高，谷胱甘肽含量顯著降低（P＜0.01）。HEKf細胞內(nèi)溶酶體在0.5 h時減少，而HDFa和HLF細胞內(nèi)溶酶體則分別在0.5和2 h升高，并伴有微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（LC3B）蛋白表達升高。伴隨存活細胞數(shù)量減少，HEKf細胞核亮度升高，核面積減少，微絲、微管亮度和面積減少，MMP顯著降低（P＜0.01），溶酶體亮度有增加趨勢；與此相反，HDFa和HLF細胞表現(xiàn)為核面積增加，微絲、微管亮度和面積增加，MMP顯著升高（P＜0.01），但溶酶體亮度增加，且HLF細胞LC3B的含量顯著升高（P＜0.01）；同時，3種細胞均有NMP增高和錳超氧化物歧化酶含量增加，G2期阻滯。此外，HEKf細胞出現(xiàn)早期和晚期凋亡，HDFa細胞出現(xiàn)早期凋亡。結(jié)論HN-3誘發(fā)早期的細胞損傷效應包括DNA損傷、氧化脅迫和溶酶體損傷，晚期導致MMP失衡、NMP增加、G2期細胞周期阻滯；此外，HN-3特異性地誘導HEKf細胞核固縮、細胞骨架蛋白核聚集和細胞凋亡；誘導HDFa和HLF細胞核腫脹和細胞骨架松散，并最終導致HDFa細胞早凋和HLF細胞自噬性死亡。

氮芥；細胞毒表型；DNA損傷；氧化應激；高通量篩選分析

硫芥是一戰(zhàn)中被廣泛使用并造成慘重傷亡的強殺傷力化學武器，是一種以皮膚糜爛為主兼具全身中毒為特點的毒劑［1］。因為硫芥具有芥末氣味，故又被稱為芥子氣，其沸點高，揮發(fā)度小，易溶于有機溶劑和脂肪類組織，極易滲入皮膚造成人體嚴重損傷，同時具有病程長、痊愈慢、后遺癥多等病理特點［2-4］。關(guān)于硫芥的損傷機制已有大量的研究報道［4-8］，其毒性損傷的本質(zhì)在于其強烷化性，能與特定細胞大分子共價交聯(lián)結(jié)合，致使細胞大分子結(jié)構(gòu)、功能、相關(guān)信號通路和細胞結(jié)構(gòu)變化以及最終的亞細胞器、細胞功能紊亂和結(jié)構(gòu)損傷［2，7］。這些不同階段的細胞損傷事件與硫芥誘發(fā)皮膚組織損傷的整個病理生理過程密切相關(guān)。氮芥是用氮原子代替了硫芥中的硫原子合成的系列化合物，分為N，N-二（2-氯乙基）乙胺（HN-1）、N，N-二（2-氯乙基）甲胺（HN-2）和三（2-氯乙基）乙基胺（HN-3）3種類型［9-10］，為硫芥的類似物，具有和硫芥相似的結(jié)構(gòu)和化學性質(zhì)以及毒性作用，其中HN-3的毒性最強。隨著氮芥抗癌作用的發(fā)現(xiàn)，對氮芥的研究越來越偏向于癌癥治療及化合物系列結(jié)構(gòu)改造，而忽略了其作為化學戰(zhàn)劑具有與硫芥同等的危險性［1，9，11］。另一方面，迄今尚無針對兩者的有效防治藥物，故研究氮芥的毒性效應具有重要的意義。近年研究報道，HN-2作用小鼠皮膚誘導DNA損傷、氧化應激和絲裂原活化蛋白激酶/蛋白激酶B-轉(zhuǎn)錄因子AP1（mitogen-activated protein kinases/protein kinase B-AP1，MAPK/Akt-AP1）途徑的活化，導致炎癥和蛋白水解介質(zhì)釋放［11］；抑制過度炎癥反應可對抗氮芥引起的損傷［12］；在小鼠皮膚角質(zhì)細胞JB6上，HN-2也能誘導DNA損傷并介導相關(guān)的修復損傷反應，阻滯細胞周期［11，13］。為更好地了解氮芥的細胞毒性效應，本研究在探索硫芥細胞毒性表型譜研究的基礎(chǔ)上，采用高內(nèi)涵細胞表型分析技術(shù)平臺，選擇2種原代皮膚細胞和1種永生化正常人肺細胞，系統(tǒng)地測定HN-3損傷細胞表型特征，以期為尋找損傷防治藥物提供線索和思路。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

