李超程 ，趙喜堂 ，杜迎春 ，孫麗榮 ，蔣松 ，劉明達(dá) ，營瑞文 ，魏麗敏 ，賈斌 *

（1石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師34團(tuán)，新疆 庫爾勒 841506；3北京市水生野生動植物救護(hù)中心，北京 102100；4通遼市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

塔里木馬鹿胎兒性別鑒定

李超程1，趙喜堂2，杜迎春3，孫麗榮4，蔣松1，劉明達(dá)1，營瑞文1，魏麗敏1，賈斌1*

（1石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師34團(tuán)，新疆 庫爾勒 841506；3北京市水生野生動植物救護(hù)中心，北京 102100；4通遼市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

為建立一種簡單、準(zhǔn)確的塔里木馬鹿早期胎兒性別鑒定新方法，本研究利用妊娠馬鹿血漿中胎兒游離的DNA為模板，通過常規(guī)PCR擴(kuò)增牙釉蛋白特異序列，對89頭妊娠12-14周齡塔里木馬鹿進(jìn)行胎兒性別鑒定，鑒定結(jié)果與實際產(chǎn)犢性別進(jìn)行比較。結(jié)果表明：成功從X染色體上擴(kuò)增出282 bp的片段，從Y染色體上擴(kuò)增出252 bp的特異性片段；89頭妊娠母鹿胎兒檢測結(jié)果顯示，50頭為公，39頭為母，與實際產(chǎn)仔性別比對后，鑒定準(zhǔn)確率為91.01%。由此可知，利用胎兒游離DNA和牙釉蛋白基因?qū)λ锬抉R鹿進(jìn)行早期胎兒性別鑒定，方法簡單且準(zhǔn)確率高。

胎兒性別鑒定；塔里木馬鹿；牙釉蛋白；PCR

由于性別在家畜經(jīng)濟(jì)性狀中的重要影響，性別鑒定與性別控制技術(shù)的相輔相成對畜牧業(yè)生產(chǎn)有著重要意義[1]。馬鹿作為以雄性產(chǎn)茸為主要經(jīng)濟(jì)收入的經(jīng)濟(jì)動物，對子代性別的要求尤為突出，所以利用妊娠馬鹿血漿中胎兒游離DNA對胎兒進(jìn)行性別鑒定，在生產(chǎn)中價值重大，因此，這對PCR技術(shù)和DNA提取技術(shù)的改進(jìn)提出了更高要求。早期PCR性別鑒定實驗，僅針對Y染色體短臂獨有的性別決定基因（如睪丸決定因子SRY基因）設(shè)計引物[2]，此類方法無內(nèi)參引物參照，普遍存在假陰性問題，隨后雖通過雙重或多重PCR加入內(nèi)參引物改進(jìn)，但過程相對復(fù)雜繁瑣。

牙釉蛋白（amelogenin，AMEL）是 XY染色體上 1對不同多態(tài)性的等位基因（AMEL-X/AMEL-Y）。1992年Gibson等[3]對牛AMEL基因進(jìn)行克隆、測序、分析后發(fā)現(xiàn)，AMEL-Y基因相對于AMEL-X少21個氨基酸，同時還有13個氨基酸不同。AMEL-X與AMEL-Y基因的cDNA具有93%的同源性，而它們的第五內(nèi)含子卻只有45.1%的同源性。1993年Sullivan等[4]成功利用AMEL基因引物擴(kuò)增進(jìn)行人的性別鑒定。隨后Buel等[5]、Chen 等[6]、Zeleny 等[7]、Sembon 等[8]、Hasegaw等[9]等，Pfeiffer等[10]采用 1對AMEL引物擴(kuò)增對牛、豬、馬和綿羊本身性別鑒定均獲得成功。這些研究說明相對于單獨設(shè)計Y染色體上特異性基因，AMEL基因在雌雄性別之間存在不同多態(tài)性，無需引入內(nèi)參引物即可進(jìn)行性別鑒定。

