基于RNA-seq分析美洲大蠊提取物對結(jié)直腸癌細(xì)胞信號通路的影響

陳峰， 陳佳松， 彭銳， 耿福能， 鄒方東*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610065； 2. 四川省藥用動物工程技術(shù)研究中心，成都610065；3. 藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065)

基于RNA-seq分析美洲大蠊提取物對結(jié)直腸癌細(xì)胞信號通路的影響

陳峰1， 2， 3， 陳佳松1， 2， 3， 彭銳1， 2， 3， 耿福能3*， 鄒方東1， 2， 3*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610065； 2. 四川省藥用動物工程技術(shù)研究中心，成都610065；3. 藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065)

美洲大蠊Periplanetaamericana提取物能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞生長，甚至能使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但是其對結(jié)直腸癌細(xì)胞信號通路的影響尚不清楚。本文基于RNA-seq技術(shù)初步分析了美洲大蠊提取物聯(lián)合順鉑處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)信號通路的變化。結(jié)果表明：30 μM順鉑和0.6%康復(fù)新液聯(lián)合處理組與對照組相比，共有1 901個差異基因，其中1 555個基因表達(dá)上調(diào)，346個基因表達(dá)下調(diào)；30 μM 順鉑和0.8%精粉酵解液聯(lián)合處理組與對照組比，共有2 587個差異基因，其中2 183個基因表達(dá)上調(diào)，404個基因表達(dá)下調(diào)；30 μM 順鉑和100 μg·mL-1精粉聯(lián)合處理組與對照組相比，共有1 488個差異基因，其中1 164個基因表達(dá)上調(diào)，324個基因表達(dá)下調(diào)。用WEGO和DAVID進(jìn)行差異基因的GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物聯(lián)合順鉑處理組與對照組相比，表達(dá)上調(diào)的差異基因主要富集在p53、細(xì)胞粘附分子、MAPK、細(xì)胞凋亡等信號通路；表達(dá)下調(diào)的差異基因主要富集在氨基酰-tRNA生物合成、氨基酸生物合成、抗生素生物合成、一碳代謝等信號通路。

美洲大蠊；提取物；轉(zhuǎn)錄組；差異基因；信號通路；功能注釋

美洲大蠊Periplanetaamericana隸屬于蜚蠊目Blattodea蜚蠊科Blattidae大蠊屬Periplaneta，俗稱蟑螂，是世界性衛(wèi)生害蟲，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。蜚蠊入藥早有歷史記載(孫星衍，孫馮翼，1955)，近年來，美洲大蠊提取物被發(fā)現(xiàn)具有很高的藥用價值，目前已有多個產(chǎn)品相繼研發(fā)成功，如康復(fù)新、心脈隆注射液、肝龍膠囊等(史未名，2012)?？祻?fù)新是美洲大蠊干燥蟲體的乙醇提取物研制產(chǎn)品，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床創(chuàng)傷治療。舒崇湘等(2001)使用美洲大蠊多元醇提取物W11-a12作為全身放射損傷的治療藥物，研究表明，美洲大蠊提取物通過增加細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)量來刺激創(chuàng)傷細(xì)胞增殖、加速傷口愈合速度和質(zhì)量。臨床研究表明，康復(fù)新液對手足口病、胃腸潰瘍、痔瘡、肛瘺和肛裂等疾病都有很好的治療效果(劉玉媛，2006)。胡艷芬等(2009)發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取物對3株人肺癌細(xì)胞具有體外抑制作用；何正春等(2009)發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取物對3株人體消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞具有體外抑制作用；蔣永新等(2006)發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取物能在體外誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞BGC-823、肺腺癌細(xì)胞GLC、卵巢癌細(xì)胞等發(fā)生凋亡。

結(jié)直腸癌是胃腸道癌癥中最常見的惡性腫瘤之一，也是全球第三大最常見的癌癥疾病(汪建平等，2009)。順鉑(cisplatin)是一種重要的抗腫瘤藥物，用于治療多種類型的癌癥(Rosenberg，1999)，主要作用靶點(diǎn)為DNA，可以促進(jìn)DNA鏈內(nèi)及鏈間交聯(lián)(主要為鏈內(nèi)交聯(lián))，導(dǎo)致DNA損傷，當(dāng)DNA不能被修復(fù)時導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(Siddik，2003)。盡管順鉑在臨床治療腫瘤上具有較好的效果，但是其副作用以及腫瘤耐藥性問題，嚴(yán)重影響了它在臨床治療中的應(yīng)用潛力(Kelland，1993；Ferlayetal.，2015)。

