何孝祥，印春華

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

何孝祥，印春華

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

本研究通過(guò)磷酸化殼聚糖(PC)包被季銨化殼聚糖(TMC)/質(zhì)粒(pDNA)納米復(fù)合物，制備PC/TMC/pDNA三元復(fù)合物(PTC)，用于提高體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染功效.PTC粒徑為100～200nm，Zeta電勢(shì)為-16～-34mV，可有效縮合pDNA，保護(hù)pDNA免遭核酶降解.PC降低PTC中pDNA結(jié)合力，增加體外釋放量.表面荷負(fù)電的PTC抗非特異性蛋白吸附能力強(qiáng)，經(jīng)小窩蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑入胞后逃避溶酶體降解，細(xì)胞核內(nèi)分布比例高.HEK293細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果顯示，PTC體外轉(zhuǎn)染效率是TMC/pDNA納米復(fù)合物(TC)的1.5～3.1倍；小鼠脛前肌注射給藥試驗(yàn)結(jié)果表明，PTC可顯著提高基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率.因此，合適質(zhì)量比的PTC有望作為功能性基因藥物的遞送載體，用于基因治療.

磷酸化殼聚糖； 季銨化殼聚糖； 基因轉(zhuǎn)染； 轉(zhuǎn)染效率； 轉(zhuǎn)染機(jī)制

基因治療是指將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)疾病治療[1].DNA等核酸大分子體內(nèi)穩(wěn)定性差，易被核酶降解，細(xì)胞攝取率低，體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率低，需借助合適的遞送載體以實(shí)現(xiàn)基因治療[2].基因遞送載體包括病毒載體和非病毒載體.病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但存在致癌性、免疫原性等安全問(wèn)題，且攜帶DNA能力有限，制備條件復(fù)雜，應(yīng)用受到嚴(yán)重限制[3].非病毒載體具有安全性，可攜帶大片段基因，且易于合成，但其轉(zhuǎn)染效率低于病毒載體，需進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率[4].陽(yáng)離子聚合物是一類(lèi)非病毒載體，已廣泛用作體內(nèi)外基因遞送載體[5]，主要包括聚乙烯亞胺(poly-ethyleneimine, PEI)[6]、殼聚糖及其衍生物[7]、聚賴(lài)氨酸(poly-L-lysine, PLL)[8]等.

季銨化殼聚糖(trimethyl chitosan, TMC)是一種陽(yáng)離子型殼聚糖衍生物，其在生理pH條件下溶解性好，可靜電縮合pDNA形成TMC/pDNA納米復(fù)合物(TC).TC細(xì)胞攝取量高，且可打開(kāi)細(xì)胞間緊密連接，促進(jìn)細(xì)胞旁路滲透[9]，可用于體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染.但TC中pDNA結(jié)合力過(guò)強(qiáng)，不利于胞內(nèi)釋放[10]；荷正電的TC易非特異性吸附血清蛋白等荷負(fù)電的生物大分子，穩(wěn)定性低，限制了其體內(nèi)外應(yīng)用[11-12].

研究表明，在陽(yáng)離子聚合物/pDNA復(fù)合物中加入含酸根的陰離子聚合物，可降低pDNA結(jié)合力，增加在血清蛋白中的穩(wěn)定性，提高基因遞送效率[12].磷酸化殼聚糖(PC)是含有磷酸基團(tuán)的殼聚糖衍生物，生物相容、生物可降解，已廣泛用于螯合金屬離子[13]、藥物遞送[14]和組織工程[15]等.但目前為止未見(jiàn)基于PC的基因遞送系統(tǒng)或?qū)C作為陰離子聚合物包被陽(yáng)離子聚合物/DNA復(fù)合物的相關(guān)報(bào)道.

本研究以分子量為100kDa、脫乙酰度為85%的殼聚糖分別經(jīng)季銨化和磷酸化作用，合成TMC和PC.TMC和綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pEGFP)按質(zhì)量比10∶1制備TC，加入不同質(zhì)量的PC制備不同質(zhì)量比的PTC，研究PC對(duì)TMC/pDNA復(fù)合物粒徑、Zeta電勢(shì)、抗核酶降解、pDNA結(jié)合與釋放、抗蛋白吸附的影響，考察PTC在HEK293細(xì)胞中的細(xì)胞攝取、攝取機(jī)制、核質(zhì)分布和體外轉(zhuǎn)染效率，小鼠后肢脛前肌注射給藥考察PTC體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率，為合理設(shè)計(jì)體內(nèi)外基因遞送系統(tǒng)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與動(dòng)物

