李倩蕓 李荔清 張維瑞 劉盛榮

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應(yīng)用拮抗試驗(yàn)分析靈芝菌株遺傳多樣性

李倩蕓 李荔清 張維瑞 劉盛榮

（寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100）

收集25株赤芝及5個靈芝屬的非赤芝菌株作為供試菌株，采用拮抗試驗(yàn)分析靈芝（赤芝）菌種的遺傳多樣性。結(jié)果：25株赤芝全隨機(jī)300個配對中291個配對產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，占97.00%。其中151對形成拮抗線，占50.33%；98對形成隆起拮抗反應(yīng)，占32.67%；42對形成溝狀反應(yīng)，占14.00%；有9個配對無拮抗反應(yīng)，占3.00%。另還發(fā)現(xiàn)4株赤芝與其他非赤芝菌株未形成拮抗反應(yīng)。表明我國靈芝（赤芝）菌株具有豐富的遺傳多樣性。

靈芝；拮抗試驗(yàn)；遺傳多樣性；種質(zhì)資源

靈芝（），又稱為赤芝、仙草、瑞芝，是我國一種著名的珍貴中藥材，已有2 000多年的藥用歷史。靈芝含有豐富的生物活性成分，如蛋白質(zhì)、多肽、核苷、多糖、甾醇、氨基酸、三萜等。其中，靈芝多糖和三萜為靈芝主要關(guān)鍵活性成分，具有抗癌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化等作用[1]。常用于治療肝炎、高血壓、糖尿病和胃癌等疾?。唤?jīng)常食用靈芝可延年益壽、增強(qiáng)體質(zhì)。近年來靈芝市場需求不斷增長，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

靈芝在我國主要采用代料和短段木等方式栽培生產(chǎn)，收獲木質(zhì)化子實(shí)體及其彈射的擔(dān)孢子。近年來，由于市場需求增長，栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，隨之而來的靈芝屬命名混亂，同名異種、同種異名現(xiàn)象越來越突出。因此有必要對我國靈芝菌種進(jìn)行遺傳多樣性分析。拮抗試驗(yàn)因具有快速、便捷等優(yōu)點(diǎn)，在真菌分類學(xué)上被廣泛地應(yīng)用[2]。本研究從不同科研單位收集25個赤芝菌株和5個靈芝屬而非赤芝菌株（表1）作為供試對象，采用拮抗試驗(yàn)法，分析靈芝菌株的遺傳多樣性，以期為靈芝育種和栽培提供參考。

表1 供試菌株的一般信息

1 材料與方法

1.1 菌株信息

供試30個菌株的一般信息見表1，其中25株為赤芝，另5株（NA2、NA23、NA29、NA30、NA43）為靈芝屬非赤芝菌株。

1.2 培養(yǎng)基

菌株活化及拮抗實(shí)驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基，其配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，自來水1 000 mL。

1.3 方法

（1）菌株活化。將保藏的供試斜面母種從4 ℃菌種保藏箱取出，1天后于超凈工作臺轉(zhuǎn)管至新鮮PDA斜面，25 ℃活化培養(yǎng)7天。

（2）拮抗配對及培養(yǎng)。超凈工作臺中將熔化的PDA培養(yǎng)基15～20 mL倒至9 cm培養(yǎng)皿，凝固后，將活化的約黃豆粒大小菌種接種至培養(yǎng)基表面近中間位置，同時在相距約1 cm處接種另一菌株。在25 ℃下培養(yǎng)至兩菌落交匯后，觀察菌絲間的拮抗反應(yīng)。

表2 不同菌株拮抗現(xiàn)象數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株拮抗反應(yīng)

圖1為靈芝菌株3種典型的拮抗反應(yīng)圖例，菌落間形成菌絲隆起（a），拮抗線（b），溝狀（c），及少數(shù)配對菌絲間的無拮抗反應(yīng)（d）。無拮抗反應(yīng)的兩菌株可能為同種異名菌株或具有很近的親緣關(guān)系。

注：a 隆起；b線狀；c 溝狀；d無拮抗反應(yīng)。

2.2 菌株不同拮抗反應(yīng)的數(shù)量統(tǒng)計(jì)

供試的30株菌株拮抗反應(yīng)結(jié)果如表2所示。從中可以看出，在25個赤芝菌株隨機(jī)300個配對中，有291個配對產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，占97.00%。其中151對形成拮抗線，占50.33%，98對形成隆起，占32.67%，42對形成溝狀反應(yīng)，占14.00%。9個配對無拮抗反應(yīng)，占3.00%，分別為：①NA8︰NA16；②NA11︰NA21；③NA11︰NA32；④NA16︰NA32；⑤NA21︰NA32；⑥NA32︰NA39；⑦NA35︰NA38；⑧NA39︰NA49；⑨NA44︰NA49?？赡軆烧哂H緣關(guān)系很近或者是同種異名菌株。值得注意的是，菌株NA32與NA11、NA16、NA21和NA39均無拮抗反應(yīng)；菌株NA11與NA21也未產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，NA11、NA21和NA32可能為同種異名菌株。

從表2還可以看出，4個赤芝菌株（NA8、NA13、NA22以及NA37）與非赤芝菌株配對未形成拮抗反應(yīng)，其中包括NA2︰NA22；NA2︰NA37；NA8︰NA43；NA13︰NA30。由此可知，拮抗反應(yīng)不適宜用來分析具有明顯不同遺傳背景菌株的親緣關(guān)系。