HN-3（純度≥94%）由軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所提供。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Thermo Scientific HyClone公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自美國Sigma-Aldrich公司；線粒體膜電位染料Mito Tracker Red CMXRos、溶酶體、pH染料Lyso Tracker Red、微絲染料Alexa Flour 488標記的鬼筆環(huán)肽、凋亡檢測染料、死細胞染料TOTO-3 iodide、全細胞染料Cell Mask Deep Red、細胞核染料Hoechst33342、谷胱甘肽染料mBCI、活性氧染料CM-H2DCFDA、兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）單克隆抗體、小鼠抗α-微管蛋白單克隆抗體、小鼠抗錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）單克隆抗體、小鼠抗磷酸化組蛋白（phospho-histone H2AX，pH2AX）單克隆抗體、Alexa Fluor 488標記的驢抗小鼠IgG二抗、Alexa Fluor 549標記的驢抗小鼠IgG二抗、Alexa Fluor 549標記的驢抗兔IgG二抗均購自購自美國Life Technologies公司；甲醛溶液、TritonX-100、青霉素、鏈霉素及其他常規(guī)化學試劑為國產(chǎn)試劑。

1.2 細胞和培養(yǎng)

原代人胚表皮角質(zhì)細胞（human epidermal keratinocytes-fetal，HEKf）和原代成人皮膚成纖維細胞（human dermal fibroblasts-adult，HDFa）購自美國ScienCell公司，按照產(chǎn)品說明書進行培養(yǎng)和使用。人肺成纖維細胞（human lung fibroblasts，HLF）系為本實驗室自存，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10%FBS，100 kU·L-1的青霉素、鏈霉素和氨芐青霉素。細胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞染毒方案

HN-3即配即用。將HN-3溶解于DMSO配成150 mmol·L-1母液，再用含DMSO的細胞培養(yǎng)液稀釋成3×（100，300和450 μmol·L-1）的工作液，其中DMSO終濃度為0.3%，同時采用含0.3%DMSO培養(yǎng)液作為空白對照。HEKf，HDFa和HLF細胞以每孔6×103接種于96孔板（黑邊底透），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，然后按每孔50 μL分別加入不同濃度HN-3溶液，按實驗方案處理細胞不同時間（表1）。

1.4 細胞表型多參數(shù)檢測

按照細胞表型分析組合（表1）所示，分別進行6個分析組合的參數(shù)標記，檢測參數(shù)組合和暴露時間均參照文獻［14］，每組實驗單獨進行，均設(shè)置細胞對照組，每組設(shè)3個平行孔。

1.4.1 細胞核、微絲和微管檢測

細胞暴露HN-3處理結(jié)束后，每孔加入75 μL固定液（含12%甲醛的PBS溶液），室溫避光固定20 min；棄液，每孔加入 200 μL透膜液（含 0.1%Triton X-100的PBS溶液），室溫避光孵育30 min；棄液，每孔使用200 μL PBS洗1 次，再加入50 μL Alexa Flour 488標記鬼筆環(huán)肽微絲染料和細胞核染料，室溫避光孵育1 h；棄液，每孔使用200 μL PBS洗3次，再加入200 μL封閉液（含5%BSA的PBS溶液）室溫孵育1 h；棄液，每孔加入40 μL小鼠抗微管蛋白單克隆抗體（1∶500稀釋）工作液，4℃避光孵育過夜；棄液，每孔用100 μL封閉液洗3次，再加入50 μL Alexa Flour 549標記的驢抗小鼠IgG二抗（1∶500稀釋）工作液，室溫避光孵育1 h；棄液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入200 μL PBS溶液，上機檢測。

1.4.2 細胞核和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP），MnSOD和核膜通透性（nuclear membrane permeability，NMP）檢測

細胞在HN-3暴露處理細胞結(jié)束前0.5 h，每孔加入50 μL細胞核染料、MMP染料和死細胞核染料，37℃孵育0.5 h；每孔加入100 μL固定液，室溫避光固定20 min；棄液，每孔加入200 μL透膜液，室溫避光孵育30 min；棄液，每孔使用200 μL PBS洗1次，再加入200 μL封閉液室溫孵育1 h；棄液，每孔加入40 μL小鼠抗MnSOD單克隆抗體（1∶500稀釋）工作液，4℃避光孵育過夜；棄液，每孔用100 μL封閉液洗3次，再加入50 μL Alexa Fluor 488標記的驢抗小鼠IgG二抗（1∶500稀釋）工作液，室溫避光孵育1 h；棄液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入200 μL PBS溶液，上機檢測。

