曹建文，王宏偉，張雪飛，谷 振，周變?nèi)A

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471000)

益生菌對柔嫩艾美耳球蟲感染雞保護效果研究

曹建文，王宏偉*，張雪飛，谷 振，周變?nèi)A

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471000)

接種柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)孢子化卵囊和益生菌，以血便記分、存活率、體增重和抗球蟲指數(shù)為指標(biāo)，探討益生菌的抗球蟲活性。在接種第7天后檢測結(jié)果顯示，益生菌抗球蟲指數(shù)為137，能降低球蟲感染雞的血便記分，減輕雞盲腸組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)的損傷，提高球蟲感染雞體增重和存活率，提示益生菌可以輔助應(yīng)用于臨床球蟲病的防治。

益生菌；柔嫩艾美耳球蟲；雞；抗球蟲指數(shù)；盲腸

雞球蟲病是由艾美耳屬球蟲引起的一種腸道寄生原蟲病[1]。本病呈全球性分布，在養(yǎng)禽業(yè)中普遍存在且死亡率高，嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[2]。雞球蟲的生活史包括體外和體內(nèi)兩個時期，三個生殖階段。孢子生殖階段一般在體外有充足的氧氣和水分的環(huán)境下進行，而裂殖生殖階段和配子生殖階段在體內(nèi)進行。其中裂殖生殖階段球蟲可對宿主腸道造成嚴(yán)重的病理學(xué)損傷[1,3-4]。雞柔嫩艾美耳球蟲病是因雞感染柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)所致的一種以盲腸病變?yōu)橹鞯脑x病。目前雞柔嫩艾美耳球蟲病主要依靠藥物預(yù)防，由于球蟲耐藥性的產(chǎn)生，迫切需要尋求新的抗球蟲方法[1,3-4]。益生菌是一類定植于人和動物腸道內(nèi)，具有改善宿主腸道微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性微生物[5]。大量的研究證實，益生菌具有維持動物消化道黏膜菌群平衡，抵御病原微生物入侵，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)及營養(yǎng)成分，改善腸道黏膜免疫功能的作用[5-7]。在動物生產(chǎn)中添加益生菌，可有效提高動物的生長性能，為動物機體提供營養(yǎng)，提高飼料消耗率，增強動物免疫能力，預(yù)防及治療疾病[7-9]。本研究通過建立雞E.tenella感染模型，通過口服接種益生菌，探究了益生菌對E.tenella感染雞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用雞 200只1日齡海蘭褐商品代蛋公雛購自洛陽公華禽業(yè)有限公司。試驗在河南科技大學(xué)試驗?zāi)翀鲞M行。試驗期間執(zhí)行嚴(yán)格的消毒制度，確保試驗在無球蟲環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.2 試驗用球蟲卵囊和益生菌E.tenella孢子化卵囊，由河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)實驗室保存。益生菌由河南科技大學(xué)環(huán)境與畜產(chǎn)品安全河南省高校重點開放實驗室保存。枯草芽胞桿菌，每克2 000億菌數(shù)，有效物質(zhì)含量99.0%；鼠李糖乳桿菌，每克1 000億菌數(shù)，有效物質(zhì)含量98.0%。酵母菌，每克200億菌數(shù)，有效物質(zhì)含量高達99.0%。試驗前進行益生菌的活化，并將其稀釋到10×使用濃度，備用。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 在實驗雞飼養(yǎng)至14日齡時，選取80只體重均勻的雞(100 g±3.76 g)，按體重隨機分為4組，每組20只。分別為對照組、益生菌組、感染組、感染加益生菌組。

1.2.2 球蟲感染和處理方法 分組完成后，各組進行如下處理(表1)。試驗期間注意觀察各組雞的精神狀況、血便排出及死亡情況，并做相關(guān)記錄，試驗期為7 d。

1.2.3 抗球蟲效果評價 在試驗處理第7天時，各組雞稱重后，進行撲殺，采集盲腸組織，進行盲腸病變記分，采集盲腸內(nèi)容物進行卵囊OPG的測定，衡量抗球蟲ACI值。同時采用40 mL/L的多聚甲醛對盲腸組織進行固定，HE染色觀察盲腸結(jié)構(gòu)的變化。