轉(zhuǎn)錄組是某個物種或者特定細(xì)胞類型產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本的集合，能夠反映基因組在特定條件下的表達(dá)情況，從整體水平了解基因的功能和結(jié)構(gòu)，是研究細(xì)胞表型和功能的一個重要手段。轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域(祁云霞等，2011)。雖然有很多文獻(xiàn)報道了美洲大蠊提取物能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞生長，甚至使腫瘤細(xì)胞凋亡，但是分析美洲大蠊提取物與順鉑聯(lián)合處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，對其信號通路影響的研究還未見報道。因此，本文基于RNA-seq技術(shù)分析美洲大蠊提取物聯(lián)合順鉑處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)信號通路的變化，為美洲大蠊提取物的應(yīng)用及開發(fā)提供數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞低轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株(RKO細(xì)胞)為美國匹茲堡大學(xué)Lin Zhang教授實(shí)驗(yàn)室贈送；順鉑從中國上海藍(lán)木化工公司購買；美洲大蠊提取物為康復(fù)新液(KFXY)、精粉(JF)、精粉酵解液(JFJJ)，由四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)提供。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)以及加藥處理RKO細(xì)胞用含有10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 μg·mL-1的DMEM完全培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度為90%～95%時，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)并鋪板。細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于12孔板中，24 h后同時加入30 μM cisplatin和一定濃度的美洲大蠊提取物(0.6% KFXY、0.8% JFJJ、100 μg·mL-1JF)處理48 h，然后用RNA抽提試劑TRIzol(中國大連TaKaRa)收集細(xì)胞，并凍存在-80 ℃超低溫冰箱。

1.2.2RNA提取以及檢測按照RNA提取試劑盒(TaKaRa)操作方法提取樣品RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop檢測RNA的純度和濃度。

1.2.3文庫構(gòu)建以及測序分析RNA樣品檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。隨后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTP和DNA polymerase Ⅰ和RNase H合成二鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng·μL-1，隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進(jìn)行檢測，符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度(>2 nM)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeqTM2500進(jìn)行測序。

1.2.4基因表達(dá)量統(tǒng)計和樣品間差異表達(dá)分析基因表達(dá)量的計算使用Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads(FPKM)法。FPKM法能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達(dá)的影響，計算得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣品的基因表達(dá)差異。然后采用EdgeR進(jìn)行差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的鑒定，利用FDR與log2FC篩選差異基因，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1。

1.2.5差異基因GO注釋和KEGGPathway分析

Gene Ontology(GO)是一個國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，提供了一套動態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO總共有3個本體，分別描述基因的分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)、參與的生物過程(biological process)(Botsteinetal.，2000)。東京基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway，KEGG)是一個整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的生物系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫，它提供了一個參考的數(shù)據(jù)庫，將基因?qū)Ρ鹊缴锘顒拥拿總€信號通路中(Kanehisaetal.，2008)。每一組的差異基因用WEGO進(jìn)行樣品間差異基因GO的分類，用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1測序結(jié)果分析

采用Illumina HiSeqTM2500對結(jié)直腸癌細(xì)胞對照組、30 μM cisplatin和0.6% KFXY聯(lián)合處理組、30 μM cisplatin和0.8% JFJJ聯(lián)合處理組、30 μM cisplatin和100 μg·mL-1JF聯(lián)合處理組進(jìn)行測序。各組經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾后得到的reads數(shù)量分別為22 770 909、24 048 295、26 977 761、32 367 493，堿基錯誤率分別為0.04%、0.03%、0.03%、0.03%，Q20的值分別為94.42%、95.84%、95.78%、95.72%，Q30的值分別為87.35%、90.08%、89.87%、89.87%，每個樣品的GC含量分別為50.88%、50.83%、50.75%、51.7%(表1)。以上數(shù)據(jù)表明測序得到的數(shù)據(jù)量和質(zhì)量都很高。

表1 樣品轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計表Table 1 RNA sequencing data

2.2樣品間差異基因統(tǒng)計

采用EdgeR進(jìn)行差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的鑒定和統(tǒng)計，結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，30 μM cisplation和0.6%KFXY聯(lián)合處理組共有1 901個差異基因，其中1 555個基因表達(dá)上調(diào)，346個基因表達(dá)下調(diào)；30 μM cisplation和0.8%JFJJ聯(lián)合處理組共有2 587個差異基因，其中2 183個基因表達(dá)上調(diào)，404個基因表達(dá)下調(diào)；而30 μM cisplation和100 μg·mL-1JF聯(lián)合處理組共有1 488個差異基因，其中1 164個基因表達(dá)上調(diào)，324個基因表達(dá)下調(diào)。

