文/王靜波 賈麗 徐立蒲 王小亮 張文 王姝 曹歡

引起虹鱒魚苗大量死亡病因分析

文/王靜波 賈麗 徐立蒲 王小亮 張文 王姝 曹歡

北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專欄

2017年3月～4月，北京懷柔一家虹鱒魚養(yǎng)殖場(chǎng)虹鱒魚苗發(fā)病，且出現(xiàn)大量死亡。患病魚主要表現(xiàn)為無活力，漂浮水面，集中于池子四角；鰓蓋張開，嚴(yán)重患病魚鰭條和尾柄出現(xiàn)潰爛。為確定病因，將患病魚分別進(jìn)行傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、細(xì)菌以及寄生蟲檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示：IHNV陰性；未分離到細(xì)菌；在患病魚鰓和體表均發(fā)現(xiàn)大量三代蟲，且體表數(shù)量最多，經(jīng)PCR檢測(cè)和序列比對(duì)確定為細(xì)鱗鮭三代蟲。故判斷導(dǎo)致該場(chǎng)虹鱒魚苗大量死亡的病因是感染了細(xì)鱗鮭三代蟲。

鮭鱒魚是優(yōu)質(zhì)的冷水魚類，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，國(guó)際貿(mào)易頻繁，病害也凸顯，如傳染性造血器官壞死?。↖HN），已給全國(guó)乃至世界虹鱒魚養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重影響，成為目前制約鮭鱒魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸。另外，因感染三代蟲造成鮭鱒魚苗大量死亡也有報(bào)道，如大西洋鮭三代蟲病是必須向OIE申報(bào)的疾病，該病僅兩年就使挪威野生大西洋鮭科魚幼魚數(shù)量下降50%。2017年3月～4月，北京市懷柔區(qū)一家虹鱒魚養(yǎng)殖場(chǎng)虹鱒魚苗出現(xiàn)大量死亡，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，累計(jì)死亡率達(dá)80%以上，死亡30余萬尾。針對(duì)這一情況，本文作者對(duì)患病魚分別進(jìn)行了IHNV、細(xì)菌和寄生蟲檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)，IHNV陰性，未分離到細(xì)菌，卻在患病魚鰓和體表均發(fā)現(xiàn)大量細(xì)鱗鮭三代蟲?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

一、材料方法

1.材料

患病虹鱒魚來自北京懷柔一家虹鱒魚養(yǎng)殖場(chǎng)。魚體規(guī)格4cm～5cm。

2.主要試劑

腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋生物技術(shù)有限公司。哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于北京威泰科生物技術(shù)有限公司。DNA抽提試劑盒及PCR相關(guān)試劑購(gòu)于上海生物工程有限公司。

3.病原菌分離

取具典型癥狀的患病虹鱒魚苗，無菌操作從肝、脾和腎劃線分離于腦心浸液瓊脂（BHIA）平板和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，于22℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

4.IHNV檢測(cè)

依據(jù)GB/T 15805.2-2008的要求，進(jìn)行細(xì)胞分離和PCR檢測(cè)。

5.寄生蟲檢測(cè)

顯微鏡檢：取鰓組織制作水浸片，同時(shí)刮體表粘液壓片，進(jìn)行觀察。

分子技術(shù)：依據(jù)OIE水生動(dòng)物診斷試驗(yàn)手冊(cè)提供方法。在解剖鏡下，挑去單個(gè)蟲體，放入無水酒精中固定，備用DNA抽提。PCR擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列。引物5′-TTTCCGTAGGTGAACCT-3′和5′-TCCTCCGCTTAGTGATA-3′擴(kuò)增1300bp的ITS區(qū)域。PCR反應(yīng)體系50ul，PCR反應(yīng)條件95 ℃ 預(yù)變性5分鐘； 94 ℃變性1分鐘、50℃退火1分鐘、72℃ 延伸2分鐘，循環(huán)30次；最后72℃延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物由上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

二、結(jié)果

1.發(fā)病情況

發(fā)病漁場(chǎng)虹鱒魚苗2017年3月初出現(xiàn)死亡，且持續(xù)死亡，累計(jì)死亡率達(dá)80%以上，死亡30余萬尾?；疾◆~主要表現(xiàn)為無活力，漂浮水面，集中于池子四角；鰓蓋張開；嚴(yán)重患病魚鰭條和尾柄出現(xiàn)潰爛。在此期間，養(yǎng)殖水溫11℃～12℃。

