不同灸溫對(duì)高脂血癥大鼠血脂及肝脂酶活性的影響

張會(huì)芳，孫舟紅*，耿婷婷，徐旺芳

（1.常州市第一人民醫(yī)院針灸科，江蘇 常州 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210029）

不同灸溫對(duì)高脂血癥大鼠血脂及肝脂酶活性的影響

張會(huì)芳1，孫舟紅1*，耿婷婷2，徐旺芳2

（1.常州市第一人民醫(yī)院針灸科，江蘇 常州 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210029）

目的 觀察艾灸溫度對(duì)高脂血癥大鼠模型血脂四項(xiàng)及肝脂酶活性的影響，探討艾灸不同調(diào)脂途徑。方法 采用灌胃造模方法制備高脂血癥模型。將40只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組，分別為正常組、模型組、38℃組、43℃組，干預(yù)四周后，眼眶取血，測(cè)定血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白含量及肝脂酶活性。結(jié)果 與模型組比較，43℃組可明顯提高HL的活性，差異具有非常顯著性意義（P＜0.05），38℃組數(shù)值略有提高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與38℃組比較，43℃組可明顯提高HL的活性，差異具有非常顯著性意義（P＜0.05），說明HL的活性受溫度的影響，適宜的溫度可提高其活性；與模型組比較，43℃組及38℃組TC、TG、LDL-C明顯降低，差異具有顯著性意義（P＜0.05）；與38℃組比較，43℃組降低TC、TG、LDL-C明顯，差異具有顯著性意義（P＜0.05），說明46℃組降脂療效優(yōu)于38℃組，療效與溫度有關(guān)，適宜的溫度是取效的關(guān)鍵。HDL-C模型組高于正常組，與大鼠自身調(diào)制機(jī)制有關(guān)，兩組溫度對(duì)其影響區(qū)別不大，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 不同灸溫對(duì)血脂及HL影響不同，HL途徑是TRPV1調(diào)節(jié)血脂途徑之一。

高脂血癥；灌胃造模；高密度脂蛋白

高脂血癥是中老年人常見的病癥，其主要危害是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，從而引起眾多相關(guān)疾病，嚴(yán)重危害人類的健康。臨床研究表明，灸法治療高脂血癥療效可靠。以“溫”促“通”是灸法的本質(zhì)與靈魂[1]，而適宜的灸溫是灸效產(chǎn)生的重要條件，大于43℃的艾灸刺激能產(chǎn)生有效調(diào)脂通脈的效應(yīng)[2]。關(guān)于灸法調(diào)脂途徑的研究，目前鮮見報(bào)道，與TRPV1相關(guān)性研究，尚無(wú)報(bào)道。肝脂酶（Hepatic lipase，HL）是多種脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶，在脂質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要作用，其活性降低，可引起高脂血癥，本課題根據(jù)TRPV1的激活條件，設(shè)計(jì)38℃和43℃兩個(gè)溫度，通過觀察不同艾灸溫度對(duì)高脂血癥大鼠血脂及HL的影響，證實(shí)TRPV1通過介導(dǎo)HL途徑調(diào)節(jié)血脂，進(jìn)一步明確灸法調(diào)脂的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心（西普爾-必凱）提供健康成年雄性SD大鼠（許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，清潔級(jí)），體重（180±20）g。大鼠購(gòu)回后，將大鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20℃～25℃，相對(duì)濕度60%左右的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

（2）主要試劑及藥品：艾條為動(dòng)物用艾條，生產(chǎn)公司為南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司，

直徑7 mm，動(dòng)物專用清艾條。豬油（自制）；丙基硫氧嘧啶片生產(chǎn)廠家上海朝暉藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1506N17；Bile salts生產(chǎn)廠家sigma-alorich pcode公司，pcode-101691716， lot-BCBQ3263V，貨號(hào)：48305-50G-F；1，2丙二醇由生產(chǎn)廠家成都市科龍化工試劑廠提供，批號(hào)：20150712；吐溫80生產(chǎn)廠家為成都市克隆化工試劑廠，批號(hào)為2014112601；膽固醇生產(chǎn)廠家為成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)為2014071401。

（3）試劑和儀器：血脂四項(xiàng)。HL酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)于上海聯(lián)碩生物科技有限公司上海聯(lián)碩生物科技有限公司。儀器SpectraMax M2酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Devices Corporation（MDC）公司產(chǎn)品。