殼聚糖(脫乙酰度： 85%，分子量100kDa)，購(gòu)自浙江金殼生物化學(xué)有限公司；碘甲烷(CH4I)購(gòu)自太倉(cāng)鑫鵠化工有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)購(gòu)自Sigma；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司；HEK293細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞株，購(gòu)自美國(guó)ATCC，以含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、100U/mL氨芐青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng))；昆明小鼠20只，雌性，體重為(20±2)g，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.2 方 法

1.2.1 TMC和PC的合成與表征

參照文獻(xiàn)[13,16]方法分別合成TMC和PC.稱(chēng)取適量TMC和PC，溶于氘水(D2O)，AVANCE DMX500型核磁共振儀分別測(cè)定TMC的1H NMR圖譜和PC的31P NMR圖譜.

1.2.2 TC和PTC的制備與表征

將2mg/mL TMC溶液與0.2mg/mL pEGFP溶液等體積混合，混勻30s，靜置30min，制得質(zhì)量比為10∶1的TC；TC中加入濃度為2，3和4mg/mL PC溶液，混勻30s，靜置30min，制備質(zhì)量比分別為10∶10∶1、15∶10∶1和20∶10∶1的PTC，分別記為PTC1、PTC2和PTC3.掃描電子顯微鏡(SEM)觀察TC和各質(zhì)量比PTC的形態(tài).Zetasizer Nano-ZS型電位及粒度測(cè)定儀測(cè)定TC和各質(zhì)量比PTC的粒徑和Zeta電勢(shì).取TC和各質(zhì)量比PTC，與溴酚藍(lán)混合，加至1%瓊脂糖凝膠上樣孔中，120V電泳30min，溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB)顯色，凝膠成像儀觀察pEGFP條帶并拍照.

1.2.3 核酶抑制

TC和各質(zhì)量比PTC中加入5μL DNase I(1kU/mL)，以加入DNase I溶液的裸pEGFP為陽(yáng)性對(duì)照，37℃水浴1h，加入5μL EDTA(0.2mol/L)，80℃水浴5min，終止反應(yīng).加入5μL肝素鈉(20mg/mL)，靜置2h，解離pEGFP，取20μL混合液，加至含EB的瓊脂糖凝膠上樣孔中，120mV電泳30min，凝膠成像儀觀察并拍照.

1.2.4 EB排阻

TC和各質(zhì)量比PTC中加入終濃度為1μg/mL的EB，混勻，靜置10min，酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(λex=518nm,λem=605nm).分別以EB溶液、裸pEGFP與EB的混合液熒光強(qiáng)度為0%、100%，計(jì)算各組相對(duì)熒光強(qiáng)度(η相對(duì)熒光).

1.2.5 體外釋放

參照文獻(xiàn)[17]方法，制備FITC標(biāo)記的pEGFP(FITC-pEGFP)，-20℃保存.以FITC-pEGFP分別制備TC和各質(zhì)量比PTC，13300r/min離心30min，棄上清，加入200μL PBS(0.2mol/L, pH 7.4)分散沉淀，37℃、100r/min振蕩，分別于2，4，6，8，10，12，24，36，48，60和72h取樣，13300r/min離心30min，量取50μL上清液，酶標(biāo)儀測(cè)定FITC-pEGFP含量(λex=488nm, λem=519nm)，計(jì)算pEGFP濃度.取樣后，釋放體系中補(bǔ)加50μL PBS(0.2mol/L, pH 7.4)，計(jì)算pEGFP累積釋放百分率(η累積釋放).

1.2.6 非特異性蛋白吸附

TC和各質(zhì)量比PTC中加入BSA溶液(2.5mg/mL)，37℃培育2h，14000r/min離心2h，沉淀以水洗滌3次，加入20μL SDS-PAGE上樣緩沖液(62.5mmol/L pH 6.8 Tris-HCl緩沖液，體積比7%的甘油，質(zhì)量濃度5%的2-巰基乙醇，2%的SDS和0.01%的溴酚藍(lán))，沸水浴5min，加入12% SDS-PAGE上樣孔中，25mA電泳2h，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色，凝膠成像儀觀察并拍照.

1.2.7 細(xì)胞攝取

HEK293細(xì)胞接種至24孔板，培養(yǎng)24h，分別加入以FITC-pEGFP制備的TC和各質(zhì)量比PTC，使pEGFP終濃度均為2μg/mL，以FITC-pEGFP為對(duì)照，37℃、5% CO2培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)基，加入1mL質(zhì)量濃度0.5%的SDS溶液(pH 8.0)裂解細(xì)胞，酶標(biāo)儀測(cè)定FITC-pEGFP含量(λex=488nm,λem=519nm)，Lowry法測(cè)定蛋白含量.細(xì)胞攝取量以每毫克蛋白對(duì)應(yīng)的pEGFP量(m(pEGFP))表示.

