王淑娟+王+君+鄧方寧+姜翠鳳+李慶達(dá)

摘 要：目的：實(shí)驗(yàn)通過(guò)采集黃河三角洲地區(qū)耐鹽植物鹽芥的根際土壤，采用Martin法、SDS法、高鹽改進(jìn)法3種方法提取根際土壤的總DNA，測(cè)定提取的純度和濃度。方法：對(duì)以上3種方法進(jìn)行改進(jìn)后，獲得了較高的DNA質(zhì)量和提取率。結(jié)果：采用SDS加蛋白酶K和溶菌酶的方法，提取總DNA的濃度為145.3μg/g，A260/A280為1.82；在高鹽改進(jìn)法中將樣品反復(fù)凍融5次，提取總DNA的濃度為141.3μg/g，A260/A280為1.81。優(yōu)化后的提取方法均得到了純度較高的DNA樣品，本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)微生物多樣性的研究提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鹽芥；根際土壤；總DNA

中圖分類號(hào) Q89 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）22-0042-02

Abstract：Objective：Total DNA of the rhizosphere soil from the salt-tolerant plants Thellungiella salsugineain the Yellow River Delta was extracted by Martin method， SDS method and improved high-salt method. Method：Two modified methods were obtained. Conclusion：From the SDS method added with protease K and lysozyme， the concentration of total DNA was 145.3μg/g， A260/A280 was 1.82. After 5 times of frozen-melt treatments， 141.3μg/g total DNA concentration was obtained using improved high-salt method， A260/A280 was 1.81. These two methods got purified DNA samples， and provided the foundation for the further research of microbial diversity.

Key words：Thellungiella salsuginea；Rhizosphere soil；Total DNA

2000年，山東師范大學(xué)逆境植物實(shí)驗(yàn)室首次提議將鹽生植物鹽芥作為研究植物耐鹽性的又一模式系統(tǒng)[1]。濱州地處黃河三角洲，瀕臨渤海，多鹽漬土壤，適宜鹽生植物鹽芥的生長(zhǎng)[1]。本實(shí)驗(yàn)采集了鹽芥根際土壤，運(yùn)用Martin法、SDS法、高鹽改進(jìn)法3種方法提取土壤中的總DNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其純度。通過(guò)對(duì)3種方法進(jìn)行改良，獲得了較高濃度和純度的根際土壤總DNA，為后續(xù)微生物多樣性的研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑與藥品 EDTA、Tris-HCl、CTAB、SDS、70%的乙醇、異丙醇、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）、溶菌酶、蛋白酶K等一系列實(shí)驗(yàn)藥品。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要使用儀器 恒溫振蕩培養(yǎng)箱、核酸蛋白測(cè)定儀、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、Biorad凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品 采取鹽生植物鹽芥的根際土壤。選取4個(gè)地點(diǎn)采集鹽芥，每一個(gè)地點(diǎn)采集2株鹽芥作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，把同一個(gè)采樣點(diǎn)的2株鹽芥根際土壤混合，做為實(shí)驗(yàn)樣品，4℃冰箱中保存以備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Martin法 稱取1g土樣分別加入4個(gè)5mL無(wú)菌離心管中，依次加入0.8g酸洗石英砂，3mLDNA提取液（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸鹽，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，pH=8）[2]，渦旋混勻后，在恒溫震動(dòng)培養(yǎng)箱中以225r/min分別震蕩2h、4h、6h、8h后，在低溫高速離心機(jī)中4℃下12000r/min離心15min，用移液槍取上清液移到1.5mL 離心管中，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混勻，以12000r/min離心15min后，移到離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后室溫沉淀過(guò)夜，4℃下12000r/min離心20min后，用70%的乙醇清洗2～3次，待晾干后加入30μL的TE溶解，-20℃保存。

