吳 瀟，呂貝貝，王金斌，蔣 瑋，李 鵬，武國干，唐雪明*

SNP標記用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源

吳 瀟，呂貝貝，王金斌，蔣 瑋，李 鵬，武國干，唐雪明*

（上海市農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，上海 201106）

采用基于個體基因組DNA序列的差異而進行個體識別的DNA溯源技術，建立DNA溯源系統(tǒng)對肉產(chǎn)品的質量安全進行控制。在實驗群體中（10 個品種，233 個個體）檢測了33 個新單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）標記的遺傳多樣性，通過雜合度計算篩選出6 個SNP標記可用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源。進一步在屠宰場采樣進行溯源模擬實驗，結果表明篩選的18 個SNP標記（6 個新SNP標記結合已有的12 個SNP標記）能有效區(qū)分100 頭豬個體，隨機抽取的10 個個體的組織樣品都能通過基因型比對找到對應的個體。本研究可為早日建立豬肉產(chǎn)品的DNA溯源系統(tǒng)提供一定的技術參考。

豬肉產(chǎn)品溯源；DNA溯源技術；SNP標記；個體識別

豬肉作為我國最主要的動物蛋白來源，其安全問題受到普遍關注。建立豬肉的溯源體系，可以實現(xiàn)對豬肉制品的可追溯管理，從而為消費者提供產(chǎn)品有關的詳細信息，包括養(yǎng)殖、運輸、屠宰、分割、銷售等各個環(huán)節(jié)，大大加強了政府相關部門對肉制品質量安全監(jiān)管的力度[1-2]。

標簽溯源技術因為操作簡單、成本低，在我國得到廣泛的應用。但標簽存在易混淆、易脫落丟失，而且一旦豬肉產(chǎn)品間分割離開胴體就無法再進一步追溯。生物體的DNA存在于其任何組織的細胞中，而且個體的DNA序列具有特異性（同卵雙生除外）和穩(wěn)定性，因此不受動物被分割的影響[3]，通過鑒別個體DNA特征能夠準確地識別動物個體，因此DNA技術被用于肉產(chǎn)品的溯源中。

DNA溯源技術需要借助分子標記體現(xiàn)個體基因組序列的差異[4]。當前被認為是最具應用潛力的分子標記是SNP標記，已在多個國家得到應用。受飲食習慣影響，SNP標記主要在牛肉制品上應用較多，Heaton等[5]采用SNP標記對美國中西部17 個州進行了牛肉的追溯，在前期研究的基礎上將SNP標記數(shù)目縮小到20 個，這組標記實現(xiàn)了從在售牛肉樣品追溯到屠宰廠和農(nóng)場[6]。日本為了杜絕瘋牛病牛肉疫情的傳播，Suekawa等[7]研究并使用SNP標記來篩選能區(qū)分日本本土黑牛、荷斯坦牛與進口的澳大利亞牛肉、美國牛肉，從而確保了日本牛肉食品的安全。韓國為了支持本國牛肉產(chǎn)業(yè)和維護消費者的知情權，Cheonga等[8]研發(fā)一組SNP標記用以區(qū)分韓國本地牛肉、進口牛肉和國產(chǎn)荷斯坦牛肉。比利時的Goffaux等[9]于就對豬基因的5’和3’非翻譯區(qū)的SNP標記進行研究，獲得一組21 個SNP標記，能有效區(qū)分比利時的主要商品豬品種。而我國豬肉產(chǎn)品溯源還停留在耳標等標簽技術階段。

在豬的長期育種工作中，已經(jīng)積累了大量SNP標記，但只有至少滿足下列條件的標記才能用于溯源：1）變異度高，等位基因頻率較為接近；2）不同品種的等位基因分布差異??；3）雜合度要大于或等于0.3[2-3]。

由于現(xiàn)有SNP標記多為育種標記，跟某一類生產(chǎn)形狀相關，因此往往集中分布在某些染色體上，如1號染色體、12號染色體等，而另外部分染色體，如5號、8號、14號染色體等則缺乏SNP標記。因此為了滿足對豬肉產(chǎn)品進行DNA溯源的要求本研究率先進行了新SNP溯源標記的研究工作。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗樣品采自上海崇明富農(nóng)豬場，包括：皮特蘭（P）24 頭；申農(nóng)（SN）32 頭；大申（DS）31 頭；皮申（PS）12 頭；長申（CS）26 頭；杜申（DuS）23 頭；皮大申（PDS）19 頭；長大申（CDS）25 頭；杜大申（DDS）7 頭；杜皮大申（DPDS）31 頭。