采用細(xì)胞攝取抑制試驗(yàn)研究復(fù)合物的細(xì)胞攝取機(jī)制.HEK293細(xì)胞37℃、5% CO2培養(yǎng)24h，加入染料木素(200μg/mL)和氯丙嗪(10μg/mL)，37℃培養(yǎng)30min，加入以FITC-pEGFP制備的TC和PTC2，使pEGFP終濃度為2μg/mL，37℃、5% CO2培養(yǎng)4h，測(cè)定細(xì)胞攝取量.以不加抑制劑、37℃培養(yǎng)4h的細(xì)胞攝取量為100%攝取率，計(jì)算各組相對(duì)細(xì)胞攝取率(η攝取).

1.2.8 核質(zhì)分布

HEK293細(xì)胞37℃、5% CO2培養(yǎng)24h.加入以FITC-pEGFP制備的TC和各質(zhì)量比PTC，使pEGFP終濃度為2μg/mL，37℃、5% CO2培養(yǎng)4h.吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，胰酶消化，加入1mL培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸，3000r/min離心5min，棄去上清液，沉淀以預(yù)冷PBS洗滌3次，加300μL TM-2緩沖液(pH 7.4，10mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L MgCl2, 0.5mmol/L PMSF)重懸，室溫靜置1min，冰浴5min，加入質(zhì)量濃度0.5%的Triton X-100，冰浴5min，800r/min離心10min，取上清測(cè)定FITC-pEGFP含量，即為細(xì)胞質(zhì)中pEGFP含量；沉淀中加入300μL SDS溶液(質(zhì)量濃度0.5%)，pH 8.0)裂解，測(cè)定FITC-pEGFP含量，即為細(xì)胞核中pEGFP含量.

1.2.9 體外轉(zhuǎn)染

HEK293細(xì)胞37℃、5% CO2培養(yǎng)24h.加入TC和各質(zhì)量比PTC，使pEGFP終濃度均為2μg/mL，以裸pEGFP為陰性對(duì)照，PEI/pEGFP復(fù)合物為陽(yáng)性對(duì)照，37℃、5% CO2分別培養(yǎng)48h.流式細(xì)胞儀(FACScan, BD)測(cè)定綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)陽(yáng)性細(xì)胞率，以此來(lái)表示各質(zhì)量比PTC的體外轉(zhuǎn)染效率(η體外轉(zhuǎn)染).

1.2.10 體內(nèi)轉(zhuǎn)染

昆明小鼠后肢脛前肌分別注射PBS(0.2mol/L, pH 7.4)、裸pEGFP, TC, PTC2和PEI/pEGFP復(fù)合物，注射體積0.15mL，注射劑量為每只小鼠10μg pEGFP，72h后頸椎脫臼處死小鼠，剝離后肢脛前肌，生理鹽水沖洗，加入1mL RIPA裂解液(50mmol/L Tris·HCl，150mmol/L NaCl，1% NP40，0.1% SDS)，勻漿，勻漿液12000r/min離心10min，避光靜置1h；取上清液測(cè)定熒光強(qiáng)度(λex=485nm，λem=538nm)和蛋白質(zhì)含量，綠色熒光蛋白表達(dá)量以每毫克蛋白對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度(I)表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 TMC和PC的制備與表征

殼聚糖經(jīng)季銨化和磷酸化作用，分別合成TMC和PC.圖1(a)為T(mén)MC的1H NMR圖譜，可見(jiàn)在3.27×10-6處出現(xiàn)TMC的三甲基氫峰，計(jì)算得季銨化度約為30%[18].TMC中季銨基團(tuán)可質(zhì)子化，荷較強(qiáng)正電，可靜電吸附荷負(fù)電的pDNA，形成納米復(fù)合物[9].圖1(b)為PC的31P NMR圖譜，可見(jiàn)在3.71×10-6處出現(xiàn)信號(hào)峰，表明磷酸基團(tuán)已共價(jià)連接至殼聚糖.PC中磷酸基團(tuán)可去質(zhì)子化，荷負(fù)電，可通過(guò)靜電作用包被陽(yáng)離子聚合物/pDNA納米復(fù)合物[19]，改善復(fù)合物理化性質(zhì)，進(jìn)一步提高基因轉(zhuǎn)染效率.

