劉海龍，陳小姝，楊富軍，白冬梅，孫曉蘋， 呂永超，任小平，姜慧芳*，高華援*

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究所，吉林 公主嶺 136100； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，山西 汾陽 032200； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢 430062)

花生種質(zhì)資源耐低溫表型鑒定方法研究

劉海龍1，3，陳小姝1，楊富軍1，白冬梅2，孫曉蘋1， 呂永超1，任小平3，姜慧芳3*，高華援1*

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究所，吉林 公主嶺 136100； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，山西 汾陽 032200； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，湖北 武漢 430062)

本研究目的是構(gòu)建既可鑒定花生種質(zhì)資源耐低溫屬性，又可進行耐低溫性數(shù)量性狀分析的表型鑒定方法。本方法構(gòu)建公式相對發(fā)芽率=xi/yi×100%，花生耐低溫性屬性分級標準鑒定花生耐低溫屬性，及利用相對發(fā)芽率數(shù)據(jù)進行耐低溫數(shù)量性狀分析。利用此方法對94份花生種質(zhì)資源進行鑒定，鑒定出相對發(fā)芽率≥85% 耐低溫型(R)6個，約占檢測資源的6.38%，分別為山花8(A1)、豫花1(A38)、開農(nóng)30(A10)、白沙1016(A37)、油4(A32)和泉花646(A42)，從94份花生資源中選取20份材料進行田間耐低溫驗證，其結(jié)果與本研究構(gòu)建的方法結(jié)果一致，證明花生種質(zhì)資源耐低溫表型方法可以鑒定花生種質(zhì)資源耐低溫屬性；利用此方法鑒定出徐花13×中花6重組自交系群體(RIL)各家系及親本，分析耐低溫性主基因+多基因遺傳模型，符合模型G-1，主基因的遺傳率為91.21%，多基因的遺傳率為8.34%，證明此方法可應(yīng)用在耐低溫性數(shù)量性狀分析上。

花生；耐低溫；表型；相對發(fā)芽率

花生(ArachishypogaeaL.)起源于南美洲的熱帶亞熱帶地區(qū),栽培花生是豆科(Leguminosae)花生屬(Arachis)花生區(qū)組(Arachissection)的一種，是世界范圍內(nèi)重要的油料和經(jīng)濟作物之一[1]。

花生在我國南北方都有種植，近年在東北等高緯度地區(qū)花生種植面積發(fā)展迅速，同時低溫對我國高緯度花生單產(chǎn)影響非常嚴重，開花期遇到低于22℃的低溫，花生不授粉，有殼無仁，造成大面積減產(chǎn)，開花期低溫在吉林省每隔3～4年就會發(fā)生1次，減產(chǎn)幅度一般為30%～40%；播種期遇寒流即發(fā)生大面積低溫爛種，出苗不齊或不出苗，導(dǎo)致嚴重減產(chǎn)；收獲期遭遇低溫(4℃)，會使種子死亡，脫水困難，霉果率高，嚴重影響花生銷售價格，還會給來年的花生生產(chǎn)造成潛在的危害。

低溫是我國高緯度花生產(chǎn)區(qū)主要非生物脅迫之一，選育耐低溫品種是理想途徑。而花生耐低溫種質(zhì)表型鑒定是選育耐低溫花生品種的前提，現(xiàn)階段我國對花生耐低溫表型鑒定的研究報道較少[2-3]，為了加快我國花生耐低溫品種的選育，有必要構(gòu)建一個行之有效的花生耐低溫表型鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

1.1.1 種子的準備

參試材料94份(由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供，見表1)，選擇飽滿活力正常的種子，每個品種各180粒,平均分為6份，每份30粒，將試驗所用的種子取出置于室溫下。

1.1.2 種子發(fā)芽

種子處理方法主要利用冷浸處理的方法，進行低溫吸脹發(fā)芽試驗。冷浸溫度為2℃，每份(30粒)種子做3次重復(fù)，浸種48h后，放置25℃下發(fā)芽。同時正常發(fā)芽每份(30粒)種子做3次重復(fù)，作為矯正參數(shù)。分別在72、96、120h采集發(fā)芽數(shù)。

準備的種子，酒精消毒，放置在小燒杯中，蒸餾水沖洗掉酒精，置于預(yù)冷2℃滅菌的蒸餾水浸泡48h。滅菌的培養(yǎng)皿底部放置濾紙，加2℃滅菌的蒸餾水，將浸泡48h種子無菌的狀態(tài)下放置在直徑為9cm 的干凈滅菌的培養(yǎng)皿中，25℃電腦恒溫層析柜中發(fā)芽。