1.2 方法

（1）脂肪乳劑配置方法

參照劉明[3]及倪鴻昌[4]的高脂模型制作方法，超市購(gòu)買豬油，自行煉油去渣，冰箱8℃保存待用，取100 g豬油放于500 mL燒杯中，用電磁爐加熱成液態(tài)，先后分別加入5g丙基硫氧嘧啶和100 mL吐溫80，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，同時(shí)準(zhǔn)備另一個(gè)500ml燒杯，先后分別加入蒸餾水150 mL及1，2丙二醇100 mL，將其加熱至60攝氏度，后再加入10 gBile salts，充分?jǐn)嚢韬?，將此燒杯的溶液緩慢倒入第一個(gè)燒杯中，邊倒邊攪拌，防止因熱而溢出燒杯外，之后加蒸餾水至500 mL，用玻璃棒充分?jǐn)噭蚝?，冷卻至37攝氏度后灌胃。本方法制成的脂肪乳劑含1%丙基硫氧嘧啶、20%豬油、10%膽固醇、2%膽鹽。

（2）動(dòng)物分組與模型復(fù)制

分組：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱量各大鼠體重后，根據(jù)體重隨機(jī)分為正常組、模型組、43℃組、38℃組，每組10只。正常組大鼠予生理鹽水10 ml/kg灌胃，每日1次，其它3組予脂肪乳劑10 ml/kg灌胃，每日1次。4周后，用毛細(xì)玻璃管眼眶后靜脈采血、離心取血清后檢測(cè)總膽固醇和甘油三酯，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，模型組高于正常組，且差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明模型復(fù)制成功，開始干預(yù)治療，同時(shí)除正常組外，模型組、兩個(gè)不同灸溫的艾灸組繼續(xù)用高脂乳劑灌胃，至取材結(jié)束。

（3）干預(yù)方法

用大鼠固定板將大鼠仰臥位固定，用剪刀將大鼠足三里及神闕穴位區(qū)0.5 cm×0.5 cm鼠毛剪除，暴露出局部皮膚。43℃組：艾條保持紅火狀態(tài)（每隔10 s彈灰1次）下距離皮膚（10±2）mm；38℃組：艾條保持紅火狀態(tài)（每隔10 s彈灰1次）下距離皮膚（35±5）mm；正常組及模型組：不作任何治療，每日陪同抓取、固定。溫度控制：通過掌控彈灰的速度和頻率掌控紅火狀態(tài)，通過掌控紅火狀態(tài)下艾條距離皮膚的距離來(lái)控制溫度，同時(shí)測(cè)溫儀來(lái)精確監(jiān)控溫度變化。每日干預(yù)1次，共干預(yù)4周。

（4）取材及處死

四組大鼠干預(yù)四個(gè)星期之后，開始取材，取材前一天晚上8點(diǎn)禁食不禁水，第二天早上8點(diǎn)開始采血，采血前用剪刀剪去大鼠要采血眼睛同側(cè)的胡須，避免血液污染發(fā)生溶血，之后用中性玻璃毛細(xì)管眼眶靜脈叢采血法取血，即用左手緊捏大鼠頭頸部皮膚，將大鼠頭部固定，使大鼠眼球暴露充血，右手持長(zhǎng)約4 cm、內(nèi)徑0.9 mm，壁厚0.15 mm的毛細(xì)玻璃管傾斜45度角，快速旋轉(zhuǎn)插進(jìn)眼內(nèi)角，如無(wú)出血，可快速旋轉(zhuǎn)毛細(xì)血管，調(diào)整角度及方向，用規(guī)格為5 mL的采血管采血，采血后放置采血架上靜置待離心，大鼠在用無(wú)菌脫脂棉球壓迫眼睛止血后，用頸椎脫臼法處死大鼠，即用左手拇指與食指用力向下按住大鼠后頭部，右手抓住大鼠尾巴用力向后上方拉，將脊髓與腦髓拉斷，此時(shí)左手可感覺到頸椎與頭部分離的空虛感，即成功處死大鼠。

（5）指標(biāo)檢測(cè)

取血后，放置采血架上靜置30 min，用離心機(jī)按照每分鐘3000轉(zhuǎn)的速度離心15分鐘，用移液槍吸取上清液滴入1.5 mL的離心管中，裝盒-80℃冰箱保存待測(cè)。血清膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測(cè)采用生化比色法測(cè)定，肝脂酶（HL）采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定[5-6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例（n），百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同灸溫對(duì)高脂血癥大鼠血脂四項(xiàng)的影響

與模型組比較，43℃組及38℃組TC、TG、LDL-C明顯降低，差異具有顯著性意義（P＜0.05）；與38℃組比較，43℃組降低TC、TG、LDL-C明顯，差異有顯著性意義（P＜0.05），說明46℃組降脂療效優(yōu)于38℃組，療效與溫度有關(guān)，適宜的溫度是取效的關(guān)鍵。HDL-C模型組高于正常組，與大鼠自身調(diào)制機(jī)制有關(guān)，兩組溫度對(duì)其影響區(qū)別不大，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 不同灸溫對(duì)高脂血癥大鼠HL活性的影響