溯源模擬實驗的豬樣品采自上海復興屠宰場，隨機采集100 頭豬個體的耳組織樣品和其中10 頭豬個體的組織樣品（包括心臟、肝臟、胃部、腎臟、小腸、大腸、尾巴、肌肉樣品）。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

采用酚/氯仿抽提法提取DNA，并稀釋到25 ng/μL，-20 ℃保存。提取方法參考《分子克隆實驗指南》。

1.2.2 PCR擴增和酶切

對缺乏SNP標記的豬4、5、14、15、16號和18號染色體，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中豬的基因組序列作為模板，用Primer 5.0設計引物分離基因片段。PCR擴增體系為20 μL：其中Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.20 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.40 μL，引物0.60 μL，DNA模板（稀釋后）3.0 μL，去離子蒸餾水13.20 μL，退火溫度依引物而定。酶切體系10～12 μL，其中擴增產(chǎn)物3～8 μL，酶切Buffer 1.2 μL，限制性內(nèi)切酶5 U，反應6 h（各種酶的作用溫度不相同）。酶切產(chǎn)物用1%～2%的瓊脂糖電泳分析。

表1 19 對引物序列及片段長度Table 1 Sequences and length of the 19 primers used in this study

1.2.3 SNP標記的篩選

根據(jù)電泳圖片記錄個體的基因型，然后計算等位基因頻率（P）公式如下：

雜合度（heterozygosity，H）表示基因多樣性，群體的雜合度表示某位點為雜合子的概率，計算公式如下：

式中：Pi為i位點的等位基因頻率；n為等位基因數(shù)。

根據(jù)引物的擴增效率、瓊脂糖電泳的分辨率、等位基因頻率和雜合度是否大于0.3來進行SNP標記的篩選。

1.2.4 溯源模擬實驗

將采自屠宰場的100 頭豬個體的耳組織樣品按照1～100依次編號，其中10 頭豬只個體的樣品按照組織編號，如：L（肝臟樣品）、S（胃部樣品）、H（心臟樣品）、K（腎臟）、T（尾巴樣品）、I（大腸樣品）和M（肌肉樣品）。對于每一份樣品，檢測篩選的所有SNP標記的基因型，耳組織樣品的基因型代表個體的基因型，組織樣品的基因型代表豬分割肉的基因型，按照酶切帶型，1條帶記為1，出現(xiàn)2條帶記為2，3 條帶記為3，每一份樣品所有SNP的基因型形成一個類似條形碼的一串數(shù)字。將10 個組織樣品的基因型數(shù)字條碼和100 頭豬個體的基因型數(shù)字條碼進行比對。

2 結果與分析

2.1 SNP標記的挖掘

通過克隆子測序和序列比對分析，發(fā)現(xiàn)了33 個可以用PCR-RFLP方法識別的新SNP位點。SNP位點的堿基替代情況和內(nèi)切酶如表2所示。

在實驗群體中進行33 個SNP標記的檢測，記錄每個位點的雜合子和純合子的個體數(shù)目。然后根據(jù)公式計算基因頻率和雜合度，其中有6 個SNP標記復合溯源標記的要求，詳見表3。6 個SNP標記等位基因分布均衡，雜合度最大為0.500 0，最小為0.244 9。雜合度低于0.3的有兩個，是SNP2和SNP3兩個位點在杜大申群體中的雜合度，這可能是因為杜大申樣本數(shù)太少的原因，除此之外，這兩個位點除了杜大申群體中雜合度稍低于0.3，其他群體中的雜合度都大于0.3，而且雜合度平均值分別為0.401 9和0.413 9，均大于0.3，所以這兩個位點也是符合溯源標記要求的。并且可以用于豬肉產(chǎn)品的溯源。