1.2 相對發(fā)芽率計算

相對發(fā)芽率公式：RGRi=xi/yi×100%

RGRi為第i個試驗材料相對發(fā)芽率，xi為第i個試驗材料在2℃浸泡48h后置于層析柜中25℃發(fā)芽得到的發(fā)芽率，yi為第i個試驗材料按照常規(guī)發(fā)芽方法的發(fā)芽率(矯正參數(shù))。

xi=mi/ai×100%yi=si/bi×100%

mi為第i個試驗材料在2℃浸泡48h后置于層析柜中25℃發(fā)芽數(shù)，ai為第i個試驗材料花生仁數(shù);yi為第i個試驗材料按照常規(guī)發(fā)芽方法的發(fā)芽數(shù)(矯正參數(shù))，bi為第i個按照常規(guī)發(fā)芽方法試驗材料花生仁數(shù)。 約束條件：ai=bi

1.3 花生耐低溫性屬性分級標準

相對發(fā)芽率≥85%，耐低溫型(R)；50%≤相對發(fā)芽率<85%，中間型(M)；相對發(fā)芽率<50%，敏感型(S)。

1.4 田間驗證方法

采用王晶珊等[3]田間鑒定花生耐低溫性方法，略有改動。2014-05-05(3d地溫穩(wěn)定在9℃時)，選取室內(nèi)鑒定的20份試驗材料，分別為白沙1016(A37)、中花5(54)、開農(nóng)30(A10)、山花8(A1)、鄂花4(A11)、油4(A42)、泉花646(A32)、豫花1(A38)、黔花生2號(A24)、?；?(A43)、山花9(A2)、油7(A31)、桂花17(A20)、CS16(A70)、H4145(A77)、粵油92(A13)、桂花66(A19)、冀油6(A9)、冀花6(A29)、09測S8(A93)，采用隨機區(qū)組試驗，3次重復(fù)，行長5.0m，壟寬0.6m，4行區(qū)，每穴單粒播種，播種后5d，調(diào)查花生出苗數(shù)。

公式： EA(出苗能力)=出苗率×100/從播種到第i天出苗的相應(yīng)天數(shù)

1.5 遺傳模型分析

試驗材料為徐花13(敏感型，三次重復(fù)平均相對發(fā)芽率=38.20%)×中花6(中間型，三次重復(fù)平均相對發(fā)芽率=74.50%)，包含188個家系的RIL群體(F7)，親本及群體材料采用花生耐低溫表型鑒定方法，三次重復(fù)。遺傳模型分析采用蓋鈞鎰等提出的植物數(shù)量性狀遺傳模型主基因+多基因多世代聯(lián)合分析方法[4-6]，對親本徐花13(P1)、中花6(P2)和RIL群體的耐低溫性狀進行遺傳分析。通過迭代ECM算法估計各世代、各成分分布參數(shù),然后通過模型的極大對數(shù)似然函數(shù)值MLV和AIC值，利用AIC準則選擇備選的相對最佳模型，即AIC值最小的模型作為最優(yōu)模型。同時進行適合性檢驗，選擇統(tǒng)計量達到顯著水平個數(shù)最少的模型為最優(yōu) 遺傳模型，并由此估計出相應(yīng)的主基因與多基因效應(yīng)值、方差及有關(guān)遺傳參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生耐低溫性屬性鑒定結(jié)果與分析

從表1可以看出，根據(jù)花生耐低溫性屬性分級標準，相對發(fā)芽率<50% 敏感型(S)共有75個資源，約占檢測資源的78.72%；50%≤相對發(fā)芽率<85% 中間型(M)有14個資源，分別為山花10(A3)、鄂花4(A11)、桂花66(A19)、黔花生2號(A24)、黔花生4號(A25)、油7(A31)、泉花10(A41)、福花3(A43)、福花4(A46)、福花8(A47)、中花8(A55) 、H4145(A77)、09測S8(A93)、中花5(A54)，約占檢測資源的15.56%；相對發(fā)芽率≥85% 耐低溫型(R)有6個資源，約占檢測資源的6.38%，分別為：山花8(A1)、豫花1(A38)、開農(nóng)30(A10)、白沙1016(A37)、油4(A32)、泉花646(A42)。花生耐低溫資源在花生種質(zhì)資源比例約為6.38%，占整個資源的比例較小，但耐低溫性資源確實存在，同時說明利用花生耐低溫表型鑒定方法可以明確劃分花生耐低溫資源。