與正常組比較，模型組HL活動(dòng)性明顯降低，差異具有顯著性意義（P＜0.05），說明造模成功，與模型組比較，43℃組可明顯提高HL的活性，差異具有非常顯著性意義（P＜0.01），38℃組雖有所提高，但差異無(wú)顯著性意義（P＞0.05）；與38℃組比較，43℃組可明顯提高HL的活性，差異具有非常顯著性意義（P＜0.01），說明HL的活性受溫度的影響，適宜的溫度可提高其活性；

表1 不同灸溫對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響（±s，n=10，mmol/l）

表1 不同灸溫對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響（±s，n=10，mmol/l）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與38℃組比較，▲P＜0.05

組別TCTGLDL-CHDL-C正常組2.10±0.420.65±0.080.64±0.361.16±0.14模型組4.50±0.83*1.43±0.39*2.28±0.36*1.89±0.21*38℃組3.10±0.62△0.72±0.23△1.61±0.35△1.45±0.27△43℃組2.51±0.35△▲0.51±0.09△▲1.20±0.38△▲1.29±0.27△

表2 不同灸溫對(duì)高脂血癥大鼠HL活性的影響（ ±s，n=10，ng/L）

表2 不同灸溫對(duì)高脂血癥大鼠HL活性的影響（ ±s，n=10，ng/L）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.01；與38℃組比較，▲P＜0.01。

組別個(gè)數(shù)LPL正常組10247.95±39.31模型組10202.58±42.55*38℃組10211.48±38.04 43℃組10297.43±62.33△▲

3 討 論

肝脂酶（Hepatic lipase，HL）是一種主要由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的糖蛋白，主要兩種生理功能，一種是具有水解各種脂蛋白中的甘油三酯和磷脂，改變各種脂蛋白顆粒的大小和密度的功能；另一種是作為配體促進(jìn)肝細(xì)胞攝取含載脂蛋白B（apolipoprotein B，apoB）類脂蛋白，影響著血漿中脂蛋白的濃度，在脂蛋白微粒分解和LDL與HDL轉(zhuǎn)換過程中起關(guān)鍵作用。研究表明[7-9]，維持和提高HL活性對(duì)調(diào)節(jié)血脂、防治動(dòng)脈硬化有重要意義，因此，維持和提高HL的活性，已成為治療高脂血癥的主要途徑之一。

本實(shí)驗(yàn)研究表明：不同灸溫對(duì)血脂四項(xiàng)影響不同，43℃組可明顯優(yōu)于38℃組，43℃是TRPV1激活的關(guān)鍵條件，說明TRPV1參與了脂代謝，TRPV1的激活與艾灸調(diào)脂效應(yīng)密切相關(guān)，直接或者間接參與了血脂的代謝。同時(shí)，本研究表明不同溫度對(duì)肝脂酶的活性影響亦不一樣，HL的活性受溫度的影響，適宜的溫度可促進(jìn)其活性，43℃組可明顯提高HL的活性，且優(yōu)于38℃組，說明HL途徑是TRPV1調(diào)節(jié)血脂途徑之一，進(jìn)一步明確了灸法調(diào)脂的生物學(xué)基礎(chǔ)。

[1] 王玲玲.艾灸的特點(diǎn)及溫通效應(yīng)[J].中國(guó)針灸,2011,31(10):865-868.

[2] 張會(huì)芳,王玲玲,張建斌,姜?jiǎng)欧?艾灸溫通調(diào)脂臨床研究[J].世界中醫(yī)藥,2013,8(8):871-879.

[3] 劉 明,董超仁,蘇靜怡.一種簡(jiǎn)便實(shí)用的大鼠高脂血癥模型[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1989,5(2):119.

[4] 倪鴻昌,李 俊,金 涌,等.大鼠實(shí)驗(yàn)性高脂血癥和高脂血癥性脂肪肝模型研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2004,20(6):703-706.

[5] Nozakl S, Kubo M, Matsuzawa Y,et al.Sensitive non-radioisotopic method for measuring lipoprotein lipase and hepatic triglyceride lipase in post-heparin plasma.Clin Chem,1984,30:748-751.

[6] Kobayshi J,Hashimoto H,Fukamachi I, et al.Lipoprotein lipase mass and activity in severe hypertriglycerdemia.Clin Chim Acta,1993,216:113-123.

R245

B

ISSN.2095-6681.2017.28.113.02

常州市衛(wèi)計(jì)委課題（項(xiàng)目編號(hào)：QN201404）。

孫舟紅（1967-），女，漢族，主任醫(yī)師。

李 豆