圖1 (a) TMC的1H NMR圖譜，(b) PC的31P NMR圖譜Fig.1 (a) 1H NMR spectrum of TMC, (b) 31P NMR spectrum of PC(a) 3.27×10-6處為T(mén)MC三甲基氫峰；(b) 3.71×10-6處出現(xiàn)信號(hào)峰

2.2 TC和PTC的制備與表征

圖2(a)為各復(fù)合物的SEM圖，可見(jiàn)TC和各質(zhì)量比PTC近似球形，粒徑為100～200nm，分散性良好.表1為T(mén)C和各質(zhì)量比PTC的粒徑和Zeta電勢(shì)，可見(jiàn)與TC相比，各質(zhì)量比PTC粒徑均增加，Zeta電勢(shì)由正變負(fù)，表明PC已包被至TC表面[20-21].PTC粒徑隨PC含量的增加而減小，這可能是由于PC與TMC靜電作用增強(qiáng)，使復(fù)合物結(jié)構(gòu)更加致密；PTC的Zeta電勢(shì)隨PC含量的增加而降低，可能是由于磷酸基團(tuán)數(shù)量增加，復(fù)合物表面負(fù)電荷增多.Zeta電勢(shì)的改變可能會(huì)影響復(fù)合物抗蛋白吸附能力、細(xì)胞攝取和攝取機(jī)制等，從而影響基因轉(zhuǎn)染效率.圖2(b)為T(mén)C和各質(zhì)量比PTC的瓊脂糖凝膠電泳圖，可見(jiàn)裸pEGFP向正極遷移，TC和各質(zhì)量比PTC中pEGFP均滯留在上樣孔中，這是由于復(fù)合物中pEGFP遷移率低，表明各復(fù)合物均可有效包載pEGFP.

圖2 (a) TC和各質(zhì)量比PTC的SEM圖，(b) 凝膠電泳圖，(c) 核酶抑制結(jié)果，(d) EB排阻結(jié)果(n=3)，(e) 體外累積釋放曲線(xiàn)(n=3)Fig.2 (a) SEM observation of complexes, (b) Electrophoresis of TCs and PTCs, (c) Protection ability against DNase, (d) EB exclusion assay(n=3), (e) Accumulative release profiles(n=3)(a) 比例尺為200nm；(b) 1. 裸pEGFP，2～5分別為T(mén)C、PTC1、PTC2、PTC3；(c) 1. 未處理的裸pEGFP，2～6分別為核酶處理后的裸pEGFP、TC、PTC1、PTC2、PTC3；(d) 采用Student’s t檢驗(yàn)，*Plt;0.05, **Plt;0.01，##表示與TC之間的差異，##Plt;0.01.

表1 TC和各質(zhì)量比PTC的粒徑和Zeta電勢(shì)Tab.1 Particle size and Zeta potential measurements of TC and PTCs

2.3 核酶抑制

圖2(c)為T(mén)C和各質(zhì)量比PTC與DNase I共培養(yǎng)1h后經(jīng)肝素鈉解離的瓊脂糖凝膠電泳圖，裸pEGFP組未見(jiàn)電泳條帶，表明裸pEGFP被DNase I完全降解；TC和各質(zhì)量比PTC組均可見(jiàn)清晰的電泳條帶，表明TC和各質(zhì)量比PTC能有效保護(hù)pEGFP免遭核酶降解.復(fù)合物保護(hù)pEGFP免遭核酶降解的能力可保持pEGFP結(jié)構(gòu)和功能的完整性，有助于實(shí)現(xiàn)有效的GFP表達(dá)，為研究復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率及其機(jī)制提供保障.

2.4 EB排阻

熒光探針EB可專(zhuān)一地以共價(jià)形式嵌入DNA平面堿基對(duì)或以靜電作用結(jié)合pDNA，產(chǎn)生能量傳遞，顯著增加熒光強(qiáng)度.復(fù)合物中pDNA結(jié)合力可競(jìng)爭(zhēng)性阻斷pDNA與EB的結(jié)合，降低熒光強(qiáng)度，且熒光強(qiáng)度減少量隨復(fù)合物中pDNA結(jié)合力的增強(qiáng)而增加[22].圖2(d)為T(mén)C和各質(zhì)量比PTC的EB排阻試驗(yàn)結(jié)果，可見(jiàn)TC、PTC1、PTC2、PTC3組的熒光強(qiáng)度分別為裸pEGFP組的20.4%、64.9%、78.8%、82.4%，表明各質(zhì)量比PTC中pEGFP結(jié)合力顯著低于TC；PTC2和PTC3組結(jié)合力無(wú)顯著性差異，且均顯著高于PTC1組.這可能是由于PC中磷酸基團(tuán)可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TMC中季銨基團(tuán)，使TMC與pEGFP靜電作用減弱，降低了復(fù)合物中pEGFP結(jié)合力[21]；PC含量增加可進(jìn)一步減弱pEGFP與TMC的靜電作用，使復(fù)合物中pEGFP結(jié)合力逐漸降低，但pEGFP與殼聚糖骨架之間仍存在氫鍵、疏水作用力等，故復(fù)合物中pEGFP結(jié)合力最終可保持恒定.

