毛永楊，楊 桐，蘇 濤，李智高，田金蘭

高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法測定牛肝菌中無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的不確定度評估

毛永楊1，楊 桐2，蘇 濤1，李智高1，田金蘭1

（1.大理州食品檢驗檢測院，云南 大理 671000；2.大理市洱海保護(hù)管理局，云南 大理 671000）

采用高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用法測定牛肝菌中無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞，通過建立評估的數(shù)學(xué)模型，分析不確定度的主要來源，計算出不確定度的各主要分量，得出合成不確定度和擴(kuò)展不確定度。結(jié)果表明：影響結(jié)果不確定度的主要因素是濃度因素、儀器、樣品不均勻性及回收率，其中濃度因素主要受標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的影響。該評估系統(tǒng)可為今后采用高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用法測定食用菌中無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的不確定度評估提供參考。

高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用法；汞形態(tài)；不確定度；牛肝菌

汞及其化合物廣泛存在于自然界中，汞的毒性與其存在的形態(tài)密切相關(guān)，有機(jī)汞的毒性大于無機(jī)汞，在有機(jī)汞中甲基汞的毒性最大。無機(jī)汞在生物體烷基化的作用下可生成甲基汞、乙基汞等有害物質(zhì)，汞及其化合物被動植物吸收后通過食物鏈的富集作用進(jìn)入人體，其富集倍數(shù)可達(dá)106～107[1-3]。牛肝菌對土壤及生長環(huán)境中的汞具有較強(qiáng)的生物富集作用[4]，因此分析牛肝菌中不同形態(tài)汞的含量對避免人體因食用含高毒性有機(jī)汞造成汞中毒具有重要的意義[5]。目前在新修訂的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.17—2014《食品中總汞及有機(jī)汞的測定》[6]中增加了甲基汞的測定方法（高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用法），但標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的樣品前處理方法主要是針對有甲基汞限值規(guī)定的魚類產(chǎn)品且該方法未涉及乙基汞的測定方法，因此本研究有針對性的建立了適用于食用菌基質(zhì)，且能同時測定無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞含量的快速檢測方法。由于該方法為非國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性及符合測量結(jié)果的表達(dá)、質(zhì)量評定、方法確認(rèn)、量值溯源[7-8]等方面的要求，對該方法進(jìn)行不確定度評估具有重要的應(yīng)用價值。本實驗依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[9]以及CNAS-GL06《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[10]規(guī)定的程序和方法，對高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用法測定牛肝菌中的無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的實驗方法進(jìn)行不確定度評估，分析不確定度的主要來源，找出影響檢測結(jié)果的主要因素，為評估檢測結(jié)果的科學(xué)性和檢測結(jié)果的質(zhì)量水平提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肝菌 市售；乙腈、乙酸銨為色譜純；氯化鉀、硝酸、硼氫化鉀、氫氧化鉀、鹽酸均為優(yōu)級純；其他試劑均為分析純；無機(jī)汞（Hg2＋）標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL±0.8%）、甲基汞（CH3Hg＋）標(biāo)準(zhǔn)溶液（76.6 μg/g±2.9 μg/g）、乙基汞（C2H5Hg＋）標(biāo)準(zhǔn)溶液（75.3 μg/g±2.8 μg/g） 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司；9780原子熒光光譜 北京海光公司；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（出水電阻率18.2 MΩ·cm） 美國Milli-pore公司；渦旋振蕩器 美國Thermo公司；高速臺式冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；AB-204s電子天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取試樣0.25 g（精確到0.000 1 g）于15 mL離心管中，加入3.0 mL的1.5% KCl-1.0%硫脲與鹽酸的混合提取劑充分混合，置于2 500 r/min的渦旋混合器上振蕩提取10 min，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，取出上清液，再向離心管中加入3.0 mL混合提取劑重復(fù)提取1 次；合并2 次提取液，加入0.8 mL的氨水，用純水定容至10 mL，用0.22 μm的濾膜過濾后分析測定，同時做空白對照。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.2.1 單標(biāo)儲備液的配制

分別準(zhǔn)確稱取甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液130.55 mg、乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液132.80 mg，用純水定容至10 mL配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；用20～200 μL移液器準(zhǔn)確吸取100 μL的無機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)溶液，用純水定容至10 mL配制成質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的無機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4 ℃避光保存。