雖然有關(guān)AMEL基因?qū)π詣e鑒定的報道最早見于1993年[4]，但對妊娠母體血液中胎兒游離DNA的性別鑒定由于其濃度和純度的原因，直到2005年才初見Zhu等[11]在孕婦身上的報道，隨后由于其無創(chuàng)傷性特點，在不同動物中得到廣泛應(yīng)用。目前僅有Pfeiffer等[10]和Gurgul等[12]利用AMEL基因鑒定馬鹿本身性別，而利用AMEL基因和胎兒游離DNA對妊娠馬鹿進(jìn)行胎兒性別鑒定的研究未見報道。據(jù)報道，妊娠母體血漿中胚胎游離DNA濃度在妊娠3個月時達(dá)到最高水平[13]，且長度一般為200-300 bp小片段。

本實驗選擇采集妊娠12-14周齡母鹿血樣，通過血漿小片段DNA提取和富集試劑盒，以獲取妊娠馬鹿血漿中胎兒游離的DNA，并以其為模板，采用常規(guī)PCR技術(shù)擴(kuò)增AMEL基因進(jìn)行了胎兒性別鑒定，旨在研究和探討更為簡單、準(zhǔn)確的妊娠馬鹿胎兒性別鑒定新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血漿

89頭妊娠母鹿及青年空懷母鹿、青年公鹿陰陽性對照血樣均采自新疆兵團(tuán)第二師某團(tuán)鹿場，頸靜脈采血8-12 mL，肝素鈉抗凝，4 h內(nèi)，2000 r/min離心10 min，分離出血漿1.5 mL，離心管分裝后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit購自美國凱捷公司，PCR反應(yīng)試劑2×Taq PCR Master Mix購自北京天根生化有限公司，DNA Mark I購自北京天根生化有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

妊娠母鹿血漿中胎兒游離DNA濃度相對較低，降解較快，應(yīng)在采樣后6-8 h內(nèi)提取。陰陽性對照組（青年空懷母鹿、青年公鹿）及實驗組妊娠母鹿血漿DNA由QIAamp DNA Mini Kit DNA試劑盒提取，同時適當(dāng)改進(jìn)以提高濃度，改進(jìn)內(nèi)容包括：分裝后1.5 mL離心管中血漿先進(jìn)行低速離心，吸取離心管下層血漿用以提DNA；過吸附柱時對DNA進(jìn)行富集；減少AE洗脫液用量。所提取的DNA平均濃度為 8 μg/μL。

1.2.2 馬鹿AMEL基因PCR擴(kuò)增

馬鹿AMEL基因引物參照文獻(xiàn)[12]，由上海生工生物工程有限公司合成工合成。設(shè)置陽性對照（公鹿血漿DNA）、陰性對照（母鹿血漿DNA），空白對照（超純水），20 μLPCR反應(yīng)體系中加入：DNA模板1 μL，2×PCR Mix 10 μL，去離子水 8 μL，上游引物（5'-AGTTCCTGGCCAACACTC-3'）0.5 μL（100μmol/L），下游引物（5'-GCTGGC-CAAGCTTCCAGA-3'）0.5 μL（100 μmol/L）；PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火溫度，退火 30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)數(shù)為38；72℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照組DNA的性別鑒定結(jié)果

馬鹿AMEL基因序列的擴(kuò)增片段長度：雌性馬鹿有282 bp的特異性擴(kuò)增片段，作為陰性對照；雄性馬鹿同時具有282和252 bp 2條特異性擴(kuò)增片段，作陽性對照。擴(kuò)增AMEL基因序列的特異性片段，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，結(jié)果見圖1。

圖1 馬鹿血漿中DNA PCR擴(kuò)增AMEL基因雌雄特異性片段結(jié)果Fig.1 The specific fragment of AMEL gene amplification in cervus elapghus plasma DNA

