京尼平交聯(lián)乳清蛋白和殼聚糖膜的制備

李 媛，呂 佳，徐雨春，薛海燕

（陜西科技大學(xué)，陜西西安 710021）

京尼平交聯(lián)乳清蛋白和殼聚糖膜的制備

李 媛，呂 佳，徐雨春，*薛海燕

（陜西科技大學(xué)，陜西西安 710021）

以乳清蛋白和殼聚糖為原料制備復(fù)合膜，同時利用天然無毒的京尼平作為交聯(lián)劑，研究其制備工藝。通過單因素試驗研究成膜材料比例、熱處理溫度、塑形劑、交聯(lián)劑對乳清蛋白和殼聚糖復(fù)合膜性能的影響，并對復(fù)合膜進行表征和抑菌性研究。結(jié)果表明，京尼平可以作為交聯(lián)劑用來制備乳清蛋白和殼聚糖復(fù)合膜，并且可以較好地改善復(fù)合膜的拉伸性能和阻隔性能，膜制備的最佳工藝條件是乳清蛋白（WPC） 與殼聚糖（CS） 配比為6∶4，甘油添加量4%，熱處理溫度70℃，京尼平添加量0.4%，此時復(fù)合膜的拉伸強度（TS） 1.79 MPa，斷裂伸長強度（E）30.28，透光率（T） 37%，水蒸氣透過率（WVP） 1.25，溶解性（S） 34%。在此條件下制得的復(fù)合膜具有良好的阻隔性能、抗拉強度、致密性和抑菌性能，可用于食品保鮮和抗菌內(nèi)外包裝的使用。

乳清蛋白；殼聚糖；京尼平；交聯(lián)劑；抗菌性；表征

環(huán)境保護是21世紀(jì)人們普遍關(guān)注的熱點話題之一，采用生物可降解材料作為食品及其他產(chǎn)物的包裝是解決包裝材料的環(huán)境污染問題行之有效的方法。乳清蛋白是由干酪生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品乳清，經(jīng)過一定工藝濃縮精制而成的高蛋白質(zhì)，占乳蛋白質(zhì)的18%～20%，具有很高的營養(yǎng)價值、生產(chǎn)利用價值，也有許多優(yōu)良的功能特性，最為突出的是成膜性。乳清蛋白能夠形成柔軟、透明、不溶于水、富有彈性的薄膜，并且具有良好的成膜特點。例如，乳清蛋白在低濕度下對于氧氣、油脂和芳香物質(zhì)有良好的阻隔性。通過查閱大量文獻資料了解到，乳清蛋白可食用膜目前的應(yīng)用面還很窄，主要是用于涂膜保鮮。細(xì)究其難以被大量應(yīng)用在生產(chǎn)中的原因主要是乳清蛋白膜較脆、防潮阻濕性能較差、耐水性不好、抑菌防腐效果差、不具有保健功能等，難以適應(yīng)食品包裝多功能性的要求。

殼聚糖是由幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用得到的一種物質(zhì)。其作為生物保鮮劑，無味、無毒、無害，是一種良好的成膜材料。殼聚糖經(jīng)化學(xué)、物理方法的修飾，可以做成可食用的保鮮膜。殼聚糖膜能夠降低蔬菜水果的呼吸作用，抑制微生物的生理生化變化，延長貨架期，可以看作一種天然食品抗菌劑。經(jīng)過試驗研究證明，這類薄膜能夠阻隔食物與空氣接觸，在食品保鮮、抑菌防腐等方面都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)保鮮方法，現(xiàn)在已在一些蔬菜水果上進行了試驗和使用。

試驗將乳清蛋白和殼聚糖這2種成膜材料共混復(fù)合，以期克服單一組分可食用膜在實際應(yīng)用中不可避免的問題，如阻隔能力不穩(wěn)定、機械強度低等，并加入京尼平作為交聯(lián)劑來優(yōu)化復(fù)合膜的最佳制備條件，從而獲得具有優(yōu)良成膜性能和理化性質(zhì)、高效抗菌性能的功能性復(fù)合膜。同時，對復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)進行表征，揭示乳清蛋白和殼聚糖組分的相容性和京尼平的交聯(lián)性及復(fù)合膜的微觀結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，從而為京尼平對乳清蛋白和殼聚糖復(fù)合膜的實際應(yīng)用提供參考。