2.5 體外釋放

圖2(e)為T(mén)C和各質(zhì)量比PTC的累積釋放曲線(xiàn)，可見(jiàn)各質(zhì)量比PTC的體外釋放量顯著高于TC，其中PTC2和PTC3的體外釋放量顯著高于PTC1.這是由于加入PC降低了復(fù)合物中pEGFP結(jié)合力，有助于pEGFP從復(fù)合物中解離.

2.6 非特異性蛋白吸附

圖3(a)為T(mén)C和各質(zhì)量比PTC非特異性吸附蛋白的SDS-PAGE圖，可見(jiàn)TC組有明顯的BSA條帶，各質(zhì)量比PTC組均未見(jiàn)BSA條帶，表明PTC抗蛋白吸附能力高于TC.這是由于TC荷較強(qiáng)正電，易靜電吸附荷負(fù)電的BSA；荷負(fù)電的PTC與BSA靜電排斥.提高復(fù)合物抗非特異性蛋白吸附能力，有利于克服體內(nèi)環(huán)境中富含荷負(fù)電生物大分子的屏障，提高復(fù)合物的體內(nèi)穩(wěn)定性.

2.7 細(xì)胞攝取

圖3(b)為T(mén)C和各質(zhì)量比PTC的細(xì)胞攝取結(jié)果，可見(jiàn)各質(zhì)量比PTC細(xì)胞攝取量均低于TC，且隨PC含量的增加而降低，這是由于荷正電的TC與荷負(fù)電的細(xì)胞膜靜電吸引，負(fù)電荷的PTC與細(xì)胞膜靜電排斥[23]，PC含量增加，PTC表面負(fù)電荷增加，與細(xì)胞膜靜電排斥作用增強(qiáng).各質(zhì)量比PTC的細(xì)胞攝取量均高于裸pEGFP，這是由于pEGFP為親水性荷負(fù)電生物大分子，難以通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，與載體形成納米復(fù)合物后，可經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞作用入胞[24].

圖3(c)為氯丙嗪、染料木素對(duì)TC和PTC2細(xì)胞攝取的影響，可見(jiàn)氯丙嗪處理后TC細(xì)胞攝取率降低，PTC2細(xì)胞攝取率基本無(wú)變化，表明TC經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞，PTC2的細(xì)胞攝取與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑無(wú)關(guān)[25]；染料木素處理后TC的細(xì)胞攝取率基本無(wú)變化，PTC2的細(xì)胞攝取率下降，表明TC的細(xì)胞攝取與小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑無(wú)關(guān)，PTC2經(jīng)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞[25].細(xì)胞攝取機(jī)制決定復(fù)合物的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，影響復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率.

圖3 (a) TC和各質(zhì)量比PTC非特異性蛋白吸附圖，(b) 細(xì)胞攝取結(jié)果(n=3)，(c) 抑制劑對(duì)細(xì)胞攝取的影響(n=3)Fig.3 (a) BSA adsorption, (b) uptake level(n=3), (c) effects of chemical inhibitors on the endocytosis(n=3)(a) 1. 不同分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，2. BSA，3～6分別為吸附BSA后的TC、PTC1、PTC2、PTC3；(b) 每毫克蛋白中pEGFP攝取量.用Student’s t檢驗(yàn)，**Plt;0.01，##表示與裸pEGFP之間的差異，##Plt;0.01；(c) 用Student’s t檢驗(yàn)，**Plt;0.01.

2.8 核質(zhì)分布

pDNA需進(jìn)入細(xì)胞核方可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率與核內(nèi)pDNA分布比例相關(guān).圖4(a)為T(mén)C和各質(zhì)量比PTC中pEGFP的核質(zhì)分布，可見(jiàn)各質(zhì)量比PTC組pEGFP核內(nèi)分布比例(η核質(zhì)分布)顯著高于TC組，這可能是由于TC經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞后轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入溶酶體，易被溶酶體內(nèi)的酶降解[26]，PTC經(jīng)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞后可逃避溶酶體[27]，免遭溶酶體降解，且PTC體外釋放量顯著高于TC，pEGFP可通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核.