表2 新SNP位點及內(nèi)切酶Table 2 New SNP sites and the corresponding endonucleases

表3 6 個新SNP在11 個豬種中基因頻率及雜合度Table 3 Gene frequencies and heterozygosity of 6 new SNPs in 11 pig breeds

2.2 溯源模擬實驗結果

表4 12 個已有的可用于溯源的SNP標記[10-19]Table 4 Twelve existing SNP tags that can be used for traceability

為驗證篩選的SNP標記能否有效地進行豬肉產(chǎn)品溯源，本實驗在上海復興屠宰場進行了溯源模擬實驗。隨機采取了100 頭豬個體的耳組織樣，采集了其中10 頭個體的一處組織器官的樣品，代表市面上銷售的豬的分割產(chǎn)品。先在100 頭豬個體中檢測了18 個SNP的基因型，按照酶切帶型，記錄順序按照表4位點順序排列，再加表3中的6 個新SNP位點，個體的基因型可以表示為：212323222233113232。統(tǒng)計分析結果顯示這18 個SNP標記能鑒別出這100 頭豬個體。實驗同時測定了10 份組織器官樣品，同樣用數(shù)字表示基因型，如表5可知，通過查找和比對，10 個樣品都能在100 頭豬個體的基因型中找到基因型匹配的個體。

表5 10 份組織樣品基因型及對應的個體Table 5 Ten tissue samples and the corresponding individual genotypes

3 討論與結論

肉類食品安全問題關系到消費者的健康與生命安全[20-21]，針對畜禽養(yǎng)殖、屠宰加工、產(chǎn)品貯運和銷售等環(huán)節(jié)存在的安全隱患，肉產(chǎn)品的追溯系統(tǒng)能起到一定的監(jiān)管作用[22-24]，有利于監(jiān)管部門發(fā)現(xiàn)食品安全隱患后能迅速確定肉產(chǎn)品的來源及去向，及時召回受污產(chǎn)品，因此世界上許多國家已積極發(fā)展并建立肉類食品的追溯系統(tǒng)[2-3]。個體DNA存在于動物的每個細胞之中，不受動物發(fā)育期和器官的影響，而且每個個體的DNA是獨一無二的（同卵雙生除外）。研究者根據(jù)個體DNA的特異性和組織無差異性建立了DNA溯源技術，使得追溯不受動物分割的限制，因此DNA溯源技術被越來越多的國家廣泛應用到肉產(chǎn)品的溯源中[3]。

SNP標記是第3代分子標記，是單個核苷酸發(fā)生改變而產(chǎn)生多態(tài)性的DNA分子標記[25-27]，屬于二等位基因多態(tài)，因此一個SNP理論上可以區(qū)分3 個動物個體，如果有n個位點，則能區(qū)分3n個個體。SNP在基因組內(nèi)分布十分廣泛，如在哺乳動物中每500～1 000 bp序列就有可能包含一個SNP[4]。近年來，SNP標記作為分析生物遺傳多樣性的分子標記，已被廣泛用于豬的遺傳學[28-29]研究中。但是不是所有的SNP標記都可以用作溯源，因此需要建立群體對SNP標記進行篩選，只有符合品種內(nèi)變異度高，品種間等位基因分布差異小，雜合度大于0.3的SNP標記才能用于DNA溯源。本實驗根據(jù)文獻[10-19]報道，檢索出大量的SNP標記，通過檢測分析，篩選出12 個可以用于溯源的SNP標記，如表4所示。同時，針對缺乏SNP溯源標記的染色體進行了新SNP標記的挖掘。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫豬的序列信息，設計了19 對引物，通過DNA池測得方法，發(fā)現(xiàn)了33 個可以用PCR-RFLP方法識別的新SNP位點。在采自上海崇明富農(nóng)豬場的233 頭豬的實驗群體中檢測了這33 個SNP位點，通過等位基因頻率分析和雜合度計算，篩選到6 個可以用于溯源的SNP標記。將文獻中篩選獲得的12 個已有的SNP標記和6 個新SNP標記結合在一起形成一個SNP溯源標記的組合。