2.3樣品差異基因GO注釋結(jié)果統(tǒng)計

用WEGO進(jìn)行樣品間差異基因GO的分類，樣品差異基因GO注釋統(tǒng)計結(jié)果如圖2所示。3組樣品中的差異基因注釋到參與的生物過程中最多，差異基因注釋到生物過程中的GO主要在細(xì)胞內(nèi)過程(cellular process)、新陳代謝過程(metabolic process)、單一機(jī)體過程(single-organism process)、細(xì)胞刺激反應(yīng)(response to stimulus)等，注釋到細(xì)胞組分的主要在細(xì)胞組分(cell part)、細(xì)胞(cell)、細(xì)胞器(organelle)、細(xì)胞膜(membrane)等，注釋到分子功能的主要在細(xì)胞結(jié)合(binding)、催化活性(catalytic activity)、酶調(diào)節(jié)活性(enzyme regulator activity)、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(molecular transducer activity)等。

圖1 樣品間差異表達(dá)基因統(tǒng)計Fig. 1 Statistical analysis of differentially expressed genes between samples

圖2 樣品間差異基因GO富集統(tǒng)計Fig. 2 GO enrichment statistical analysis of differentially expressed genes between samples

A. 30 μM cisplatin與0.6%KFXY+30 μM cisplatin， B. 30 μM cisplatin與0.8%JFJJ+30 μM cisplatin， C. 30 μM cisplatin與100 μg·mL-1JF+30 μM cisplatin。

2.4樣品差異基因KEGG注釋結(jié)果統(tǒng)計

采用DAVID進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，篩選出25個顯著性最高的信號通路。與對照組相比，30 μM cisplatin和0.6%KFXY聯(lián)合處理組表達(dá)上調(diào)的差異基因主要富集在p53、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、ECM受體、細(xì)胞黏著、細(xì)胞凋亡等信號通路；而表達(dá)下調(diào)的差異基因則主要富集在氨基酰-tRNA生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等氨基酸的生物合成，抗生素生物合成，一碳代謝等信號通路(表2)。與對照組相比，30 μM cisplatin和0.8%JFJJ聯(lián)合處理組中表達(dá)上調(diào)的差異基因主要富集在溶酶體、p53、細(xì)胞粘附分子、MAPK、細(xì)胞凋亡等信號通路；而表達(dá)下調(diào)的差異基因則富集在核糖體、氨基酸生物合成、氨基酰-tRNA生物合成、一碳代謝等信號通路(表3)。與對照組相比，30 μM cisplatin和100 μg·mL-1JF聯(lián)合處理組中表達(dá)上調(diào)的差異基因主要富集在p53、吞噬體、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞凋亡、MAPK等信號通路；表達(dá)下調(diào)的差異基因則主要富集在氨基酰-tRNA生物合成、氨基酸生物合成、抗生素生物合成、一碳代謝等信號通路(表4)。

3 討論

本研究應(yīng)用RNA-seq技術(shù)分析美洲大蠊提取物聯(lián)合順鉑處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)信號通路以及細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的變化。與對照組相比，30 μM cisplatin和0.6%KFXY聯(lián)合處理組共鑒定出1 555個表達(dá)基因上調(diào)，346個基因表達(dá)下調(diào)；30 μM cisplatin和0.8%JFJJ聯(lián)合處理組鑒定出2 183個基因表達(dá)上調(diào)，404個基因表達(dá)下調(diào)；而30 μM cisplatin和100 μg·mL-1JF聯(lián)合處理組則鑒定出1 164個基因表達(dá)上調(diào)，324個基因表達(dá)下調(diào)。為了明確差異基因的功能，采用WEGO和DAVID進(jìn)行差異基因的GO和KEGG富集分析。

表2 30 μM cisplatin與0.6%KFXY+30 μM cisplatin組差異基因KEGG富集統(tǒng)計Table 2 KEGG enrichment statistical analysis of differentially expressed genes between 30 μM cisplatin and 0.6%KFXY+30 μM cisplatin

表3 30 μM cisplatin與0.8%JFJJ+30 μM cisplatin組差異基因KEGG富集統(tǒng)計Table 3 KEGG enrichment statistical analysis of differentially expressed genes between 30 μM cisplatin and 0.8%JFJJ+30 μM cisplatin