2.2 母鹿血漿中胎兒游離DNA的性別鑒定結(jié)果

本實驗共鑒定89頭妊娠母鹿胎兒，其中50頭為公，39頭為母，部分鑒定結(jié)果（圖2）顯示，泳道7、9、10、14：與陽性對照相同，有 2條特異性 AMEL引物擴(kuò)增片段，表明胎兒性別為雄性，泳道 5、6、8、11、12、13、15、16：與陰性對照相同，有 1條特異性AMEL引物擴(kuò)增片段，表明胎兒性別為雌性。

圖2 血漿DNA AMEL引物擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.2 The specific fragment of AMEL primer amplification products in plasma DNA

2.3 鑒定結(jié)果與實際性別比對結(jié)果

89頭妊娠母鹿配種時間為每年9月20日左右，采血時間為次年2月，實際產(chǎn)犢時間為6-7月。本實驗對所采集89頭份妊娠母鹿血漿進(jìn)行胎兒性別鑒定后，與實際產(chǎn)仔性別進(jìn)行比對，鑒定準(zhǔn)確率為91.01%，結(jié)果見表1。

表1 鑒定性別與實際性別對比結(jié)果統(tǒng)計表Tab.1 The statistical results of detection and actual for gender

3 討論

長期以來性別鑒定為解決只針對一種性別特異性基因（如Y染色體SRY基因）擴(kuò)增而產(chǎn)生的假陰性問題，通常采用雙重PCR、多重PCR、巢式PCR等復(fù)雜方法。本實驗AMEL基因通過常規(guī)PCR擴(kuò)增，雌雄個體都擁有不同的擴(kuò)增產(chǎn)物，無需加入內(nèi)參引物就能解決常用SRY基因假陰性問題，不僅簡化了檢測方法，同時也避免多重PCR擴(kuò)增中引物、底物等的交互競爭，準(zhǔn)確性和靈敏度都會有所提高[3]。幸宇云等[14]報道AMEL基因引物靈敏度比SRY基因高出8-10倍，本實驗在選擇AMEL基因在簡化PCR過程的同時，也降低了對胎兒游離DNA濃度的要求。

由于妊娠母畜血漿中胎兒游離DNA的量極少，且在血漿中降解速度較快[15]，依照傳統(tǒng)方法對血漿中胎兒游離DNA提取的濃度和純度低，導(dǎo)致AMEL基因胎兒性別鑒定準(zhǔn)確率降低[16]，這是常規(guī)方法長期以來無法較好應(yīng)用的另一重要原因。本實驗中發(fā)現(xiàn)，從采血后4℃保存6 h和24 h，血漿中提取的胎兒游離DNA，利用相同方法得到的瓊脂糖電泳圖結(jié)果不同，6 h組雄性252 bp條帶清晰而24 h組模糊，此現(xiàn)象與席繼鋒等[16]在利用AMEL基因?qū)δ膛＿M(jìn)行早期胚胎鑒定時所獲得條帶模糊且不穩(wěn)定的結(jié)果相似，同時李勤等[17]報道血漿中胎兒游離DNA占總DNA比重從6 h的10.3%降至36 h的3.0%，由此可以推斷母體免疫系統(tǒng)存在促使血漿中胎兒游離細(xì)胞凋亡和胎兒DNA降解機(jī)制[18]，所以提高所提取胎兒DNA濃度關(guān)鍵之一是血漿分離后于最短時間內(nèi)提取DNA。