1.4.3 細胞核、LC3B蛋白、溶酶體和pH2AX檢測

細胞在HN-3暴露處理結(jié)束前0.5 h，每孔加入50 μL細胞核染料和溶酶體染料，37℃孵育0.5 h；每孔加入100 μL固定液，室溫避光固定20 min；棄液，每孔加入200 μL透膜液，室溫避光孵育30 min；棄液，每孔使用200 μL PBS洗1次，再加入200 μL封閉液室溫孵育1 h；棄液，每孔加入40 μL小鼠抗pH2AX單克隆抗體（1∶1000）工作液，4℃避光孵育過夜；棄液，每孔用100 μL封閉液洗3次，每孔加入40 μL兔抗LC3B單克隆抗體工作液，室溫孵育1 h；棄液，再加入50 μL Alexa Flour 488標記的驢抗小鼠IgG二抗（1∶500）和Alexa Flour 549標記的驢抗兔IgG二抗（1∶500）工作液，室溫避光孵育1 h；棄液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入200 μL PBS溶液，上機檢測。

Tab.1 Multi-parametric cellular phenotypic assay panel and HN-3 treated protocol time

1.4.4 HDFa細胞活性氧和谷胱甘肽檢測

取活性氧染料CM-H2DCFDA母液（50 mg CM-H2DCFDA溶于86.5 μL DMSO）10 μL加入至0.5 mL HBSS中，取谷胱甘肽染料mBCI母液（5 mg mBCI溶于 220 μL DMSO）10 μL 加入至 0.5 mL HBSS中，混勻；再分別將上述溶液和1 μL的核染料加入到9 mL預溫至37℃的HBSS溶液中，混勻，得染色工作液（根據(jù)實際情況按比例配置所需體積溶液）；染毒處理后細胞用HBSS洗1次，每孔加入100 μL染色工作液，37℃染色45 min；細胞換預溫至37℃的完全培養(yǎng)液孵育5 min；每孔細胞用100 μL HBSS洗1次，再換200 μL HBSS上機檢測。

1.4.5 細胞凋亡的檢測

細胞染毒處理后，棄液，每孔100 μL結(jié)合緩沖液（mmol·L-1：NaCl 140，HEPES 10，CaCl22.5，pH 7.4）洗1次，加入40 μL凋亡檢測染料（磷脂酰絲氨酸-Alexa Fluor 488膜聯(lián)蛋白（Annexin）Ⅴ用含PI 3 μmol·L-1和 Hoechst33342 1 μmol·L-1的結(jié)合緩沖液1∶500稀釋），室溫避光染色30 min，補加160 μL結(jié)合緩沖液；每孔加入100 μL含有12%甲醛的結(jié)合緩沖液固定，室溫避光固定20 min棄液，每孔加入200 μL PBS溶液，上機檢測。

1.5 圖像采集及分析

完成標記的細胞，使用IN Cell Analyzer 2000活細胞成像系統(tǒng)（美國GE公司）進行細胞圖像采集，選擇20倍物鏡，根據(jù)標記的特定熒光標記分子的特性采用相應的激發(fā)和發(fā)射波長檢測通道進行檢測，DIPI通道（激發(fā)/發(fā)射光波長360 nm/460 nm）檢測Hoechst33342染色；FITC通道（激發(fā)/發(fā)射光波長475 nm/535 nm）檢測Alexa Fluor 488染色；Cy3通道（激發(fā)/發(fā)射光波長535 nm/620 nm）檢測Mito Tracker Red，Lyso Tracker Red，PI，Alexa Fluor 546染色；Cy5通道（激發(fā)/發(fā)射光波長360 nm/460 nm）檢測Cell Mask Deep Red，TOTO-3 iodid，Alexa Fluor 64染色。每孔采集9個視野，細胞數(shù)總量不少于200個，采集圖像儲存于數(shù)據(jù)庫。使用IN Cell Analyzer Workstation圖像分析軟件（GE公司）中的Multi Target Analysis分析模塊，對獲得圖像進行分析，表1為各指標輸出參數(shù)。除了細胞凋亡和周期外，參數(shù)均通過細胞中靶目標標記的熒光來直接表征。細胞凋亡分析以AnnexinⅤ和PI染色的熒光強度分別為橫、縱坐標進行細胞分類，包括存活、早期凋亡、晚期凋亡和細胞死亡4類。細胞周期分析是根據(jù)Hoechst3342標記細胞核的面積、核染色平均熒光強度及總強度參數(shù)，使用Analyzer Workstation分析軟件、Multi Target Analysis模塊中的Decision Tree Filter將細胞周期分為G0/G1，S，G2和M期，后2個分析方法原理與流式細胞儀分類方法相同。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理，計算3復孔數(shù)據(jù)的平均值及標準差。以0.3%DMSO處理組為細胞對照組，進行數(shù)據(jù)歸一化處理，并計算HN-3處理組的變化率：細胞數(shù)變化率（%）=（細胞對照組參數(shù)值-HN-3處理組參數(shù)值）/細胞對照組參數(shù)值×100%；HN-3處理組參數(shù)變化率（%）=（HN-3處理組參數(shù)值-細胞對照組參數(shù)值）/細胞對照組參數(shù)值×100%。凋亡和細胞周期的數(shù)據(jù)由IN Cell Analyzer Workstation圖像分析軟件直接得出。數(shù)據(jù)用±s表示。采用Graphpad 6.0作圖統(tǒng)計軟件，使用One-way ANOVA進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HN-3對HEKf，HDFa和HLF細胞核形態(tài)和骨架的影響