交聯(lián)劑對于膜的性能非常重要，常用的化學(xué)交聯(lián)劑有戊二醛、三聚磷酸鈉和甲醛等。然而，這些常用的化學(xué)交聯(lián)劑都有一定的毒性[1]。京尼平是一種是從天然梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后的天然交聯(lián)劑，其本身具有優(yōu)良的藥理價值，如保肝利膽、抗炎、抗菌、抗腫瘤、治療胃炎、治療糖尿病等。這種天然的交聯(lián)劑比常用的交聯(lián)劑（如戊二醛）的毒性小10 000倍[2]。試驗使用京尼平作為交聯(lián)劑來優(yōu)化復(fù)合膜，考查乳清蛋白、殼聚糖二者復(fù)配比例，以及成膜影響因素（如增塑劑甘油比例、熱處理溫度、交聯(lián)劑比例）對成膜特性的影響。為今后乳清蛋白復(fù)合膜和京尼平的使用提供一定的理論和實踐基礎(chǔ)。

1 試驗方法

1.1 復(fù)合膜的制備方法

1.1.1 乳清蛋白溶液熱改性

稱取一定質(zhì)量的乳清蛋白，使其充分溶解于蒸餾水中，放置于90℃水浴中改性25 min，在加熱過程中要用玻璃棒一直攪拌并保持?jǐn)嚢璺较虿蛔儯男灾髮⑷榍宓鞍兹芤褐糜?5℃水浴中備用。

1.1.2 殼聚糖溶液的制備

將一定質(zhì)量的殼聚糖溶解于2%的乙酸溶液中，于45℃條件下置于磁力攪拌，使殼聚糖充分溶解。

1.1.3 混合膜液的制備

將改性后的乳清蛋白溶液冷卻至室溫（23℃），在高速旋轉(zhuǎn)攪拌器上，緩慢將乳清蛋白液注入充分溶解的殼聚糖溶液中并繼續(xù)攪拌。待膜液充分混合后，緩慢加入增塑劑甘油。

1.1.4 調(diào)節(jié)pH值

用乙酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值3.5～5.5。

1.1.5 真空脫氣

將膜液真空抽氣處理10 min，以消除氣泡。

1.1.6 鋪膜干燥

取15 mL膜液，涂膜于10 cm×10 cm大小相同的有機玻璃板上，噴涂京尼平溶液。于室溫下干燥24 h。

1.1.7 揭膜保存

干燥冷卻后揭膜，置于相對濕度50%的箱內(nèi)平衡48 h備用。

1.2 復(fù)合膜基礎(chǔ)性能的測定

1.2.1 膜的厚度（FT）

采用接觸法測定可食膜的厚度，用螺旋測微器在膜表面四角各取1點，中央取1點，共5個點測定膜厚，取平均值，單位為（mm），膜厚用于計算膜的其他性能。

1.2.2 機械性能的測定（TS.E）

用電子拉伸試驗機測定其抗拉強度，每個樣品大小為2.54 cm×10 cm。確定其拉抗強度（TS） 和斷裂伸長率（E）。

1.2.3 透光率測定（T）

將復(fù)合膜液置于比色皿中，在400 nm波長處用紫外分光光度計測量，以乙酸作為對照。每批3個平行樣，每個樣重復(fù)進行3次。

1.2.4 溶解度（S） 的測定

參照ASTM（D664-94，1994），取膜樣，稱質(zhì)量為m1，然后在105℃的條件下干燥至恒質(zhì)量，稱其質(zhì)量m2。根據(jù)干質(zhì)量和濕質(zhì)量之差計算含水量。