AMEL基因在塔里木馬鹿上的成功擴(kuò)增與較高濃度、純度血漿胎兒游離DNA的提取，為鑒定妊娠塔里木馬鹿胎兒性別提供了一種簡單準(zhǔn)確的新方法，但此方法仍有改進(jìn)空間。本實驗鑒定結(jié)果與實際結(jié)果比對后發(fā)現(xiàn)，雖然AMEL基因可簡單有效地解決SRY基因需要復(fù)雜PCR技術(shù)才能解決的假陰性問題，但其仍未解決由于母體DNA背景造成的空胎被誤測為雌性胎兒問題。因此，如果想要建立鑒定準(zhǔn)確率更高的方法，母體背景DNA是最后的阻礙。有報道[19]稱血漿中胎兒游離DNA片段長度一般小于313 bp。母體背景DNA片段長度一般大于313 bp，所以解決此問題的一個可行性方法就是特異性富集片段長度小于300 bp的DNA分子，提高血漿中胎兒游離DNA濃度，相對降低母體DNA濃度，從而間接解決背景過高造成空胎鑒定結(jié)果為陰性的問題，不過目前國際上主要通過瓊脂糖凝膠電泳法富集胎兒游離DNA，但此方法操作時間長、精確度低，并且產(chǎn)物極易被污染，所以此類問題還有待于進(jìn)一步研究。

[1]寧孟影，孫麗榮，張永生，等.豬Zfx基因RNAi載體篩選及性控效果的觀察[J].石河子大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015，33(2):192-195.Ning M Y，Sun L R，Zhang Y S，et al.Construction of RNAi vecters of swine Zfx gene and their effects on sexual control[J].Journal of Shihezi University(Natural Science)，2015，33(2):192-195.

[2]Chrenek P，Boulanger L，Heyman Y，et al.Sexing and multiple genotype analysis from a single cell of bovine embryo[J].Theriogenology，2001，55(5):1071-1081.

[3]Gibson C W，Golub E E，Abrams W R，et al.Bovine amelogenin message heterogeneity:alternative splicing and Y-chromosomal gene transcription[J].Biochemistry，1992，31(35):8384-8388.

[4]Sullivan K M，Mannucci A，Kimpton C P，et al.A rapid and quantitative DNA sex test:fluorescence-based PCR analysis ofX-Y homologousgene amelogenin[J].Biotechniques，1993，15(4):636-638，640-641.

[5]Buel E，Wang G，Schwartz M.PCR amplification of animal DNA with human X-Y amelogenin primers used in gender determination[J].J Forensic Sci，1995，40(4):641-644.

[6]Chen C,Hu C L,Wang C H,et al.Gender determination in single bovine blastomeres by polymerase chain reaction amplification of sex-specific polymorphic fragments in the amelogenin gene[J].Mol Reprod Dev,1999，54(3):209-214.

[7]Zeleny R，Bernreuther A，Schimmel H，et al.Evaluation of PCR-based beef sexing methods[J].J Agric Food Chem，2002，50(15):4169-4175.

[8]Sembon S，Suzuki S，F(xiàn)uchimoto D，et al.Sex identification of pigs using polymerase chain reaction amplification of the amelogenin gene[J].Zygote，2008，16(4):327-332.

[9]Hasegaw T，Sato F，Ishida N，et al.Sex determination by simultaneous amplification of equine SRY and amelogenin genes[J].J Vet Med Sci,2000，62(10):1109-10.

[10]Pfeiffer I,Brenig B.X-and Y-chromosome specific variants of the amelogenin gene allow sex determination in sheep(Ovis aries)and European red deer(Cervus elaphus)[J].BMC Genet,2005，6(1):16.

[11]Zhu B，Sun Q W，Lu Y C，et al.Prenatal fetal sex diagnosis by detecting amelogenin gene in maternal plasma[J].Prenat Diagn,2005，25(7):577-81.

[12]Gurgul A，Radko A，Slota E.Characteristics of X-and Y-chromosome specific regions of the amelogenin gene and a PCR-based method for sex identification in red deer(Cervus elaphus)[J].Mol Biol Rep,2010，37(6):2915-2918.

[13]楊麒巍，于杉，張桂珍.孕婦外周血中游離胎兒DNA富集與分離方法及在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].中國實驗診斷學(xué)，2014，18(2):345-348.