2.9 體外轉(zhuǎn)染

圖4(b)為T(mén)C和各質(zhì)量比PTC體外轉(zhuǎn)染效率(η體外轉(zhuǎn)染)，PTC組體外轉(zhuǎn)染效率是TC組的1.5～3.1倍，這由于TC中pEGFP結(jié)合力過(guò)強(qiáng)，胞內(nèi)釋放量過(guò)低，核內(nèi)分布比例低，不利于pEGFP轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；PTC中pEGFP結(jié)合力降低，胞內(nèi)釋放增加，核內(nèi)分布增加，有利于pEGFP轉(zhuǎn)錄和表達(dá).PTC2組體外轉(zhuǎn)染效率顯著高于PTC1和PTC3組，這是由于與PTC2相比，PTC1中pEGFP結(jié)合力強(qiáng)，胞內(nèi)釋放量低，核內(nèi)分布比例低；與PTC2相比，PTC3的結(jié)合力、體外釋放量及核內(nèi)分布比例無(wú)顯著性差異，但其細(xì)胞攝取量低，進(jìn)入胞內(nèi)的復(fù)合物濃度低.PEI/pEGFP復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率低于PTC2，這可能是由于PEI與pEGFP結(jié)合過(guò)于緊密，不利于胞內(nèi)釋放[21].

2.10體內(nèi)轉(zhuǎn)染

圖4(c)為各復(fù)合物組小鼠肌肉組織中GFP熒光強(qiáng)度，可見(jiàn)PTC2的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率最高，分別是TC和PEI/pEGFP復(fù)合物的7.1和1.8倍，這是由于PTC2可有效縮合pEGFP，保護(hù)pEGFP免遭體內(nèi)核酶降解，確保了進(jìn)入體內(nèi)的pEGFP結(jié)構(gòu)和功能的完整性；荷負(fù)電的PTC2抗非特異性蛋白吸附能力強(qiáng)，可在富含血清蛋白等生物大分子的肌肉組織細(xì)胞外基質(zhì)中保持穩(wěn)定；PTC2經(jīng)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞后可逃避溶酶體；PTC2的pEGFP結(jié)合力較弱，體外釋放量高，可在胞內(nèi)迅速釋放pEGFP，核內(nèi)分布比例高，有利于結(jié)合RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染效率提高.

圖4 (a) TC和各質(zhì)量比PTC的核質(zhì)分布,(b) 體外轉(zhuǎn)染效率(n=3),(c) 體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率(n=4)Fig.4 (a) Intracellular distribution of pEGFP, (b) Transfection efficiencies in HEK293 cells(n=3), (c) GFP expression in mouse muscles(n=4)(a) 用Student’s t檢驗(yàn)，**Plt;0.01，#表示與TC之間的差異，#Plt;0.05，##Plt;0.01；(b) 用Student’s t檢驗(yàn)，*Plt;0.05，**Plt;0.01，(c) I為每毫克蛋白熒光強(qiáng)度.用Student’s t檢驗(yàn)，*表示與PTC2之間的差異，**Plt;0.01

3 討 論

本研究設(shè)計(jì)并制備用于基因遞送的納米三元復(fù)合物PTC，通過(guò)加入不同質(zhì)量比的PC，考察PC含量對(duì)復(fù)合物理化性質(zhì)、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和轉(zhuǎn)染效率的影響.殼聚糖的分子量和脫乙酰度可影響復(fù)合物縮合DNA能力及其粒徑和Zeta電勢(shì)等[28]，研究表明，分子量為100kDa、脫乙酰度為85%的殼聚糖可有效縮合pEGFP，形成表面荷正電的納米復(fù)合物[29]，故采用此分子量和脫乙酰度的殼聚糖作為基因載體.結(jié)果表明，加入PC后復(fù)合物的粒徑略微增大，但仍在100～200nm，通過(guò)SEM觀察進(jìn)一步顯示PTC形態(tài)和分散性均無(wú)明顯改變.但加入PC后，復(fù)合物的Zeta電勢(shì)由正變負(fù)，表明PC包被至復(fù)合物表面，這可能會(huì)影響縮合pDNA和保護(hù)pDNA免遭核酶降解的能力[20].凝膠阻滯試驗(yàn)表明PTC可有效縮合pDNA，包載于復(fù)合物中的pDNA易克服體內(nèi)外屏障，隨復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá).核酶抑制試驗(yàn)表明PTC可保護(hù)pDNA免遭核酶降解，保持復(fù)合物中pDNA結(jié)構(gòu)和功能的完整性，有助于實(shí)現(xiàn)有效的基因表達(dá).