相對增重率 = 益生菌組或者感染組增重/對照組增重×100%

增重=試驗平均末重—試驗平均初重

盲腸病變值按Johnson和Reid的0～4分標(biāo)準(zhǔn)對盲腸病變記分[10]，盲腸病變值 = 盲腸病變平均記分×10。

糞便記分按Morehouse和Baron的標(biāo)準(zhǔn)進行[11]。

存活率=1-死亡率(僅為球蟲感染導(dǎo)致的死亡)。

死亡率=試驗開始雞的數(shù)量—試驗?zāi)┢陔u的數(shù)量/試驗開始雞的數(shù)量×100%

卵囊值的測定，取各組盲腸內(nèi)容物，充分混勻、稱重，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ嫈?shù)每克糞便的卵囊數(shù)(OPG)，按表2換算成卵囊值。

表1 試驗分組及處理

表2 OPG值與卵囊值的換算

抗球蟲指數(shù)ACI值 =(相對增重+存活率)—(病變值+卵囊值)，ACI在120以下為無效；在120～160為低效；在160～180為中效；在180以上為高效。

1.2.4 盲腸組織切片的觀察 采集雞盲腸組織，4%多聚甲醛固定后，制備組織切片，然后進行蘇木精和伊紅染色，顯微鏡下進行形態(tài)學(xué)的觀察。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

感染組病雞，初期精神不振，閉目呆立，羽毛蓬松，雙翅下垂，食欲不振，感染第4天可見血便排出。感染加益生菌組相對感染組有所好轉(zhuǎn)，雞喜采食，血便得到控制。

2.2 益生菌對柔E.tenella感染雞血便記分的影響

由表3可知，感染組從第4天開始排出血便，試驗期平均血便記分為2.5。同時也出現(xiàn)死亡情況。感染加益生菌組排血便情況有所減輕，平均血便記分為1.25。

2.3 益生菌對E.tenella感染雞存活率的影響

如表4所示，感染組從第4天開始，出現(xiàn)雞只死亡情況。感染組和感染加益生菌組雞存活率分別為65%和85%，益生菌的添加顯著降低了球蟲感染雞的死亡率。

2.4 益生菌對E.tenella感染雞體重的影響

由表5所知，感染E.tenella后雞生長發(fā)育明顯受到了抑制，平均增重為67.7 g，相對增重率為67.7%，與感染組相比，益生菌的添加提高了雞的平均增重。

2.5 益生菌抗E.tenella感染效果研究

由表6可知，對照組，益生菌組，感染組和感染加益生菌組抗球蟲指數(shù)依次為200、203.9、55.8和137.0，說明益生菌的抗球蟲感染效果為低效。

表3 不同處理組血便記分

表4 不同處理組雞死亡情況

表5 各組雞體重和體增重

表6 抗球蟲指數(shù)

2.6 益生菌對E.tenella感染雞盲腸組織結(jié)構(gòu)的影響

對照組(圖1A1，A2和A3)和益生菌(圖1B1、B2和B3)處理組雞盲腸結(jié)構(gòu)正常，腸腺和黏膜結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛排列井然有序，未見明顯的異常變化。E.tenella感染組雞盲腸結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，腸固有層出血，腸黏膜脫落，腸腔內(nèi)充滿脫落的腸黏膜及血凝塊，隨處可見散在的球蟲卵囊(圖1C1，C2和C3)。感染加益生菌組雞盲腸結(jié)構(gòu)基本完整，腸黏膜和腸腺結(jié)構(gòu)清晰可見，腸黏膜下層有明顯的出血斑，血塊內(nèi)有散在的球蟲卵囊(圖1D1，D2和D3)。

3 討論

雞球蟲病是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的疾病之一，常呈暴發(fā)性流行[1-3]。目前該病已被美國農(nóng)業(yè)部列為對禽類危害最嚴(yán)重的五大疾病之一。雞柔嫩艾美耳球蟲病，是因E.tenella寄生于雞盲腸引起的一種原蟲病[4]。本病分布很廣，主要對2周齡～9周齡的雛雞造成危害，發(fā)病率高達50%～70%，病死率為20%～30%，嚴(yán)重時高達80%以上[12]。成年雞感染E.tenella后病死率較低，但會造成體重和產(chǎn)蛋率下降等現(xiàn)象[2]。本研究通過口服接種E.tenella孢子化卵囊復(fù)制球蟲感染模型，感染組在接種后第4天時雞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡率為35%。感染加益生菌組與感染組相比降低了雞的死亡率，說明益生菌的添加顯著提高了球蟲感染雞的存活率。