圖1A～3A所示，HN-3 300 μmol·L-1作用細胞48 h，細胞核數(shù)量明顯減少（P＜0.01），HEKf（圖1A）細胞核縮小，微絲和微管面積減少；HDFa（圖2A）和HLF（圖3A）細胞由長梭狀排列，變?yōu)樗缮⑵瑺罘植迹⒐芤院藶橹行木奂?，微絲松散分布。對采集的圖片進行分析，以參數(shù)的變化率的百分值作圖。圖1B～3B顯示，3類細胞隨HN-3作用濃度的增加，細胞抑制率逐漸增加。細胞核形態(tài)、微絲和微管也隨濃度的增加，變化程度隨之增加。HN-3作用HEKf細胞（圖1B）核面積減少，形態(tài)參數(shù)增大，亮度增加，均勻程度降低；微絲和微管的亮度和面積降低（P＜0.01）；HDFa細胞（圖2B）核面積增加，均勻程度降低（P＜0.01），微絲和微管的亮度和面積增加（P＜0.01）；HLF細胞（圖3B）核面積增加，形態(tài)參數(shù)增大，亮度降低，均勻程度降低，微絲和微管的亮度和面積增加（P＜0.01）。由時間效應曲線圖可見，HEKf細胞（圖1C）自6 h后，HDFa（圖2C）和HLF（圖3C）細胞自8 h后細胞增殖抑制率顯著升高并具有時間相關(guān)性（r=0.99，P＜0.01），且細胞核和骨架的各參數(shù)隨細胞數(shù)量的顯著減少發(fā)生明顯改變（P＜0.01）?？梢?，細胞核形態(tài)和骨架的改變是HN-3導致細胞毒性損傷的晚期事件。HEKf與HDFa和HLF細胞在胞核和骨架參數(shù)上具有不同的變化趨勢，后兩種細胞的變化趨勢基本一致。

2.2 HN-3對HEKf，HDFa和HLF細胞周期的影響

Fig.1 Effect of HN-3 on nuclear morphology and cytoskeleton of HEKf cells by high content analysis.A：the typical images of the cells treated with HN-3 300 μmol·L-1for 48 h.B：the cells were treated for 48 h with different concentrations.C：the cells were treated with HN-3 300 μmol·L-1for 0.5-48 h.Nuc：nuclear；1/FF：1/（form factor）；Int：staining intensity；Int CV：coefficient of variation of staining intensity；TA：total area.The change rate of cell count（%）=（parameter value of control group-parameter value of HN-3 treatment group）/parameter value of control group×100%；the change rate of other eight parameters（%）=（parameter value of HN-3 treatment group-parameter value of control group）/parameter value of control group×100%.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.2 Effect of HN-3 on nuclear morphology and cytoskeleton of HDFa cells by high content analysis.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

HN-3處理細胞8 h，HEKf和HDFa細胞有G2和M期阻滯，HLF細胞有G0/G1阻滯；HN-3處理細胞24和48 h，3種細胞均表現(xiàn)為G2期阻滯（圖4）?？梢姡琀N-3主要將細胞周期阻滯在G2期，使之不能順利進入細胞分裂期。