2.2 SDS法[3] 稱取1g土樣分別加入4個(gè)5mL無(wú)菌離心管中，依次加入1.35mLDNA提取液（100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸鹽，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，pH=8），4和5號(hào)離心管加入10μL蛋白酶K，6、7號(hào)離心管加入20μg/mL的溶菌酶和10μL蛋白酶K，在恒溫震動(dòng)培養(yǎng)箱中以225r/min震蕩2h，再加入0.15mL的20%SDS，60℃水浴2h，每隔15min輕輕顛倒幾下，水浴結(jié)束后室溫12000r/min離心15min，用移液槍收集上清于1.5mL離心管中，在沉淀中再加入0.45mL的DNA提取液和50μL20%的SDS，在振蕩器上渦旋15s，60℃水浴15min，室溫下12000r/min離心10min后，用移液槍取上清液移到1.5mL離心管中，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）混勻，以12000r/min離心15min后，移到離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后室溫沉淀過(guò)夜，4℃下12000r/min離心20min后，用70%的乙醇清洗2～3次，待晾干后加入30μL的TE溶解，-20℃保存。

2.3 高鹽改進(jìn)法 稱取1g土樣分別加入3個(gè)5mL無(wú)菌離心管中，依次加3mL DNA提取液（100mmol/L Tris-HCL，100mmol/L EDTA，100mmol/L磷酸鹽，1.5mol/L NaCl，1%的CTAB，pH=8），渦旋混勻，加入20μL蛋白酶K，37℃水浴30min，中間混勻數(shù)次，然后加入0.3mL 20% SDS在60℃下水浴2h，每隔15min混勻顛倒一次，然后放入-70℃中冷凍15min。再放入60℃水浴中融化15min，分別反復(fù)3次，5次，7次。凍融結(jié)束后4℃下12000r/min離心15min，移到1.5mL 離心管中，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25：24：1）混勻，12000r/min離心15min后移到離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后室溫沉淀過(guò)夜，4℃下12000r/min離心20min后，用70%的乙醇清洗2～3次，待晾干后加入30μL的TE溶解，-20℃保存[4，5]。endprint

2.4 根際土壤總DNA的濃度分析 將所提取到的總DNA各吸取1μL，用核酸蛋白測(cè)定儀下測(cè)定其濃度和純度。

3 結(jié)果與分析

3.1 根際土壤總DNA的提取 將運(yùn)用改良的Martin法、SDS法、高鹽改進(jìn)法對(duì)提取出來(lái)的的總DNA用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖1所示，泳道1、2、3分別是高鹽改進(jìn)法反復(fù)凍融3次，5次，7次的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融5次時(shí)DNA濃度較高（泳道2）；泳道4，5是SDS法中添加蛋白酶K，泳道6，7是SDS法中添加蛋白酶K和溶菌酶，發(fā)現(xiàn)后者濃度較高（如泳道6），但出現(xiàn)拖尾，說(shuō)明DNA出現(xiàn)斷裂。泳道8，9，10和11是采用Martin法分別振蕩2h，4h，6h和8h時(shí)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)振蕩6h和8h得到的樣品濃度較高（泳道10和11），但是振蕩8h的條帶有明顯的拖尾，說(shuō)明振蕩時(shí)間太久使得DNA斷裂。

3.2 根際土壤總DNA的分析 將提取的DNA用核算分析儀測(cè)定濃度和純度，如表1所示。結(jié)果表明，2種改良方法獲得了較高的DNA濃度和純度。一種是改良的SDS法，即在SDS法中加蛋白酶K和溶菌酶，提取總DNA的濃度為145.3μg/g，A260/A280為1.82；第二種是改良的高鹽法，即在高鹽改進(jìn)法中將樣品反復(fù)凍融5次，提取總DNA的濃度為141.3μg/g，A260/A280為1.81。

4 結(jié)論

微生物多樣性的研究是基于根際土壤總DNA的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，因此，選取有效簡(jiǎn)便的方法成為根本。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Martin法、SDS法、高鹽改進(jìn)法3種總DNA提取方法進(jìn)行了改良，高效提取鹽芥根際土壤種的總DNA，對(duì)后續(xù)微生物多樣性分析實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)編：張宏民）endprint