[14]幸宇云，陳從英，黃路生，等.應(yīng)用牙釉蛋白(AML)基因鑒別牛早期胎兒性別[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2005，13(6):759-762.Xing Y Y，Chen C Y，Huang L S，et al.Gender determination in bovine preimplantation embryosby amplification of amelogenin(AML)gene[J].Journal of Agricultural Biotechnology，2005，13(6):759-762.

[15]于韶榮，史美祺，劉寶瑞，等.全血分離時間對腸癌患者血漿游離DNA濃度的影響[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，9(5):554-557.Yu S R，Shi M Q，Liu B R，et al.The influence of whole blood isolation time on plasma free DNA concentration in patients with intestinal cancer[J].Journal of Chengdu Medical College，2014，9(5):554-557.

[16]席繼鋒，王香祖，賈斌，等.PCR擴(kuò)增妊娠奶牛牙釉蛋白基因進(jìn)行胎兒性別鑒定的研究[J].中國奶牛，2011(14):1-4.Xi J F，Wang X Z，Jia B，et al.Study of embryo sex identification by PCR amplification for AML gene in pregnant dairy cows[J].China Dairy Cattle，2011(14):1-4.

[17]李勤，張毅，丁宇烽，等.孕婦血樣采集后體外存放對血漿中胎兒游離DNA水平的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29(9):1042-1045.Li Q，Zhang Y，Ding Y F，et al.Influence of delay in bloodprocessing on the level of cell-free fetal DNA in maternal plasma sample[J].Academic Journal of Second Military Medical University，2008，29(9):1042-1045.

[18]蔣立斌.綿羊外周血中游離DNA應(yīng)用于胎兒性別鑒定以及基因分型的初步研究[D].石河子：石河子大學(xué)，2014:5-10.

[19]Chan K C，Zhang A B，Hui N，et al.Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma[J].Clin Chem，2004,50(1):88-92.

Fetal sex identification ofCervus elaphus yarkandensis

Li Chaocheng1,Zhao Xitang2,Du Yingchun3,Sun Lirong4,Jiang Song1,Liu Mingda1,Ying Ruiwen1,Wei Limin1,Jia Bin1*

(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 Farm No.34 of Agriculture Division No.2 of Xinjiang BINGTUAN,Kuerle,Xinjiang 841506,China;3 Beijing Aquatic Wildlife Rescue Center,Beijing 102100,China;4 Tongliao Agricultural and Livestock Products Quality and Safety Center,Tongliao,Inner Mongolia 028000,China)

To establish a simple and accurate method for the sex identification of theCervus elapghus yarkandensisearly fetal.The free DNA of fetal fetus as a template was used to amplify the enamel protein specific sequence by routine PCR,and then to identify the sex of 89 pregnantCervus elaphus yarkandensisfetuses with 12-14 weeks of age,finally the identification results and actual calving sex were compared in this study.The results showed that the 282 bp fragment was successfully amplified from X chromosome and 252 bp fragment was successfully amplified from Y chromosome;The fetal sex identification results of 89 pregnantCervus elapghusshowed that 50Cervus elapghuswere male and 39 were female.The identification accuracy was 91.01%,compared with the actual calving sex.Therefore,the plasma free DNA as the template,and the amelogenin gene can be used to identify the fetal sex,and the method is simple and high accuracy.

fetal sex diagnosis;Cervus elapghus yarkandensis;amelogenin;PCR

S825

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.05.018

1007-7383(2017)05-0632-04

2017-02-25

新疆兵團(tuán)動物疾病防控重點實驗室開放基金課題項目（BTDJ04）

李超程（1991-），男，碩士研究生，專業(yè)方向為免疫遺傳與抗病機(jī)理。

*通信作者：賈斌（1965-），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事分子遺傳與抗病育種研究，e-mail:jiabin@shzu.edu.cn。