1.3.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制

分別用1 mL的單標(biāo)線吸量管各吸取1 mL的無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；再分別使用100～1 000 μL移液器吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL、1 mL的單標(biāo)線吸量管吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、2 mL的單標(biāo)線吸量管吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL、500～5 000 μL的移液器吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液4 000 μL、5 mL的單標(biāo)線吸量管吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL于不同的10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 高效液相色譜工作條件

色譜柱：C18反相色譜分離柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：5.0%乙腈-0.46%乙酸銨-0.10% L-半胱氨酸；進(jìn)樣體積：100 μL；流速：1.0 mL/min。

1.3.3.2 原子熒光檢測條件

載流：7% HCl溶液；氧化劑：1.0% K2S2O8＋0.5% KOH；還原劑：2.0% KBH4＋0.5% KOH；紫外消解儀：開；負(fù)高壓：300 V；原子化器高度：10 mm；燈電流：30 mA；載氣流量：400 mL/min；屏蔽氣流量：900 mL/min；泵轉(zhuǎn)速：80 r/min。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型的確立與不確定度的分析

1.3.4.1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測量的原理建立測量值的數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行不確定度來源的分析。本實驗中汞形態(tài)分析的數(shù)學(xué)模型如下：

式中：X為試樣中某組分的含量/（mg/kg）；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣中某組分的質(zhì)量濃度/（μg/L）；V為試樣溶液的體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g；frec為樣品加標(biāo)回收率/%。

1.3.4.2 不確定度分量的主要來源[11-17]

根據(jù)測量過程，該方法測定牛肝菌中無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞不確定度的來源主要包括：標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合及樣品前處理引入的不確定度等。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量濃度引入的不確定度u（C）[18-21]

由質(zhì)量濃度因素引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，主要包括標(biāo)準(zhǔn)品濃度引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)品稱量和移取過程中引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中玻璃量器和移液器引入的不確定度、溫度變動引入的不確定度、擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度引入的不確定度u1（C）

本實驗所采用的標(biāo)準(zhǔn)品均購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，根據(jù)其所提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的擴(kuò)展不確定度分別為：u（Cs（Hg2＋））=±0.8%、u（Cs（CH3Hg＋））=±2.9 μg/g、u（Cs（C2H5Hg＋））=±2.8 μg/g；按B類評定取矩形分布，由標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對不確定度分別為：

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量和移取過程中引入的不確定度u2（m）

實驗中分別稱取甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液130.55 mg、乙基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液132.80 mg；用200 μL的移液器準(zhǔn)確吸取100 μL的無機(jī)汞標(biāo)準(zhǔn)溶液；根據(jù)鑒定證書天平的最大允許誤差為±0.05 mg，200 μL移液器的最大誤差為±1.5%，按照矩形分布計算由稱量標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對不確定度分別為：

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中玻璃量器和移液器引入的不確定度u3（V）

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中玻璃量器和移液器引入的不確定度Table 1 Uncertainty resulting from the preparation of standard solution by volumetric flasks and pipettes

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程中所用的玻璃量器和移液器的最大允許誤差，按照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[22]和JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[23]的要求確定。各玻璃量器和移液器的不確定度按B類不確定度評定，其中吸量管和移液器取矩形分布，容量瓶按三角分布計算[9]，結(jié)果見表1。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)合成標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中玻璃量器與移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程中溫度引入的不確定度u4（T）

標(biāo)準(zhǔn)溶液在稀釋過程中的溶劑為純水，各量具均在20 ℃的條件下進(jìn)行檢定，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制室的溫度控制在（20±5） ℃的范圍內(nèi)；由于玻璃量器的膨脹系數(shù)遠(yuǎn)小于液體的膨脹系數(shù)，可忽略不計，水在20 ℃的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，取溫度變化為均勻分布，據(jù)此計算的溫度變化引入的不確定度見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中溫度變化引入的不確定度Table 2 Uncertainty resulting from the preparation of standard solution by temperature variation

根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制過程中由溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.5 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度u5（C?）

通過對質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、50 μg/L的無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定，每個校準(zhǔn)點測定2 次，采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與峰面積曲線，各數(shù)據(jù)結(jié)果詳見表3；同時對一組陽性樣品在擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的狀態(tài)下進(jìn)行兩次重復(fù)測定，根據(jù)如下公式對標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度進(jìn)行計算：