1.2.5 水蒸氣透過率的測定（WVP）

將復(fù)合膜裁剪成圓形放入水蒸氣透過率儀中[3]，用TSY-T1L透濕性測試儀測定水蒸氣透過系數(shù)，測定3組數(shù)據(jù)，取平均值。

1.3 復(fù)合膜的抑菌研究

培養(yǎng)基配制按照國標(biāo)《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗染色法、培養(yǎng)基和試劑》；（GB/T 4789.28—2003）[4]，將牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉12 g，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解后，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，使滅菌后pH值在7.2～7.4，分裝后置于壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，于0.1 MPa，121℃條件下高壓滅菌15 min。

采用紙片擴散法測定復(fù)合膜的抗大腸桿菌性能。用微量移液管將0.1 mL菌濃度為105CFU/mL的大腸桿菌菌懸液導(dǎo)入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用無菌三角棒涂布均勻，通風(fēng)干燥15 min，將直徑約6 mm的無菌濾紙片置于平板培養(yǎng)基中央，分別滴入添加不同濃度殼聚糖的抗菌膜液，在37℃下培養(yǎng)24 h和48 h，觀察并測量抑菌直徑。每個樣品做3組平行試驗。以添加不含殼聚糖復(fù)合膜液為空白對照組[5]。

（1）菌種貯藏。大腸桿菌菌種和金黃色葡萄球菌接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，在37±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，置于4℃下貯藏，作為斜面貯藏菌。

（2）菌種活化。將斜面貯藏菌轉(zhuǎn)接到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在37±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后再進行轉(zhuǎn)接，取連續(xù)轉(zhuǎn)接2次以上的新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物備用。

（3）菌懸液制備。取5.0 mL稀釋液加入到活化后的菌種培養(yǎng)基中，輕輕振蕩，使菌種分散，吸取3.0 mL稀釋液加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面試管內(nèi)，反復(fù)操作，再將洗液移至另一支無菌試管中，輕輕振蕩數(shù)次，得到均勻懸浮的大腸桿菌菌懸液待用。

2 結(jié)果分析

2.1 材料復(fù)配比例對復(fù)合膜機械強度的影響

成膜材料配比對復(fù)合膜拉伸強度的影響見圖1，成膜材料配比對復(fù)合膜斷裂伸長率的影響見圖2。

圖1 成膜材料配比對復(fù)合膜拉伸強度的影響

圖2 成膜材料配比對復(fù)合膜斷裂伸長率的影響

隨著WPC-CS膜中殼聚糖配比的逐漸增大，可食膜的抗拉強度（TS）呈現(xiàn)先增加后減小再增加的趨勢。斷裂伸長率（E）見圖2呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)復(fù)合膜中殼聚糖含量較多時，殼聚糖中的羥基與乳清蛋白中的氨基和羧基形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵，使得復(fù)合膜拉伸強度較大，但隨著乳清蛋白含量逐漸增多，乳清蛋白分子間作用力增強，取代了乳清蛋白和殼聚糖之間的共價鍵及氫鍵，導(dǎo)致復(fù)合膜拉伸強度變小。WPC-CS膜的斷裂伸長率（E）隨著WPC和CS配比的增大而先增大后減小，這是因為WPC和CS分子間結(jié)合位點有限，當(dāng)二者充分結(jié)合即比例為6∶4時，此時的拉伸強度為1.72 MPa，分子間連接最緊密。

2.2 材料復(fù)配比例對復(fù)合膜透光率的影響

復(fù)合膜透光率可以反映物質(zhì)成分的相容性，若復(fù)合膜透光率很低，則說明其中的物質(zhì)相容性差。

成膜材料配比對復(fù)合膜透光率的影響見圖3。

圖3 成膜材料配比對復(fù)合膜透光率的影響

由圖3可知，隨著成膜材料配比的增大，透光率（T）稍微減小，但是差異并不明顯，這是因為乳清蛋白與殼聚糖分子通過氫鍵結(jié)合時，連續(xù)相和分散相界面發(fā)生光反射和散射，導(dǎo)致透光率減小。