TC中pDNA結(jié)合力過(guò)強(qiáng)，胞內(nèi)釋放量低，易非特異性吸附血清蛋白等荷負(fù)電的生物大分子，其體內(nèi)外應(yīng)用受到限制[10-12].加入PC后，復(fù)合物中pDNA結(jié)合力下降，體外釋放量增加，有利于與RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá).表面荷負(fù)電的PTC抗非特異性蛋白吸附能力強(qiáng)，可克服體內(nèi)環(huán)境中富含荷負(fù)電生物大分子的屏障，提高復(fù)合物體內(nèi)穩(wěn)定性.但表面荷較強(qiáng)負(fù)電的PTC與細(xì)胞膜靜電排斥作用強(qiáng)，細(xì)胞攝取量低，可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率.進(jìn)一步研究可通過(guò)配體修飾靶向細(xì)胞表面受體，增加細(xì)胞攝取量.PTC經(jīng)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞，可逃避溶酶體[27]，免遭溶酶體內(nèi)酶的降解，核內(nèi)分布比例高，有利于基因表達(dá).體內(nèi)外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果表明，合適比例的PTC可顯著提高體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染效率.因此，PTC可用于體內(nèi)外功能性基因遞送，有望用于基因治療.

[1] VERMA I M, SOMIA N. Gene therapy-promises, problems and prospects [J].Nature, 1997,389(6648): 239-242.

[2] MAO S R, SUN W, KISSEL T. Chitosan-based formulations for delivery of DNA and siRNA [J].AdvDrugDeliverRev, 2010,62(1): 12-27.

[3] GINN S L, ALEXANDER I E, EDELSTEIN M L,etal. Gene therapy clinical trials worldwide to 2012 an update [J].JGeneMed, 2013,15(2): 65-77.

[4] GAO X, KIM K S, LIU D X. Nonviral gene delivery: What we know and what is next [J].AapsJ, 2007,9(1): E92-E104.

[5] PARK T G, JEONG J H, KIM S W. Current status of polymeric gene delivery systems [J].AdvDrugDeliverRev, 2006,58(4): 467-486.

[6] LAI W F.Invivonucleic acid delivery with PEI and its derivatives: Current status and perspectives [J].ExpertRevMedDevic, 2011,8(2): 173-185.

[7] RAFTERY R, O’BRIEN F J, CRYAN S A. Chitosan for gene delivery and orthopedic tissue engineering applications [J].Molecules, 2013,18(5): 5611-5647.

[8] MANNISTO M, VANDERKERKEN S, TONCHEVA V,etal. Structure-activity relationships of poly(L-lysines): Effects of pegylation and molecular shape on physicochemical and biological properties in gene delivery [J].JControlRelease, 2002,83(1): 169-182.

[9] MAO Z W, MA L, JIANG Y,etal. N,N,N-Trimethylchitosan chloride as a gene vector: Synthesis and application [J].MacromolBiosci, 2007,7(6): 855-863.

[10] KAWAMURA K, OISHI J, KANG J H,etal. Intracellular signal-responsive gene carrier for cell-specific gene expression [J].Biomacromolecules, 2005,6(2): 908-913.

[11] UCHIDA S, ITAKA K, CHEN Q X,etal. Combination of chondroitin sulfate and polyplex micelles from poly(ethylene glycol)-poly{N′-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl aspartamide} block copolymer for prolongedinvivoinvivogene transfection with reduced toxicity [J].JControlRelease, 2011,155(2): 296-302.

[12] ITO T, ABE K, YOSHIHARA C,etal. Efficientinvivogene expression by DNA/polycation/polyanion ternary complexses [J].MolTher, 2006,13: S72-S73.

[13] SAKAGUCHI T, HORIKOSHI T, NAKAJIMA A. Adsorption of uranium by chitin phosphate and chitosan phosphate [J].AgricBiolChem, 1981,45(10): 2191-2195.

[14] WIN P P, SHIN-YA Y, HONG K J,etal. Formulation and characterization of pH sensitive drug carrier based on phosphorylated chitosan(PCS) [J].CarbohydPolym, 2003,53(3): 305-310.

[15] VARMA H K, YOKOGAWA Y, ESPINOSA F F,etal. Porous calcium phosphate coating over phosphorylated chitosan film by a biomimetic method [J].Biomaterials, 1999,20(9): 879-884.