2.3 HN-3誘導HEKf，HDFa和HLF細胞凋亡

HN-3 450 μmol·L-1處理 HEKf 細胞 48 h，AnnexinⅤ染色明顯，PI染色不明顯（圖5A），表示HN-3可誘導細胞早期凋亡；處理HDFa細胞48 h，AnnexinⅤ和PI染色均明顯（圖5B），說明誘導細胞晚期凋亡。HEKf細胞（圖5C）在24和36 h即有明確的細胞早凋現(xiàn)象（P＜0.01），48 h隨HN-3濃度增加，發(fā)生早晚凋亡現(xiàn)象的細胞比率逐漸增加；在HDFa細胞（圖5D）上，僅在36 h后有細胞早凋現(xiàn)象（P＜0.01）；而HLF細胞（圖5E）未出現(xiàn)明顯的細胞凋亡。隨給藥時間和HN-3濃度的增加，壞死細胞所占的比例也增加。結(jié)果表明，HN-3在不同細胞背景上誘導細胞凋亡的能力不同，3種細胞HN-3中毒后的細胞死亡機制有所不同。

Fig.3 Effect of HN-3 on nuclear morphology and cytoskeleton of HLF cells by high content analysis.See Fig.1 for the cell treatment and legend.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.4 Effect of HN-3 on cell cycle of HEKf，HDFa and HLF cells.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.4 HN-3對HEKf，HDFa和HLF細胞線粒體膜電位、氧化應激和核膜通透性的影響

Fig.5 Effect of HN-3 on cell apoptosis in HEKf，HDFa and HLF cells.A and B：HEKf and HDFa cells were treated with HN-3 450 μmol·L-1for 48 h ，respectively；C，D and E：the quantitative analysis results of different concentrations of HN-3 treated for 24，36 and 48 h in HEKf（C），HDFa（D）and HLF（E）cells，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

HN-3 300 μmol·L-1處理細胞48 h，HEKf細胞（圖6A1）MMP降低，HDFa（圖6B1）和HLF（圖6C1）細胞MMP升高，3類細胞的MnSOD和NMP均增加。對采集的圖片進行分析，以參數(shù)的變化率的百分值為縱坐標，濃度或時間為橫坐標作圖。如圖6A2-C2表示，參數(shù)的變化程度隨濃度的增大依次增加，HEKf細胞（圖6A2）MMP先升高（P＜0.01）再隨濃度的增加有逐漸降低的趨勢（P＜0.01），說明濃度越大，對線粒體的損傷越嚴重，而HDFa（圖6B2）和HLF（圖6C2）細胞的MMP則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢（P＜0.01）。說明HN-3對HEKf細胞與HDFa，HLF細胞線粒體損傷類型不同，HEKf更為嚴重。而MnSOD和NMP隨濃度的增加而持續(xù)增加（P＜0.01），其中HEKf和HLF細胞的MnSOD和HDFa細胞的NMP的增加最為顯著。鑒于MnSOD水平的升高既反映細胞的氧化脅迫水平也反映細胞的氧化應激能力，推測HDFa細胞氧化脅迫或應激修復的能力相對較弱。HN-3暴露的時間效應曲線顯示，HN-3 300 μmol·L-1處理 HDFa（圖6B3）和HLF（圖6C3）細胞，上述3個參數(shù)在24h時才發(fā)生明顯的變化（P＜0.01），而HEKf細胞（圖6A3）則是在48 h才有明顯的變化（P＜0.01）。這些變化晚于細胞數(shù)量開始顯著減少的時間。除此之外，本研究還檢測了HN-3對HDFa細胞內(nèi)ROS和GSH的影響，如時間效應曲線（圖6B2）所示，在0.5 h時GSH含量迅速降低（P＜0.01），約降至總含量的20%，之后一直持續(xù)到6 h，而ROS含量呈逐漸增加趨勢（P＜0.01），同樣至6 h基本達到最大值，約75%增加。表明HN-3能快速誘發(fā)HDFa細胞ROS釋放和GSH耗竭導致細胞氧化應激損傷，推測HN-3對另2個細胞的氧化應激損傷能力更強。

2.5 HN-3對HEKf，HDFa和HLF細胞pH2AX，LC3B和溶酶體的影響

Fig.6 Effect of HN-3 on MnSOD，MMP，NMP，GSH and ROS in HEKf（A1-A3），HDFa（B1-B3）and HLF（C1-C3）cells.A1，B1 and C1：typical images of nucleus，MnSOD，MMP and NMP in HEKf（A），HDFa（B）and HLF（C）cells treated with HN-3 300 μmol·L-1for 48 h；A2，B2 and C2：the cells were treated with NH-3 100，300 and 450 μmol·L-1for 48 h；A3，B3 and C3：the cells were treated with HN-3 300 μmol·L-1for 0.5-48 h.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

