殼聚糖抗氧化效果的研究

張鳳洪 王立紅 李源 董惠峰/鼎正動(dòng)物藥業(yè)（天津）有限公司

黃艷興/天津市薊州區(qū)牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心

殼聚糖抗氧化效果的研究

高晶晶/天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院

張鳳洪 王立紅 李源 董惠峰/鼎正動(dòng)物藥業(yè)（天津）有限公司

黃艷興/天津市薊州區(qū)牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心

殼聚糖（聚β(1，4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖）是甲殼素N-脫乙酰基的產(chǎn)物，化學(xué)名稱是，廣泛存在于蝦蟹、昆蟲的甲殼中，研究顯示殼聚糖對(duì)機(jī)體具有清除自由基、抵抗過氧化損傷等作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界范圍內(nèi)加工蝦蟹所產(chǎn)生的廢棄物——蝦蟹殼，每年可達(dá)1.54×108t，這些廢棄物給環(huán)境帶來了嚴(yán)重的污染。從環(huán)境保護(hù)和廢物利用的角度出發(fā)，試驗(yàn)前期從廢棄的蝦蟹殼內(nèi)采用酸浸一堿解法和濃堿水解法提取加工得到甲殼素衍生物——?dú)ぞ厶?。本?shí)驗(yàn)通過測(cè)定殼聚糖提取物對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基的清除作用及金屬螯和能力，對(duì)蝦蟹殼提取的殼聚糖抗氧化效果進(jìn)行研究，旨在為廢棄蝦蟹殼殼聚糖的回收利用相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

一、試驗(yàn)材料與方法

（一）試驗(yàn)材料

從蝦蟹殼內(nèi)提取分離的殼聚糖；VC，醫(yī)藥純；鄰二氮菲，硫酸亞鐵，鹽酸，三羥甲基氨基甲烷（Tris），鄰苯三酚，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，鐵氰化鉀，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）等為分析純。

（二）試驗(yàn)方法

1.殼聚糖對(duì)自由基的清除作用

（1） 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)殼聚糖對(duì)羥基自由基的清除作用。取1 ml 0.75 mol/L鄰二氮菲溶液加入2 ml PBS溶液，分別與1 ml不同濃度的樣品液充分混勻，加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 ml與0.01% H2O21 ml，于 37℃下溫育 60 min，于 536 nm處測(cè)其吸光度As。同時(shí)以去離子水作為空白對(duì)照組，檢測(cè)其Ab，不加樣品加H2O2測(cè)Ap。以Vc為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，按下式計(jì)算羥自由基清除率：

清除率(D%)=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100

（2）采用鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)殼聚糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。取2.4 ml pH 8.2 Tris-HCl緩沖液，加入不同濃度的樣品液0.1 ml，混勻后加入8 mol/l的鄰苯三酚溶液0.3 ml，混勻，4 min后加入1滴濃HCl溶液中止反應(yīng)，測(cè)得A325值，以去離子水為對(duì)照測(cè)A0，以Vc為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，按下式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率：

清除率(D%)=(A0-A325)/A0×100

（3） 清除DPPH自由基能力的測(cè)定。殼聚糖清除DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基能力的測(cè)定。配制5種不同質(zhì)量濃度的樣品。取2 ml樣品加入2 ml，含0.2 mmol/l DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）的無(wú)水乙醇溶液，混勻，常溫反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度（Ai）。將樣品換為無(wú)水乙醇，測(cè)定吸光度（Ao），同時(shí)，測(cè)定2 ml樣品液和2 ml無(wú)水乙醇混合液的吸光度（Aj），計(jì)算清除率I。

以抗壞血酸Vc做陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.金屬鰲合能力的測(cè)定

參考Decker 等的方法測(cè)定金屬鰲合能力。樣品管中加入不同濃度殼聚糖溶液1 ml，再加入3.7 ml蒸餾水、0.1 ml 2 mmol/L 的FeCl2溶液混合均勻，最后加入0.2 ml 5 mmol/L的菲洛嗪?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，空白管用蒸餾水代替樣品液，標(biāo)準(zhǔn)管用蒸餾水代替FeCl2溶液，以上三組在室溫放置10 min后，在562 nm 測(cè)定吸光值，用EDTA作為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)三組平行，用以下公式計(jì)算金屬螯合能力（%）