2.IHNV檢測(cè)和細(xì)菌分離

IHNV檢測(cè)結(jié)果為陰性；未從患病魚內(nèi)臟中分離到細(xì)菌。

3.寄生蟲檢測(cè)

（1）形態(tài)觀察：在鰓組織水浸片和體表粘液壓片中均發(fā)現(xiàn)大量活蟲體，形態(tài)類似三代蟲（見圖1）。在體表粘液中的蟲體很快降解，很多蟲體僅剩下一對(duì)大鉤（見圖2）。在解剖鏡下，可見在患病魚體表和鰭條遍布密密麻麻的活體三代蟲，蟲體不斷伸縮（由于解剖鏡無拍照功能，本文中未提供照片）。

圖1 體表粘液蟲體

圖2 蟲體固著器-大鉤

（2）三代蟲ITS基因序列分析：樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增出三代蟲屬基因片段約1300bp。序列經(jīng)測(cè)序后，在NCBI上經(jīng)Blast同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其與GeneBank登記的編碼為KP325622細(xì)鱗鮭三代蟲的同源性最高，基因序列一致性99.43%。（見圖3）

三、討論

通過對(duì)具有典型臨床癥狀的患病虹鱒魚苗寄生蟲檢測(cè)，在其鰓和體表發(fā)現(xiàn)大量活體三代蟲，尤其是體表，蟲體密密麻麻遍布全身。寄生蟲病的確診主要是依據(jù)感染強(qiáng)度來判斷，當(dāng)大量的三代蟲寄生魚苗體時(shí)，即可診斷為該魚苗已患三代蟲病。為進(jìn)一步確定三代蟲種類，對(duì)蟲體核酸進(jìn)行PCR檢測(cè)與基因比對(duì)序列分析，結(jié)果顯示與GeneBank登記的編碼為KP325622（細(xì)鱗鮭三代蟲）的基因序列一致性達(dá)99.43%，故判斷該場(chǎng)虹鱒魚苗感染的三代蟲為細(xì)鱗鮭三代蟲。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果和結(jié)合臨床癥狀綜合分析，引起漁場(chǎng)虹鱒魚苗大量死亡原因?yàn)楦腥玖思?xì)鱗鮭三代蟲。

根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中規(guī)定，將三代蟲病列為三類疫病。三代蟲主要寄生在魚體表和鰓，廣泛分布于世界各地海水和淡水水域，能寄生于絕大多數(shù)野生及養(yǎng)殖魚類，已報(bào)道的有400余種。三代蟲隸屬于單殖吸蟲，胎生，繁殖和傳播迅速，容易大面積爆發(fā)，尤其對(duì)魚苗影響較大，易造成魚苗大批量死亡。據(jù)報(bào)道大西洋鮭三代蟲僅兩年就使挪威野生大西洋鮭科魚幼魚數(shù)量下降了50%，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)有較大的危害。上世紀(jì)九十年代末，我國(guó)黑龍江寧安渤海冷水魚試驗(yàn)站養(yǎng)殖的細(xì)鱗鮭爆發(fā)細(xì)鱗鮭三代蟲病，12天死亡率達(dá)47%；2005年在陜西一家虹鱒魚養(yǎng)殖也暴發(fā)過細(xì)鱗鮭三代蟲病。

防治三代蟲有效的方法是使用菊酯類的藥物，如敵百蟲等。但是由于虹鱒魚對(duì)敵百蟲非常敏感，不適合用它進(jìn)行治療。OIE水生動(dòng)物診斷試驗(yàn)手冊(cè)介紹了用高鹽度水，福爾馬林及含有氯和碘的化合物治療大西洋鮭三代蟲病的方法，結(jié)合本地情況作者建議該場(chǎng)使用高鹽度水進(jìn)行治療，病情迅速得到控制。根據(jù)養(yǎng)殖者對(duì)發(fā)病史的敘述，作者分析本場(chǎng)發(fā)病原因可能與放養(yǎng)密度大，投飼量高，導(dǎo)致環(huán)境變差，而引發(fā)該病的暴發(fā)，因此還需要合理放養(yǎng)和投食。

近些年，國(guó)內(nèi)外報(bào)道虹鱒魚苗因感染IHNV等病毒造成大量死亡病例較多，而因感染寄生蟲造成大量死亡的病例較少。因此，在今后虹鱒魚苗病害診斷與防控中也要注意寄生蟲病等。

圖3 ITS部分核酸序列比對(duì)結(jié)果（僅為部分截圖）

作者單位：北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站