Fig.7 Effect of HN-3 on pH2AX，Lyso and LC3B in HEKf（A1-A3），HDFa（B1-B3）and HLF（C1-C3）cells.A1，B1 and C1 ：typical images of nucleus，pH2AX，lysosome and LC3B in HEKf，HDFa and HLF cells were treated with HN-3 300 μmol·L-1 for 24 ，except that pH2AX was measured in HLF cells for 4 h；A2，B2，C2：the cells were treated with HN-3 100，300 and 450 μmol·L-1 for 24 h，except that pH2AX was measured in HLF cells for 4 h；A3，B3 and C3：the cells were treated with HN-3 300 μmol·L-1for 0.5-48 h.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

HN-3 300 μmol·L-1處理細胞24 h，HEKf細胞（圖7A1）LC3B蛋白亮度輕度增加，溶酶體亮度增加，HDFa細胞（圖7B1）LC3B蛋白亮度基本無變化，溶酶體亮度增加，HLF細胞（圖7C1）LC3B蛋白亮度明顯增加，溶酶體亮度輕度增加，3類細胞的pH2AX熒光亮度均有明顯的增加。LC3B、溶酶體和pH2AX的變化程度隨濃度的增大依次增加（圖7A2-C2）。在3類細胞中，pH2AX的亮度增加均很顯著（P＜0.01），另HEKf細胞（圖7A2）溶酶體亮度增加最明顯（P＜0.01），HLF細胞（圖7C2）LC3B蛋白亮度增加最明顯（P＜0.01），意味著3類細胞的DNA損傷均很強，HEKf細胞溶酶體損傷最嚴重，HLF細胞有很強的自噬能力。由時間效應曲線所示（圖7A3-C3），3類細胞自0.5 h起，pH2AX含量就開始增加（P＜0.01），至4 h時，pH2AX含量增加＞1倍（P＜0.01）；在HEKf和HDFa細胞上的持續(xù)測定顯示，至 24 h，pH2AX含量增加至 3～4倍（P＜0.01）。表明HN-3具有較強和持續(xù)的DNA損傷作用。在HEKf細胞（圖7A3）上，LC3B的表達含量與細胞數(shù)量曲線基本一致，即LC3B蛋白是伴隨細胞死亡發(fā)生變化的；而HN-3暴露0.5 h，溶酶體減少（P＜0.05），之后恢復并持續(xù)增大（P＜0.01）。提示HN-3作用HEKf細胞出現(xiàn)的自噬可能是死亡性自噬，且在早期產(chǎn)生了一過性溶酶體損傷作用。在HDFa細胞（圖7B3）上，0.5 h時LC3B增加約25%（P＜0.01），之后回復。相應的溶酶體在2 h時有一過性增加（P＜0.01），之后回復，并在6 h 減少（P＜0.01），8 h后，伴隨細胞數(shù)量的減少而逐漸增加（P＜0.01）。提示HDFa細胞存在一過性自噬修復現(xiàn)象，但修復能力較弱。在HLF細胞（圖7C3）上，0.5 h時溶酶體和LC3B有一輕度的增加（P＜0.05），之后LC3B隨著時間的延長含量顯著上升（P＜0.01），至細胞出現(xiàn)死亡后出現(xiàn)降低的趨勢，而溶酶體只有早期應激性和細胞死亡后升高（P＜0.05），提示HLF細胞具有較強的自噬修復作用。以上結(jié)果表明，HN-3在3種不同類型的細胞中誘發(fā)的細胞自噬反應不同，永生化HLF細胞自噬能力最強。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，DNA損傷、氧化脅迫和溶酶體損傷是HN-3損傷細胞的早期事件，MMP失衡、NMP增加、G2期細胞周期阻滯和細胞凋亡是細胞損傷晚期事件。pH2AX含量增加、G2期阻滯、MnSOD和NMP增加及溶酶體亮度增加是HN-3損傷3類細胞共有的特征。HN-3作用3類不同來源的細胞系，會產(chǎn)生不完全相同的毒性特征。在細胞核和骨架的變化上，HN-3會造成HEKf細胞核、微絲和微管皺縮；造成HDFa和HLF細胞出現(xiàn)核面積增加，微絲和微管的亮度和面積增加，表現(xiàn)為細胞呈片狀分布。在線粒體損傷上，HEKf細胞MMP降低，HDFa和HLF細胞MMP升高，說明HEKf細胞有更嚴重的線粒體損傷。在氧化應激上，HDFa細胞在HN-3處理0.5 h時，ROS含量迅速升高，谷胱甘肽降低，出現(xiàn)氧化應激反應，但是只有在高濃度HN-3處理時才有明顯的MnSOD增加，而HEKf和HLF細胞的MnSOD在低濃度HN-3處理時有顯著的增加。在細胞死亡方式上，HN-3作用HEKf，HDFa和HLF細胞出現(xiàn)細胞數(shù)量明顯降低的時間分別是8，24及24 h，出現(xiàn)凋亡的時間是24及48 h或不出現(xiàn)凋亡，且HEKf細胞出現(xiàn)早期凋亡和晚期凋亡，自6 h后有LC3B的增加，HDFa只有出現(xiàn)早凋，LC3B的含量基本無變化，而HLF自0.5 h后LC3B的含量顯著上升，隨著濃度和時間增加，具有增加的趨勢，說明HEKf細胞對HN-3的毒性作用最敏感，且HLF細胞具有強自噬修復作用，隨后是HEKf細胞，其產(chǎn)生的自噬作用很有可能是自噬性死亡。HN-3作用細胞0.5 h，即產(chǎn)生pH2AX和活性氧的升高，谷胱甘肽和溶酶體亮度降低，說明DNA、谷胱甘肽和溶酶體可能是HN-3損傷細胞的重要靶標，HN-3損傷細胞的毒性表型和文獻中報道的毒性機制一致。