2.2 耐低溫屬性鑒定結(jié)果田間驗證

表2可見，田間鑒定的耐低溫型種質(zhì)資源有8個種質(zhì)屬于耐低溫型，分別為白沙1016、中花5、開農(nóng)30、山花8、鄂花4、油4、泉花646、豫花1。利用相對發(fā)芽率指標鑒定的耐低溫型種質(zhì)資源有6個，分別為山花8、豫花1、開農(nóng)30、白沙1016、油4、泉花646。田間鑒定的耐低溫型比利用相對發(fā)芽率指標鑒定出的耐低溫型多出2個種質(zhì)資源，分別為中花5和鄂花4，其他田間檢測與利用相對發(fā)芽率檢測結(jié)果一致，說明花生種質(zhì)資源耐低溫表型方法可以鑒定花生種質(zhì)資源耐低溫屬性。

但田間鑒定的耐低溫種質(zhì)資源與利用相對發(fā)芽率鑒定出的耐低溫種質(zhì)資源排序并非完全一致，田間鑒定排位第一的耐低溫型種質(zhì)資源白沙1016在利用相對發(fā)芽率指標鑒定的排序中為第四位，田間鑒定出的中花5為耐低溫型，且排在第二位，在利用相對發(fā)芽指標中并沒鑒定出中花5為耐低溫型，而是中間型，說明田間鑒定花生的耐低溫性受環(huán)境影響較大，有不確定的因素影響花生耐低溫表型鑒定。田間鑒定中間型有10個，而利用相對發(fā)芽率指標鑒定中間型為6個，田間鑒定的結(jié)果明顯過于寬松，利用相對發(fā)芽率數(shù)據(jù)確定花生耐低溫性更為嚴謹(表2)。

2.3 花生耐低溫表型鑒定方法在耐低溫數(shù)量性狀分析上的應(yīng)用

花生耐低溫性是數(shù)量性狀，僅僅對于耐低溫屬性描述不能滿足花生育種需要，因此構(gòu)建花生耐低溫表型鑒定方法時，需充分考慮其不同用途。下面用此方法鑒定RIL群體各家系，分析花生耐低溫性遺傳模型。

選取AIC值最小及與之較接近的模型F-1、G-1、G-3作為備選最適模型，AIC值分比為1763.14、1754.27、1795.87。針對耐低溫性的3個備選遺傳模型進行3個基本世代的適合性檢驗，選擇統(tǒng)計量達到顯著水平個數(shù)最少的遺傳模型作為最優(yōu)模型開展分析，最終確定模型G-1即3對主基因的多基因加性上位性遺傳模型為花生耐低溫性遺傳模型[7-14]。

一階參數(shù)與一階參數(shù)的關(guān)系通過最小二乘法進行估計；二階參數(shù)利用文獻[15]的方法估計σmg2，主基因遺傳率：hmg2(%)=σmg2/σp2，多基因遺傳率：hpg2(%)=σpg2/σp2。其中σp2為群體表型方差，σmg2為主基因遺傳方差，σpg2為多基因遺傳方差，σe2為多環(huán)境遺傳方差。各遺傳方差間的關(guān)系可表示為σp2=σmg2+σpg2+σe2。

表3可知，花生耐低溫遺傳表現(xiàn)為主基因與多基因加性效應(yīng)。主基因的遺傳率達到了91.21%，多基因的遺傳表達率為8.34%。通過花生耐低溫鑒定方法對徐花13×中花6重組自交系群體及親本耐低溫鑒定，利用相對發(fā)芽率數(shù)據(jù)，進行花生耐低溫性遺傳模型分析，得到花生耐低溫性遺傳模型為G-1，即3對主基因的多基因加性上位性遺傳模型為花生耐低溫性遺傳模型，主基因的遺傳率達到了91.21%，多基因的遺傳率為8.34%，說明花生耐低溫表型鑒定方法可以在花生耐低溫遺傳模型分析中應(yīng)用。

表2 根據(jù)EA、RGR值入選情況

注：EA，出苗能力；RGR：相對發(fā)芽率。

Note： EA: emergence ability; RGR: relative germination rate.