腸道是機體接觸各類病原微生物、食物毒素和藥物等有害物質(zhì)的直接部位，是病原入侵的重要途徑。完整的腸道屏障是防止腸道內(nèi)有害物質(zhì)和病原體進入機體，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要屏障[6,13]。當(dāng)腸道的正常結(jié)構(gòu)受損時，腸道中的病原微生物和內(nèi)毒素便可突破腸黏膜屏障，進入血液引起消化系統(tǒng)甚至全身性疾病。大量研究表明，臨床上許多疾病的發(fā)生，發(fā)展與轉(zhuǎn)歸都與腸道屏障損傷有關(guān)[14-15]。本研究中，E.tenella感染組雞盲腸結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，腸壁固有層呈彌散性出血，腸腺組織模糊不清，腸黏膜脫落，腸腔內(nèi)充滿脫落的腸黏膜及血凝塊，且在腸腔內(nèi)隨處可見散在的球蟲卵囊。感染加益生菌組雞盲腸黏膜和腸腺結(jié)構(gòu)清晰可見，腸黏膜下層有局限性出血，與感染組相比，雞盲腸結(jié)構(gòu)趨于完整。提示添加益生菌可改善E.tenella造成的病理形態(tài)學(xué)損傷，改善雞的腸道微環(huán)境。

A1、A2和A3為對照組；B1、B2和B3為益生菌組；C1、C2和C3為感染組；D1、D2和D3為感染加益生菌組。

A1，A2 and A3 are from the control group,B1，B2 and B3 are from the probiotics group，C1，C2 and C3 are from the infected group,and D1，D2 and D3 are from the infected and probiotics group.

圖1雞盲腸組織結(jié)構(gòu)的變化

Fig.1 Histooathological changes of cecal tissues in chickens

E.tenella在雞盲腸中繁殖，引起雞盲腸結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致腸消化吸收功能紊亂和體液流失，必然增加腸道內(nèi)條件性致病菌的發(fā)病率[16]。王琪等報道E.tenella感染可以顯著的增加雞腸炎沙門菌感染的機率，而且混合感染對腸道菌群造成的影響要比單獨感染更為明顯[16-17]。本研究中添加益生菌雖然只顯示出低效抗球蟲作用，但是改善了E.tenella所致的盲腸病理形態(tài)學(xué)變化，顯著提高了感染雞的存活率和平均增重，這可能是因為添加的益生菌在雞腸道內(nèi)產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)及營養(yǎng)成分維持了雞消化道黏膜菌群的平衡，改善了腸道黏膜免疫功能，進而發(fā)揮了抗球蟲作用。這一研究為益生菌抗球蟲研究提供新的思路。

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ProtectiveEffectofProbioticsagainstEimeriatenellaInfectioninChickens

CAO Jian-wen,WANG Hong-wei,ZHANG Xue-fei,GU Zhen,ZHOU Bian-hua

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan,471000,China)

To study the potential effect of probiotics on chickens infected withEimeriatenella,chickens were vaccinated withE.tenellasporulated oocysts and probiotics.The anticoccidial activity of probiotics was evaluated by determining the anticoccidial index,bloody diarrhea score,survival rate and body weight gain in chickens.On the 7thday postinfection,chickens were slaughtered after weighing.The cecal tissues were collected for the histopathological observation by using HE staining.The results showed that anticoccidial index of probiotics was 137,belonging to low efficient anticoccidial agent.But probiotics can decrease bloody diarrhea score in coccidial infected chickens,reduce the histopathological lesions of ceca in chickens,improve chicken body weight gain and survival rate.It can be recommended for the prevention and treatment of clinical coccidiosis.

probiotics;E.tenella; chicken; anticoccidial index; cecum

2017-03-24

國家自然科學(xué)基金項目(31101855)；河南科技大學(xué)SRTP項目(2011046)

曹建文(1992-)，男，山西朔州人，碩士研究生，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)的研究。*

S852.723

A

1007-5038(2017)11-0037-05