2.3 材料復(fù)配比例對復(fù)合膜阻隔性能的影響

成膜材料配比對復(fù)合膜水蒸氣透過率的影響見圖4。

圖4 成膜材料配比對復(fù)合膜水蒸氣透過率的影響

WPC-CS膜的水蒸氣透過系數(shù)（WVP） 隨著成膜材料配比的增大而先減小后增大。膜的WVP與成膜材料的極性基團密切相關(guān)，在CS濃度較高時，WPC-CS膜的WVP較小，隨著WPC∶CS的增大，WPC分子與CS分子以氫鍵等相互作用在有限的結(jié)合位點充分結(jié)合，使復(fù)合膜結(jié)構(gòu)緊密，當(dāng)達到6∶4時，WVP最小為1.21。隨著CS加入量的增大，使阻水性變?nèi)?，使?fù)合膜的透水性增強。

2.4 增塑劑添加量的影響

試驗證明在未加入增塑劑時，可食用復(fù)合膜較脆、易斷裂，甚至不能完整地揭膜。在添加低濃度的增塑劑時，復(fù)合膜的性能都有很大提升。以甘油為增塑劑的可食用復(fù)合膜。隨著甘油濃度的增加，復(fù)合膜的拉伸強度（TS）顯著增加，在4%達到最大為1.72 MPa。

增塑劑對復(fù)合膜拉伸強度的影響見圖5，增塑劑對復(fù)合膜斷裂伸長率的影響見圖6。

復(fù)合膜斷裂伸長率（E）在不斷增加，這說明甘油的添加對復(fù)合膜的柔韌性有了較大提升。在甘油添加量為8%時復(fù)合膜的斷裂伸長率最大為41.13 MPa?？墒窃诮夷み^程中，由于黏度過大而不易揭膜。為考慮揭膜成度和膜的拉伸效果，應(yīng)選取4%的甘油添加量為最佳。

2.5 熱處理溫度對復(fù)合膜的影響

熱處理溫度對復(fù)合膜拉伸強度的影響見圖7，熱處理溫度對復(fù)合膜阻隔性能的影響見圖8。

圖5 增塑劑對復(fù)合膜拉伸強度的影響

圖6 增塑劑對復(fù)合膜斷裂伸長率的影響

圖7 熱處理溫度對復(fù)合膜拉伸強度的影響

圖8 熱處理溫度對復(fù)合膜阻隔性能的影響

由圖7可以看出，隨著熱處理溫度的升高，膜的整體拉伸強度（TS）先減小后增大。當(dāng)熱處理溫度為70℃時，復(fù)合膜的拉伸強度達到最大，為30.14 MPa。

由圖8可以看出，復(fù)合膜的WVP隨著熱處理溫度的升高而下降，當(dāng)溫度到60，70℃時WVP沒有顯著的改變，這是由于乳清蛋白和殼聚糖分子在適當(dāng)?shù)募訜釡囟认履芨玫亟宦?lián)，提高其阻隔水蒸氣的性能。

2.6 交聯(lián)劑對膜改性的影響

京尼平對復(fù)合膜拉伸強度的影響見圖9。

圖9 京尼平對復(fù)合膜拉伸強度的影響

由圖9可以看出，以京尼平作為交聯(lián)劑，對復(fù)合膜的拉伸強度（TS）有所增強?？赡苁怯捎诖龠M乳清蛋白和殼聚糖的交聯(lián)作用，使復(fù)合膜分子結(jié)構(gòu)更加緊密，透光性和復(fù)合膜的光滑性有所增加。而對韌性影響不大，故伸長率變化不大。由于復(fù)合膜結(jié)構(gòu)更加緊致，透水性有所減弱。