表3 遺傳參數(shù)估算

3 討 論

花生耐低溫性表型鑒定方法的構(gòu)建，主要考慮以下兩方面：① 試驗儀器對試驗材料的影響，本試驗采用電腦層析柜，此實驗儀器溫度變動幅度為±0.5℃，試驗環(huán)境對于本試驗的影響可以忽略，因此重復(fù)性好；② 參試材料種子發(fā)芽率情況，必須矯正低溫脅迫下的發(fā)芽率，因此在建立相對發(fā)芽率公式時，引進yi這個矯正參數(shù)。

花生耐低溫表型鑒定方法是對封海勝(1991)表型鑒定方法的改進，此方法相較少了6℃冷水浸泡脅迫處理，僅利用2℃脅迫，可以減少耐低溫表型鑒定的工作量。封海勝報道冷浸時間對發(fā)芽率的影響很明顯。2℃冷浸24h，在適溫下發(fā)芽72h，伏花生發(fā)芽種子中有10.6%剛剛“露白”，83.0%胚根伸長不到1cm，6.4%胚根伸長1～2cm；冷浸48h，發(fā)芽種子剛剛“露白”的增至64.7%，伸長不到1cm的占35.3%，1cm以上的一粒沒有。本方法在冷水浸泡的時間設(shè)置為48h，主要從兩方面考慮：第一，水在溫度較低的情況下，被種子吸收速度是下降的；第二，過長的冷水浸泡不僅僅溫度對花生種子有脅迫作用，同時水中含氧量低，長時間浸泡會造成種子缺氧，降低發(fā)芽率。

王晶珊等[3]利用田間鑒定，使用播種到出苗積溫多少，鑒定花生耐低溫性，此方法過于繁瑣，本文對從播種到出苗積溫多少改為出苗能力(EA)指標，與王晶珊田間鑒定方法意義相同。通過本文的田間驗證結(jié)果表明，田間鑒定環(huán)境影響大，同時花生耐低溫性的鑒定有向于寬松的方向指引。所以，本文構(gòu)建的花生耐低溫表型鑒定方法未采用田間鑒定法。

花生耐低溫表型鑒定方法，通過構(gòu)建相對發(fā)芽率公式RGRi=xi/yi×100%，及花生耐低溫性屬性分級標準，能夠鑒定花生耐低溫屬性；利用相對發(fā)芽率數(shù)據(jù)，能夠進行耐低溫數(shù)量性狀分析。

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ResearchofIdentificationMethodonLowTemperatureResistanceofPeanutGermplasmResourcesPhenotype

LIU Hai-long1,3, CHEN Xiao-shu1, YANG Fu-jun1, BAI Dong-mei2, SUN Xiao-ping1, Lü Yong-chao1, REN Xiao-ping3, JIANG Hui-fang3*, GAO Hua-yuan1*

(1.PeanutResearchInstitute,JilinAcademyofAgriculturalSciences,Gongzhuling136100,China; 2.EconomicPlantResearchInstitute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Fenyang032200,China; 3.KeyLab.ofBiologyandGeneticImprovementofOilCrops,MinistryofAgriculture,Wuhan430062,China)

This study was to construct an identification method which can simultaneously identify low temperature tolerance characteristic of peanut germplasm resources and analyze low temperature resistance quantitative traits. The formula adopted as RGRi (relative germination rate) =xi/yi×100%. 94 peanut germplasm resources were identified with RGB as: 6 germplasm resources, Shanhua8 (A1), Yuhua1 (A38), Kainong30 (A10), Baisha1016 (A37), You4 (A32) and Quanhua646 (A42), were low temperature resistance based on the RGB ≥85%. 20 germplasm resources selected from 94 were verified in field, which showed that the results were consistent with the result through the identification method. RIL and parents were identified with this method. Through analysis of low temperature resistant major gene and polygene genetic model, the results showed that the peanut low temperature resistance characteristic was accordant with model G-1, and the major gene heritability was 91.21%, polygene heritability was 8.34%. This method could be applied to analyze the low temperature resistance quantitative characteristic of peanut.

peanut; low temperature resistance; phenotype; relative germination rate

10.14001/j.issn.1002-4093.2017.03.004

S565.2024; S332.1

A

2017-03-31

農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室開放課題基金(2014001)；國家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-14)；吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程—花生創(chuàng)新團隊(CXGC2017TD013)；吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程杰出青年項目(CXGC2017JQ005)；中國農(nóng)業(yè)科技東北創(chuàng)新中心/博士后研究項目；農(nóng)業(yè)部948項目(2015-Z55)

劉海龍(1976-)，男，吉林公主嶺人，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究所副研究員，碩士，主要從事花生遺傳育種方面研究。

*通訊作者：姜慧芳，研究員，主要從事花生種質(zhì)資源研究。Tel: 027-86711550；E-mail: peanut@oilcrops.com 髙華援，研究員，主要從事花生遺傳育種研究。Tel: 0434-6283378；E-mail:ghy64143@163.com