[16] KEAN T, ROTH S, THANOU M. Trimethylated chitosans as non-viral gene delivery vectors: Cytotoxicity and transfection efficiency [J].JControlRelease, 2005,103(3): 643-653.

[17] ISHII T, OKAHATA Y, SATO T. Facile preparation of a fluorescence-labeled plasmid [J].ChemLett, 2000,29(4): 386-387.

[18] THANOU M, FLOREA B I, GELDOF M,etal. Quaternized chitosan oligomers as novel gene delivery vectors in epithelial cell lines [J].Biomaterials, 2002,23: 153-9.

[19] WANG C F, LUO X, ZHAO Y F,etal. Influence of the polyanion on the physico-chemical properties and biological activities of polyanion/DNA/polycation ternary polyplexes [J].ActaBiomaterialia, 2012,8(8): 3014-3026.

[20] HAGIWARA K, NAKATA M, KOYAMA Y,etal. The effects of coating pDNA/chitosan complexes with chondroitin sulfate on physicochemical characteristics and cell transfection [J].Biomaterials, 2012,33(29): 7251-7260.

[21] PATHAK A, KUMAR P, CHUTTANI K,etal. Gene expression, biodistribution, and pharmacoscintigraphic evaluation of chondroitin sulfate-PEI nanoconstructs mediated tumor gene therapy [J].AcsNano, 2009,3(6): 1493-1505.

[22] REN Y, JIANG X A, PAN D,etal. Charge density and molecular weight of polyphosphoramidate gene carrier are key parameters influencing its dna compaction ability and transfection efficiency [J].Biomacromolecules, 2010,11(12): 3432-3439.

[23] ESMAEILI F, HEUKING S, JUNGINGER H E,etal. Progress in chitosan-based vaccine delivery systems [J].JDrugDelivSciTec, 2010,20(1): 53-61.

[24] GANTA S, DEVALAPALLY H, SHAHIWALA A,etal. A review of stimuli-responsive nanocarriers for drug and gene delivery [J].JControlRelease, 2008,126(3): 187-204.

[25] DOUGLAS K L, PICCIRILLO C A, TABRIZIAN M. Cell line-dependent internalization pathways and intracellular trafficking determine transfection efficiency of nanoparticle vectors [J].EurJPharmBiopharm, 2008,68(3): 676-687.

[26] KHALIL I A, KOGURE K, AKITA H,etal. Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery [J].PharmacolRev, 2006,58(1): 32-45.

[27] SAHAY G, ALAKHOVA D Y, KABANOV A V. Endocytosis of nanomedicines [J].JControlRelease, 2010,145(3): 182-195.

[28] HUANG M, FONG CW, KHOR E,etalTransfection efficiency of chitosan vectors: Effect of polymer molecular weight and degree of deacetylation [J].JControlRelease, 2005,106(3): 391-406.

[29] MAO S, SUN W, KISSEL T. Chitosan-based formulations for delivery of DNA and siRNA [J].AdvDrugDeliverRev2010,62: 12-27.

PhosphorylatedChitosan-TrimethylChitosanasGeneDeliveryVectorforImprovingTransfectionEfficiencyinvitroandinvivo

HEXiaoxiang,YINChunhua

(StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Phosphorylated chitosan(PC)/trimethyl chitosan(TMC)/pDNA ternary complexes were synthesized by coating PC onto trimethyl chitosan(TMC)/pDNA complexes(TC) to improve theirinvitroandinvivotransfection performances. Particle sizes of PTC were between 100nm and 200nm, Zeta potentials were between -16 and -34 mV. The coating of PC did not compromise the condensation capacity and protection effects of complexes, while binding strength toward pDNA was reduced andinvitrorelease amount was increased. The negative PTC maintained high stability in the presence of bovine serum albumin(BSA). As compared to TC, PTC internalized into cellsviacaveolae-mediated pathway could enhance pDNA nuclear accumulation for gene expression.Invitrotransfection efficiency of PTCs was 1.5—3.1 times higher than that of TC in HEK293 cells. Moreover, PTC with moderate PC content mediated higher protein expression in mouse tibialis muscle. These results suggested that PTCs could be an effective gene delivery system for gene therapy.

phosphorylated chitosan; trimethyl chitosan; gene transfer; transfection efficiency; transfection mechanism

0427-7104(2017)04-0472-08

2016-10-26

何孝祥(1990—)，男，碩士研究生;印春華，男，教授，通信聯(lián)系人，E-mail: chyin@fudan.edu.cn.

Q599

A