2.7 復(fù)合膜抑菌效力的測定

不同配比殼聚糖的抑菌效果見表1，添加京尼平的抑菌效果效果見表2。

表1 不同配比殼聚糖的抑菌效果

表2 添加京尼平的抑菌效果效果

由表1可以看出，乳清蛋白、殼聚糖復(fù)合凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。乳清蛋白和殼聚糖復(fù)合膜中對革蘭氏細(xì)菌有抑菌效力的主要成分是殼聚糖，隨著殼聚糖成分的增加，抑菌直徑變大，抑菌效果逐漸增大。證明此復(fù)合膜有一定的抑菌性，且對大腸桿菌的抑菌能力強于金黃色葡萄球菌。

由表2可以看出，添加京尼平對復(fù)合膜的抑菌效果影響不大，增加添加量后抑菌直徑?jīng)]有明顯變化。故復(fù)合膜抑菌效果的強弱主要依靠殼聚糖的配比。殼聚糖配比越大，復(fù)合膜的抑菌性越強。

3 結(jié)論

將乳清蛋白和殼聚糖作為原料制備復(fù)合膜，同時探究以京尼平作為交聯(lián)劑制備復(fù)合膜時的最優(yōu)條件。利用抑菌試驗，檢驗復(fù)合膜對革蘭氏細(xì)菌的抑菌作用，生產(chǎn)出具有抑菌性的功能復(fù)合膜。最后對復(fù)合膜進行表征，更加形象地反映出復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)特征。

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)分析，復(fù)合膜制備的最佳工藝條件為乳清蛋白與殼聚糖的配比6∶4，甘油添加量4%，熱處理溫度70℃，京尼平添加量0.4%。該復(fù)合膜可作為新型的生物材料，并對新型交聯(lián)劑的使用和發(fā)展提供了參考和理論依據(jù)。

[1]Welsh E R， Schauer C L， Qadri S B， et al.Chitosan cross-linking with a water-soluble，blocked diisocyanate.1.Solid state[J].Biomacromolecules，2002，3 （6）：1 370-1 374.

[2]Jin J，Song M，Hourston D J.Novel chitosan-based films cross-linkedby genipin with improved physical properties[J].Biomacromolecules，2004，5 （1）：162-168.

[3]賈艷菊，馬同鎖，劉坤，等.不同殼聚糖抗菌膜對草魚保鮮效果的比較 [J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（5）：337-340.

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[5]石磊，王世平，顧介明.不同濃度殼聚糖膜對葡萄保鮮效果的研究 [J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（8）：99-101.◇

The Preparation of Whey Protein and Chitosan Composite Films Crosslinking by Genipin

LI Yuan，LV Jia，XU Yuchun，*XEU Haiyan
（Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an，Shaanxi 710021，China）

In this paper，whey protein and chitosan composite membrane preparation process were studied with taking advantage of natural non-toxic genipin as a crosslinking agent.The proportion of two film-forming materials，influence of thermal denaturation temperature，and shaping and crosslinking agent of whey protein/chitosan composite membrane performance were explored through the single factor experimental study.And we do bacteriostatic study of the composite film.The results showed that geniposidic whey protein could be used as a crosslinking agent and chitosan composite membrane preparation used.And could better improve the tensile properties and the barrier properties of films.The optimum conditions for preparation of the film was derived from whey protein ratio（WPC） ∶chitosan （CS） 6∶4，glycerol concentration 4%，heat treatment temperature 70℃，geniposidic concentration 0.4%，the tensile strength of the composite film（TS） was 1.79 MPa，elongation at break strength（E） was 30.28，the light transmittance（T） was 37%， the water vapor transmission rate（WVP） was 1.25 and solubility（S） 34%.Under these conditions，the resulting composite film had good barrier properties，tensile strength，density and antibacterial properties.It could be used for food preservation and antimicrobial outside packaging.

whey protein；chitosan；genipin；cross-linking agent；antibacterial；characterization

O636.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.002

1671-9646（2017） 11a-0006-04

2017-07-17

陜西省教育廳專項項目（16JK1101）；陜西科技大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（008）。

李 媛（1996— ），女，在讀本科，研究方向為食品科學(xué)。

*通訊作者：薛海燕（1979— ），女，博士，副教授，研究方向為乳品質(zhì)量安全與控制。