GO分析結(jié)果表明，3組樣品中差異基因注釋到生物過程中的最多。KEGG分析結(jié)果則表明與對照組相比，30 μM cisplatin和美洲大蠊聯(lián)合處理組中表達(dá)上調(diào)的基因主要富集在p53、ECM受體、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞凋亡等信號通路。p53信號通路參與了誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)等生物過程，發(fā)揮著避免受損DNA堆積、維持基因組穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與衰老等功能活動(Vogelsteinetal.，2000)。此外，在結(jié)直腸癌中p53信號通路常出現(xiàn)異常(Chenetal.，2006)。最近的研究表明，ECM在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，結(jié)直腸癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞能夠通過直接的細(xì)胞接觸，產(chǎn)生ECM組分和分泌生長因子(Vicenteetal.，2013)。細(xì)胞粘附分子在結(jié)腸直腸癌的轉(zhuǎn)移潛能中發(fā)揮重要作用，因此，能夠介導(dǎo)這種常見惡性腫瘤的預(yù)后效果(Paschosetal.，2009)。值得注意的是，表達(dá)上調(diào)的基因也富集在ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族信號通路，而其中的基因常常在結(jié)直腸癌抗藥性細(xì)胞和腫瘤中高表達(dá)(Hlavataetal.，2012)。表達(dá)下調(diào)的基因主要富集在氨基酰-tRNA生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，抗生素生物合成，一碳代謝等信號通路。氨基酰-tRNA生物合成催化相應(yīng)的氨基酸結(jié)合到tRNAs上，這種催化合成反應(yīng)決定了蛋白質(zhì)的合成和細(xì)胞的存活(Parketal.，2008)，而氨基酰-tRNA生物合成在結(jié)直腸癌中卻是增加的(Kushneretal.，1976)。最新的研究表明，一碳代謝不僅能夠影響癌癥的進(jìn)程，同時也能夠影響基因組的完整和表觀遺傳的改變(Locasaleetal.，2013)。因此，監(jiān)控這些重要信號通路的變化，可以預(yù)測美洲大蠊提取物聯(lián)合順鉑治療結(jié)直腸癌后的預(yù)后效果。

綜上所述，本文分析了美洲大蠊提取物聯(lián)合順鉑處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后信號通路的變化。研究結(jié)果可為美洲大蠊提取物的深入開發(fā)提供豐富的數(shù)據(jù)資源。

表4 30 μM cisplatin與100 μg·mL-1JF+30 μM cisplatin組差異基因KEGG富集統(tǒng)計Table 4 KEGG enrichment statistical analysis of differentially expressed genes between 30 μM cisplatin and 100 μg·mL-1JF+30 μM cisplatin

致謝：本次實(shí)驗(yàn)得到四川好醫(yī)生藥業(yè)集團(tuán)的大力支持，在此致以最真誠的謝意！

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MolecularPortraitofPeriplanetaamericanaExtractsonColonCancerCellsBasedonRNA-seqAnalysis

CHEN Feng1， 2， 3， CHEN Jiasong1， 2， 3， PENG Rui1， 2， 3， GENG Funeng3*， ZOU Fangdong1， 2， 3*

(1. College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China； 2. Sichuan Engineering Research Center for MedicinalAnimals， Chengdu 610065， China； 3. Sichuan Key Laboratory for Medicinal American Cockroach， Chengdu 610065， China)

Periplanetaamericanaextracts can inhibit the growth of several tumors， and even induce tumor cell apoptosis. However， the influence ofP.americanaextracts on the signaling pathways in cancer cells is still unknown. In this study， RNA-seq method was used to investigate the changes of signaling pathways in colon cancer cells that treated withP.americanaextracts and cisplatin. The results showed that， comparing to the untreated group， colon cancer cells that treated with 30 μM cisplatin and 0.6% KFXY had 1 901 differentially expressed genes (DEGs)， including 1 555 up-regulated genes and 346 down-regulated； 30 μM cisplatin and 0.8% JFJJ treated group had 2 587 DEGs， including 2 183 up-regulated genes and 404 down-regulated； 30 μM cisplatin and 100 μg·mL-1JF treated group had 1 488 DEGs， including 1 164 up-regulated genes and 324 down-regulated. GO analysis and KEGG pathway analysis showed that the up-regulated DEGs were enriched in p53 signaling pathway， cell adhesion and apoptosis， while the down-regulated DEGs were enriched in aminoacyl-tRNA biosynthesis， one carbon pool and biosynthesis of amino acids.

Periplanetaamericana； extraction； transcriptome； differentially expressed genes； signaling pathways； functional annotation

10.11984/j.issn.1000-7083.20170105

2017-03-31接受日期2017-06-09

陳峰(1991—)， 男， 碩士研究生， 研究方向?yàn)榧?xì)胞分子生物學(xué)， E-mail：879526987@qq.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：haoyishenggfn@126.com； fundzou@scu.edu.cn

Q965.9

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1000-7083(2017)06-0649-08