式中：b為校準(zhǔn)曲線斜率；C0為陽性樣品測定質(zhì)量濃度的平均值；p為測試樣品的次數(shù)；m為標(biāo)準(zhǔn)工作液的測定次數(shù)；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)點的總數(shù)；為標(biāo)準(zhǔn)溶液各校準(zhǔn)點Cij的質(zhì)量濃度平均值；Aij為各質(zhì)量濃度點測定的峰面積；Ai為由校準(zhǔn)方程計算得到的各質(zhì)量濃度點的峰面積；Cij為標(biāo)準(zhǔn)溶液各校準(zhǔn)點的濃度。對陽性樣品進(jìn)行2次測定，其含量分別為：C0（Hg2＋）=21.64 μg/L、C0（CH3Hg＋）=10.12 μg/L、C0（C2H5Hg＋）=15.17 μg/L。根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)計算得到：Scc=3 000；由以上數(shù)據(jù)計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對不確定度分別為：

在樣品的測定過程中由濃度引入的相對合成不確定度按如下公式計算：

分別計算出urel（C（Hg2＋））= 0.017 3；urel（C（CH3Hg＋））=0.053 9；urel（C（C2H5Hg＋））=0.042 0。

表3 校準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)及不確定度Table 3 Data for fitting calibration curve and uncertainty

2.2 樣品前處理引入的不確定度[24-29]

2.2.1 試樣質(zhì)量稱量引入的不確定度u（W）

在實驗中稱取0.25 g（精確到0.000 1 g）的試樣，根據(jù)鑒定證書天平最大允許誤差為±0.05 mg，按B類評定取矩形分布，由試樣稱量引入的相對不確定度為：

2.2.2 試樣定容引入的不確定度u（V?）

試樣處理完成后采用10 mL的容量瓶進(jìn)行定容，溫度變化范圍為（20±5）℃，其中10 mL A級單標(biāo)線容量瓶的最大允許誤差為±0.020 mL，由容量瓶和溫度變化引入的不確定度分別如下：

由試樣定容過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 由樣品不均勻性引入的不確定度u（f）

由于處于不同生長時期和處于同一生長時期的牛肝菌中不同組織部位對無機(jī)汞、甲基汞和乙基汞的富集作用及烷基化的能力差異較大[5]，因此在不確定度評定中應(yīng)包含由樣品非均勻引入的不確定度分量。在本實驗中通過充分混勻樣品、加大樣品的制樣量，經(jīng)過科學(xué)的取樣和縮分及平行實驗來保障試樣的均勻性和檢測結(jié)果的代表性。實驗對同一陽性樣品進(jìn)行了7 組獨立試樣的平行實驗結(jié)果見表4，同時按A類評定對其不確定度進(jìn)行計算，計算公式如下：

根據(jù)此公式分別計算得到由樣品非均勻性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（f（Hg2＋））=0.016 7；urel（f（CH3Hg＋））＝0.029 3；urel（f（C2H5Hg＋））=0.018 4。

表4 樣品中無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的測定結(jié)果Table 4 Determination results of inorganic mercury, methyl mercury and ethyl mercury in the samplemg/kg

2.2.4 提取效率引入的不確定度

在空白試樣中添加7 組不同的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察回收率對不確定度的影響，按A類進(jìn)行評定，由回收率引入的相對不確定度根據(jù)如下公式計算：；同時對回收率進(jìn)行顯著性檢驗，計算公式為：，結(jié)果見表5；查t檢驗臨界值分布表（f = n-1=6）得雙側(cè)臨界值t（0.05,6）為2.447。在本實驗中t值均大于t（0.05,6），故實驗中所得到的回收率與100%具有顯著差異，因此必須在計算結(jié)果的公式中采用回收率因子R對結(jié)果進(jìn)行修正。

表5 無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的回收率和不確定度Table 5 Recoveries and uncertainties of inorganic mercury, methyl mercury and ethyl mercury

在樣品前處理過程中各分量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度按如下公式計算：

根據(jù)此公式分別計算得到由樣品前處理過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（D（Hg2＋））=0.019 3；urel（D（CH3Hg＋））=0.031 8；urel（D（C2H5Hg＋））=0.021 6。

2.3 高效液相色譜-原子熒光分析系統(tǒng)引入的不確定度u（E）

根據(jù)檢定證書高效液相色譜-原子熒光分析系統(tǒng)的擴(kuò)展不確定度u=5%，k=2，因此由分析儀器引入的不確定度為：

2.4 合成不確定度及擴(kuò)展不確定度

2.4.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各不確定分量相互獨立，相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算公式為：