3 討 論

高等擔(dān)子菌在雙核菌絲階段發(fā)生的認(rèn)識自我和排斥異己的過程稱為體細(xì)胞的非親和性。遺傳背景明顯不同的個體在交界區(qū)會形成明顯的分界線，即為拮抗反應(yīng)。拮抗試驗(yàn)在輔助鑒定分析親緣關(guān)系中得到普遍應(yīng)用，如秀珍菇[3]、杏鮑菇[4]、真姬菇[5]、香菇[6]等菌種的鑒定及親緣關(guān)系分析。但該方法也存在一定的局限性[7]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及其所顯示出的更高菌株鑒別能力，于是分子標(biāo)記技術(shù)開始與拮抗試驗(yàn)同時用于菌株鑒定及親緣關(guān)系分析等，以提高結(jié)果準(zhǔn)確性。王錦鋒等[8]利用ITS序列分析、RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對靈芝屬菌株進(jìn)行分類，結(jié)果與拮抗實(shí)驗(yàn)一致。唐傳紅等[7]采用RAPD技術(shù)和拮抗試驗(yàn)對靈芝屬菌株進(jìn)行分類，所得結(jié)果一致。

本研究收集的25個赤芝菌株隨機(jī)300個配對中，有291個配對（為97.00%）形成拮抗反應(yīng)，主要形成溝狀、線狀以及隆起3種不同的拮抗現(xiàn)象。從中顯示出我國靈芝（赤芝）菌種具有豐富的遺傳多樣性。Sun等[9]利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)分析靈芝屬菌株的遺傳多樣性；Zheng等[10]采用AFLP分子標(biāo)記及ITS測序分析靈芝屬菌株遺傳多樣性。結(jié)果兩者均顯示赤芝及靈芝屬菌株的遺傳多樣性，與本研究結(jié)果非常相近。此結(jié)果對靈芝育種及栽培具有一定的參考價值。

[1] 劉高強(qiáng), 趙艷, 王曉玲, 等. 靈芝多糖的生物合成和發(fā)酵調(diào)控[J]. 菌物學(xué)報, 2011, 30(2): 198-205.

[2] 唐傳紅, 蘇春麗, 張勁松, 等. 靈芝屬分類學(xué)研究進(jìn)展[J]. 食用菌學(xué)報, 2007, 14(3): 86-90.

[3] 李維煥, 蔡德華, 鄭芳, 等. 秀珍菇菌株的親緣關(guān)系分析[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(17): 267-271.

[4] 劉盛榮, 張維瑞, 柯斌榕, 等. 基于拮抗試驗(yàn)的杏鮑菇菌株分類研究[J]. 食藥用菌, 2015, 23(1): 33-36.

[5] 劉蕾, 寧麗, 郭立忠, 等. 12個真姬菇菌株拮抗試驗(yàn)及部分同工酶分析[J]. 食用菌, 2008, 26(1): 12-14.

[6] 賈定洪, 王波, 鄭林用, 等. 應(yīng)用拮抗及ISSR方法鑒定袋料香菇菌株[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2013, 26(2): 832-834.

[7] 唐傳紅, 張勁松, 陳明杰, 等. 利用拮抗實(shí)驗(yàn)和RAPD對靈芝屬菌株進(jìn)行分類研究[J]. 微生物學(xué)通報, 2005, 32(5): 72-76.

[8] 王錦鋒, 李晶, I. L. Datti, 等. 利用拮抗、ITS和RAPD技術(shù)對靈芝屬菌株分類的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2017, 30(1): 26-33.

[9] Sun SJ, Gao W, Lin SQ, et al. Analysis of genetic diversity inpopulation with a novel molecular marker SRAP[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72: 537-543.

[10] Zheng LY, Jia DH, Fei XF, et al. An assessment of the genetic diversity withinstrains with AFLP and ITS PCR-RFLP[J]. Microbiological Research, 2009, 164: 312-321.

Analysis of the genetic diversity ofstrains based on antagonism

Li Qianyun Li Liqing Zhang Weirui Liu Shengrong

（College of Life Science, Ningde Normal University, Ningde Fujian 352100）

A total of 30strains (25 strains belonging to.) were used for antagonism test to analyze the genetic diversity ofstrains in China. The results demonstrated that, out of 300 pairings among 25.strains, 291 formed antagonism reaction with the ratio of 97.00% (151 pairings produced line at 50.33% ratio, 98 pairings were bulge at 32.67%, 42 pairings were barrage at the ratio of 14.00%). The remaining 9 pairings at 3.00% did not show antagonism. In addition, no antagonism was observed for 4 pairing between.strains and otherstrains. These findings proved that there is an abundant genetic diversity within.strains in China.

; antagonism; genetic diversity; germplasm

S567.3+1

A

2095-0934（2017）06-363-03

福建省教育廳項(xiàng)目（編號JA15563）；寧德師范學(xué)院服務(wù)海西項(xiàng)目（編號2013F22）

通訊作者：劉盛榮，男，副教授，主要從事食用菌育種及藥用菌發(fā)酵研究，E-mail：fjhost@163.com