本研究為了驗證獲得的18個SNP溯源標記組合的溯源準確性，進行了豬肉產(chǎn)品的溯源模擬實驗。在上海復興屠宰場隨機采集了100 頭豬個體的耳組織樣品和其中10 頭豬個體的組織樣品，耳組織樣品的基因型代表個體的基因型，組織樣品的基因型代表分割肉的基因型。對于每一份樣品，檢測上步篩選的所有SNP標記的基因型，根據(jù)帶型記錄個體的基因型。溯源模擬結果顯示這18 個SNP標記能有效區(qū)分這100 頭豬個體。本研究同時檢測了采集的10 份組織器官樣品，同樣用數(shù)字表示基因型，通過查找和比對，10 個樣品都能在100 頭豬個體的基因型中找到基因型匹配的個體。阮泓越等[30]使用SNP標記對3 個國外引進豬品種（大白豬、長白豬和杜洛克豬）進行個體識別的研究，結果表明利用14 個SNP標記即可區(qū)分所有樣本，此外還進一步利用這些SNP標記對屠宰場隨機取樣的5 頭豬進行從肉樣到血液樣品的溯源研究，結果表明同一頭豬的肉樣和血液樣品的SNP座位是一一對應的。胡肄農(nóng)等[31]使用7 對引物，擴增52 個SNP位點，經(jīng)關聯(lián)性分析及雜合度過濾（雜合度不低于0.1）后，選留41 個SNP位點，用于蘇鐘豬個體身份識別，7 對引物擴增片段理論上可用于近5.0×106頭豬個體身份DNA識別的數(shù)字條形碼編制，基本可以滿足規(guī)模蘇鐘豬養(yǎng)豬場豬的個體身份識別。本實驗使用了18 個SNP標記，理論上有318個基因型體，能區(qū)分3.87×108個個體，因此18 個SNP標記是完全可以用于大規(guī)模的豬只個體識別和追溯。

采用DNA溯源技術進行豬肉產(chǎn)的溯源準確、可靠，但目前進行豬只個體DNA身份識別的成本比傳統(tǒng)的耳標等識別方法高，因此在我國難以普及，但是可以優(yōu)先應用于一些生產(chǎn)品牌豬肉的大型養(yǎng)豬場。另外，針對豬的主要品種開發(fā)分辨率高、檢測位點少的檢測體系，可以針對地域性的主打品種進行SNP標記的篩選，隨著生物技術的發(fā)展，DNA溯源技術的成本會逐步降低，相信在不久的將來DNA溯源技術一定能廣泛的應用于我國動物個體識別和豬肉產(chǎn)品追溯中。

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Development and Application of Pork Traceability System Based on SNP Markers

WU Xiao, Lü Beibei, WANG Jinbin, JIANG Wei, LI Peng, WU Guogan, TANG Xueming*
(Biotechnology Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China)

DNA traceability technology is based on DNA sequence differences between individuals for individual identification and the tracing of meat back to an individual animal. Establishing a DNA-based traceability system is important for the safety and quality of meat products. The genetic diversity of 33 new single nucleotide polymorphism (SNP)markers was detected in a test group (233 individuals, 10 varieties) and 6 SNP markers, which are useful for pork product traceability, were obtained by heterozygosity calculation. A total of 18 SNP markers (6 new SNP markers in combination with 12 SNP markers) could effectively distinguish between 100 individuals collected from a local slaughter house in traceability simulation experiments. The corresponding individuals for tissue samples from 10 random individuals were found by genotype. This study has shown that SNP markers could be used for individual identification and pork traceability.

pork traceability; DNA traceability technology; SNP markers; individual identification

10.7506/spkx1002-6630-201724045

Q819

A

1002-6630（2017）24-0278-05

吳瀟, 呂貝貝, 王金斌, 等. SNP標記用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源[J]. 食品科學, 2017, 38(24)∶ 278-282. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724045. http∶//www.spkx.net.cn

WU Xiao, Lü Beibei, WANG Jinbin, et al. Development and application of pork traceability system based on SNP markers[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 278-282. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724045. http∶//www.spkx.net.cn

2016-10-20

閔行區(qū)產(chǎn)學研合作計劃項目（2016MH256）

吳瀟（1978—），女，副研究員，博士，研究方向為食品安全。E-mail：qwuxiao@126.com

*通信作者：唐雪明（1970—），男，研究員，博士，研究方向為食品安全。E-mail：xueming70@foxmail.com