由此公式分別計算得到無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel（（Hg2＋））＝0.036 0；urel（X（CH3Hg＋））＝0.067 4；urel（X（C2H5Hg＋））＝0.053 4；根據(jù)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計算公式uC（X）＝urel（X）×，其中為表4中陽性樣品經(jīng)測定后按1.3.4.1節(jié)中的公式計算結(jié)果的平均值，分別計算得到無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：uC（（Hg2＋））=0.031 8；uC（X（CH3Hg＋））＝0.028 6；uC（X（C2H5Hg＋））＝0.035 1。

2.4.2 擴(kuò)展不確定度

依據(jù)JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》[30]，在95%的置信水平下，取包含因子k＝2，擴(kuò)展不確定度U＝k×uC（X），據(jù)此得到的高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用法測定牛肝菌中的無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞含量的結(jié)果見表6。

表6 不確定度評定結(jié)果Table 6 Uncertainty evaluation for the determination of inorganic mercury, methyl mercury and ethyl mercury

3 結(jié) 論

通過對牛肝菌中無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的測定過程中各分量因素引入的不確定度進(jìn)行評定，結(jié)果表明：在無機(jī)汞的測定過程中對不確定度貢獻(xiàn)最大的因素依次為儀器、濃度因素、樣品不均勻性和樣品提取效率，其中在濃度因素中主要受到標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合及體積因素的影響。在甲基汞和乙基汞的測定過程中不確定度的主要來源為：濃度因素、儀器、樣品不均勻性以及樣品提取效率引入的不確定度；其中在濃度因素中主要受到標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合及標(biāo)準(zhǔn)品純度的影響。因此，在今后的實際檢測過程中，通過保持儀器較高的靈敏度并按時進(jìn)行檢定、選擇高純度的標(biāo)準(zhǔn)品、科學(xué)制樣與縮分、選擇高精密度的量器、提高檢驗人員的熟練水平和操作的規(guī)范性等方法減小測量數(shù)據(jù)的不確定度，保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性從而提高檢測質(zhì)量。

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Uncertainty Evaluation of for Determining Inorganic Mercury, Methyl Mercury and Ethyl Mercury in Boletus by High Performance Liquid Chromatography Combined with Atomic Fluorescence Spectrometry

MAO Yongyang1, YANG Tong2, SU Tao1, LI Zhigao1, TIAN Jinlan1
(1. Food Inspection and Testing Institute of Dali, Dali 671000, China;2. Erhai Lake Conservation and Management Bureau of Dali, Dali 671000, China)

In this study, we identified the main sources of uncertainty by mathematical modeling and calculated the main uncertainty components and combined and expanded uncertainties for the determination of inorganic mercury, methyl mercury and ethyl mercury in Boletus by high performance liquid chromatography combined with atomic fluorescence spectrometry (HPLC-AFS). The results showed that the major factors of uncertainty were concentration, instrumental measurement, sample heterogeneity, and recovery. Moreover, the curve fitting was the major factor causing the uncertainty for concentration. This study may provide a guideline for uncertainty evaluation for determining inorganic mercury, methyl mercury and ethyl mercury in edible fungus by HPLC-AFS.

high performance liquid chromatography combined with atomic fluorescence spectrometry; mercury specie;uncertainty; Boletus

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724044

O657.3

A

1002-6630（2017）24-0272-06

毛永楊, 楊桐, 蘇濤, 等. 高效液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用法測定牛肝菌中無機(jī)汞、甲基汞、乙基汞的不確定度評估[J].食品科學(xué), 2017, 38(24): 272-277.

10.7506/spkx1002-6630-201724044. http://www.spkx.net.cn

MAO Yongyang, YANG Tong, SU Tao, et al. Uncertainty evaluation of for determining inorganic mercury, methyl mercury and ethyl mercury in Boletus by high performance liquid chromatography combined with atomic fluorescence spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 272-277. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724044. http∶//www.spkx.net.cn

2016-12-08

云南省衛(wèi)生廳科研項目（云衛(wèi)[2014]DB005）

毛永楊（1985—），男，助理工程師，碩士，研究方向為食品安全質(zhì)量檢測。E-mail：maoyongyang@163.com