金屬螯合能力（%）=[A空白-（A樣品-A標(biāo)準(zhǔn)）]/A空白×100

二、結(jié)果與分析

（一）殼聚糖對(duì)自由基的清除作用

（1）采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)殼聚糖對(duì)羥基自由基的清除作用。以Vc為參照，研究了殼聚糖對(duì)羥基自由基的清除作用，從圖1看出Vc和泥殼聚糖均隨著濃度的升高，清除羥基自由基的能力增強(qiáng)，并且在一定的濃度范圍內(nèi)，抑制率與濃度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，殼聚糖對(duì)羥基自由基的清除作用稍弱于Vc的清除作用。

圖1 Vc和殼聚糖對(duì)羥自由基的清除作用

（2）采用鄰苯三酚自氧化法檢測(cè)殼聚糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。殼聚糖對(duì)超氧陰離子自由基結(jié)果見圖2，隨著濃度的增加，Vc和殼聚糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度增加到2.0 mg/ml以上時(shí)對(duì)自由基的清除作用減慢，但總體說來Vc對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用強(qiáng)于殼聚糖。

圖2 Vc和殼聚糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

（3）清除DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基能力的測(cè)定。殼聚糖對(duì)DPPH自由基的清除作用在質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/ml的范圍內(nèi)，殼聚糖清除DPPH自由基的能力隨質(zhì)量濃度增大而增大，且呈良好的線性正相關(guān)，Vc的線性方程：y=108.24x+48.516 R2=0.9255， 殼 聚 糖 的 線 性 方 程 ：y=86.78x+38.85 R2=0.9165。以清除率為50% 時(shí)樣品的質(zhì)量濃度值作為評(píng)價(jià)對(duì)自由基清除能力的指標(biāo)，即半數(shù)清除質(zhì)量濃度。由線性相關(guān)方程可得，Vc和殼聚糖清除DPPH 自由基的半數(shù)清除質(zhì)量濃度值分別為0.014 mg/ml和0.128 mg/ml。

圖3 殼聚糖對(duì)DPPH自由基的清除率

（二）金屬螯和能力的測(cè)定

殼聚糖對(duì)金屬螯合能力的影響結(jié)果見圖5，從圖中可以看出，EDTA表現(xiàn)出很強(qiáng)的螯合活性，在濃度為0.4 mg/ml時(shí)達(dá)到最大，為99.61%，隨后略有下降。殼聚糖對(duì)金屬的螯合能力總體來說低于EDTA，在0.2～1 mg/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，呈上升趨勢(shì)。

圖4 殼聚糖對(duì)金屬螯合能力的影響

三、討論

本研究對(duì)蝦蟹殼提取的殼聚糖抗氧化效果進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，殼聚糖提取物對(duì)不同自由基的清除能力不同，殼聚糖濃度為0.5 mg/ml時(shí)，DPPH自由基清除率為80%左右，超氧陰離子自由基清除率為20%左右。并且低濃度殼聚糖提取物對(duì)自由基的清除能力較低，殼聚糖濃度達(dá)2.5 mg/ml時(shí)超氧陰離子自由基清除率僅為約40%，羥自由基清除率僅為約30%。周元敬等人表示殼聚糖對(duì)自由基的清除效率隨著殼聚糖濃度的增大而升高，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相同。Je等人經(jīng)研究表示，5～1 kDa的殼聚糖在3 mg/ml時(shí)可清除95%以上的DPPH自由基，且自由基的清除率隨著殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量的增大而降低，因此從廢棄蝦蟹殼內(nèi)提取出的殼聚糖分子量尚待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中，從廢棄蝦蟹殼內(nèi)提取出的殼聚糖濃度為2.5 mg/ml時(shí)金屬螯合率即可達(dá)到80%左右，證明其具有較高的金屬螯合能力，這與殼聚糖的結(jié)構(gòu)有關(guān)。殼聚糖是一種天然高分子，在其分子結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元中存在氨基氮、羥基氧及N_乙酰氨基，由于這些基團(tuán)的存在，使殼聚糖通過氫鍵或鹽鍵形成具有類似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的籠形分子，從而對(duì)金屬離子有著穩(wěn)定的配位作用，因而能同過渡金屬離子形成配鍵而具有極強(qiáng)的螯合能力。

（略）