永生化細胞易于操作，獲得性強，是化學品細胞毒性評價的主要實驗材料，然而長期體外傳代培養(yǎng)導致細胞在體的諸多生物學特性丟失。為了更準確反映化學品的人體危害，開發(fā)有效的對抗手段，更接近人體生理狀態(tài)的原代人源細胞成為現(xiàn)代毒理學研究倡導使用的實驗材料［15］。HN-3具有非特異性損傷機制，其在不同類型細胞上的毒性作用尚無系統(tǒng)性的比較研究。本研究選擇不同來源或類型的細胞，其中HEKf和HDFa是皮膚重要的組成細胞。其中角質(zhì)細胞由角質(zhì)形成細胞演變而來，具較強的增殖能力，有保護機體免受侵害作用；成纖維細胞由胚胎時期的間充質(zhì)細胞分化而來，在創(chuàng)傷修復中表現(xiàn)出重要的作用。HLF是永生化正常人肺成纖維細胞，也由間充質(zhì)細胞分化而來，是細胞毒研究首選細胞系。本研究發(fā)現(xiàn)，相同濃度HN-3在上述3種細胞上的細胞毒表型譜，在烷化劑損傷機制最為相關(guān)的3個參數(shù)，即DNA損傷、氧化應激和G2期阻滯，3種細胞變化特征一致。在細胞核形態(tài)、細胞骨架和MMP參數(shù)上，HDFa和HLF細胞具有相同的變化特征，而HEKf細胞的變化特征與2種成纖維細胞不一致，如HEKf細胞核皺縮、MMP下降、細胞骨架以核為中心聚集，而2種成纖維細胞多是核輕度腫脹、MMP升高、細胞骨架松散。值得注意的是，3種細胞的死亡方式表現(xiàn)不同，從HEKf，HDFa到HLF細胞，凋亡能力由強至弱，早期自噬活性由弱至強。結(jié)果說明，即使是永生化細胞HLF也可較好地反映HN-3類烷化劑的主要損傷機制；HEKf細胞較成纖維細胞對于HN-3的損傷作用更為敏感。鑒于早期自噬對抗細胞凋亡［16］，提示永生化細胞在傳代過程中獲得了更強的自噬修復能力，而致凋亡能力喪失，這一發(fā)現(xiàn)仍需要進一步證明。但也提示，基于死亡調(diào)控機制的抗芥子氣保護策略的篩選可能不適于選用永生化細胞。

結(jié)合本實驗室已發(fā)表的SM的細胞表型譜結(jié)果［14］發(fā)現(xiàn)，HN-3和硫芥在2種原代培養(yǎng)人皮膚細胞的表型譜特征，HN-3與硫芥具有類似的細胞表型特征，如DNA損傷、谷胱甘肽耗竭、活性氧釋放、溶酶體損毀、氧化應激，線粒體損傷、核膜通透性、細胞周期阻滯、凋亡和自噬等細胞毒現(xiàn)象；并在2種類型細胞上，HN-3與硫芥具有一致的表現(xiàn)。然而，在特定細胞表型上HN-3與硫芥也呈現(xiàn)出不同程度的作用，如HN-3具有更強更持久的誘導DNA損傷能力，而硫芥則表現(xiàn)為更強谷胱甘肽耗竭、谷胱甘肽釋放、氧化應激，溶酶體損傷的作用。說明硫芥急性毒性更強，HN-3潛伏期長，提示應更關(guān)注NH3長期的致突變效應。

總之，通過不同來源和不同類型細胞上，對HN-3的時間和濃度細胞表型特征的定量測定，更加明確了HN-3烷基化試劑本質(zhì)的細胞損傷效應和機制，也發(fā)現(xiàn)HN-3較硫芥具有更強的DNA損傷作用和更弱的氧化損傷、溶酶體破壞效應，其毒性的長期效應和毒性機制有待進一步研究，以期為其中毒的臨床防治提供思路。

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＊Co-first author.

2016-12-25 接受日期：2017-06-08）

（本文編輯：喬 虹）

Charaterizing cytotoxicity of nitrogen mustard HN-3 based on cellular high content analysis

WEI Ai-li1,2＊,LONG Long1,2＊,LI Wei1,2,DING Rui1,2,CHEN Wei1,2,WANG Li-li1,2
(1.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures,Beijing 100850,China;2.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China)

OBJECTIVETo study the cytotoxic characteristics of nitrogen mustard HN-3 in different cell.METHODSHuman epidermal keratinocytes-fetal(HEKf),human dermal fibroblasts-adult(HDFa)and human lung fibroblasts(HLF)cell lines were treated with HN-3 100,300 and 450 μmol·L-1for 0.5,2,4,6,12,24 and 48 h,respectively.Multi-parameter analysis technology based on cell imaging was used to examine the effects of HN-3 on cell survival,cell cycle arrest,apoptosis,autophagy and oxidative stress,along with parameters concerning nucleus,cytoskeleton(actin and tubulin),lysosome,nuclear membrane permeability(NMP),mitochondrial membrane potential(MMP)and phosphohistone H2AX(pH2AX).RESULTSHN-3 caused irreversible cellular damage by significantly decreasing the number of HEKf,HDFa and HLF cells in a time-dependent manner(P＜0.01).Before the cell number was reduced robustly,the content of reactive oxygen species and pH2AX significantly increased,but the glutathione content decreased after cells were exposed to HN-3 for 0.5 h(P＜0.01).In addition,the content of lysosome was reduced in HEKf cells at 0.5 h,but increased in HDFa and HLF cells at 0.5 and 2 h respectively,accompanied by the increase in microtubule-associated protein 1 light chain 3B(LC3B)puncta.With the significant reduction of the cell number in HEKf cell line,the nuclear intensity increased,nuclear area decreased,the intensity and area of F-actin and α-tubulin decreased,MMP decreased(P＜0.01)and lysosomal intensity increased.But the effects of HN-3 on HDFa and HLF cell lines were quite different.The nuclear area increased,the intensity and area of F-actin and a-tubulin increased,MMP increased(P＜0.01)and the intensity of lysosome increased.In HLF cells,there was an increase in LC3B puncta(P＜0.01).In all the three cell lines,NMP and manganese superoxide dismutase content were increased,and cell cycle arrested at G2phase.HN-3 Induced early apoptosis in HDFa cells but late apoptosis in HEKf cells.CONCLUSIONHN-3 causes DNA damage,oxidative stress and lysosome damage at an early stage,whereas at the late stage,the imbalance of MMP,increase in NMP,and G2phage arrest are the major cytotoxic effects.Moreover,HN-3 specifically induces nuclear condensation,cytoskeleton protein aggregation and apoptosis in HEKf cell.HN-3 Induces nuclear swelling,and loose cytoskeleton in HDFa cells and HLF cells,eventually inducing early apoptosis in HDFa cells and autophagic death in HLF cells.

nitrogen mustard;cytotoxic phenotype;DNA injury;oxidative stress;high-throughput screening assays

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81430090);the Key Technologies of Comprehensive New Drug Research and Development(2012ZX09301003-001);and the Key Technologies of Comprehensive New Drug Research and Development(2012ZX09301003-003)

WANG Li-li,E-mail:wangll63@126.com,Tel:(010)66932674

R99

A

1000-3002-（2017）07-0742-12

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.07.007

國家自然科學基金（81430090）；綜合性新藥研究開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)（2012ZX09301003-001）；綜合性新藥研究開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)（2012ZX09301003-003）

魏愛麗，女，碩士研究生，主要從事毒理學和藥物篩選研究；龍 隆，女，實驗師，主要從事藥物篩選工作。

王莉莉，E-mail：wangll63@126.com，Tel：（010）66932674

＊共同第一作者。